（海洋生物学专业论文）鱼类卵黄蛋白原的免疫功能研究.pdf

中国海洋大学博士学位论文 鱼类卵黄蛋白原的免疫功能研究 摘要 卵黄蛋白原 v i t e l l o g e n i n v g 是卵生脊椎动物和非脊椎动物卵黄蛋白的前 体 它是受雌性激素调控的一种大分子的糖磷脂蛋白 v g 为人们所熟知的主要 功能是为胚胎和幼体生长发育提供主要的营养物质 然而 新近一些研究表明 v g 参与多个生理过程 具有多种功能 例如 z h a n g 等人 2 0 0 5 和s h i 等人 2 0 0 6 分别证明玫瑰无须鱼巴和文昌鱼v g 具有抗菌和凝血功能 说明其参与免 疫反应 然而 关于v g 参与免疫作用的机理完全不了解 本论文主要研究了 v g 的免疫作用机理 本论文第一部分首先从六线鱼 h e x a g r a m m o so t a k i i 中纯化得到了v g 并对 其进行了鉴定 通过d e a e 2 3 离子交换柱层析和s e p h a d e xg 2 0 0 凝胶过滤柱层 析首次从经1 7p 一雌二醇 e 2 诱导的六线鱼体内纯化得到了v g 并通过二级质 谱对其进行了鉴定 n a t i v e p a g e 显示v g 分子量约为4 5 0k d a s d s p a g e 显示 v g 单体分子量为1 6 0k d a 左右 推测v g 为同源三聚体 n a t i v e p a g e 后的凝胶 经特异性染色证明六线鱼v 夸也是一种富含糖 脂 磷的蛋白 本论文第二部分通过实验证明了v g 是一种典型的模式识别受体 并且具有 调理素功能 能够促进巨噬细胞的噬菌作用 将异硫氰酸荧光素 f i t c 标记 的v g 与各种菌孵育后荧光显微镜观察发现v g 可以分别与ec o l i a u r e u s 和 p p a s t o r i s 结合 另外通过酶联免疫吸附实验 e l i s a 证明v g 可以与病原相关 分子模式 p a m p s 脂多糖 l p s 脂磷壁酸 l t a 肽聚糖 p g n 1 3 1 3 葡聚糖 p l 3 g h l c a n 和海带多糖 1 a m i n a r i n 等发生特异性结合 并且结合 呈现浓度依赖性 上述结果表明v g 是一种多价的模式识别受体 我们还研究了 v g 对巨噬细胞噬菌作用的影响 实验表明v g 可以明显促进巨噬细胞对细菌的 吞噬 硬骨鱼的头肾在功能和结构上被认为与哺乳动物的骨髓相当 其含有大量 的巨噬细胞 我们利用p e r c o l l 密度梯度离心法分离得到六线鱼头肾巨噬细胞 通过吞噬实验统计两个参数 吞噬能力 p a 和吞噬指数 p i 评价巨噬细胞 的噬菌水平 结果发现 与对照相比 经v g 处理的实验组的p a 和p i 都有显著 性高 o 0 5 说明v g 能够促进巨噬细胞的噬菌作用 另外还发现f i t c 标记 的v g 可以与巨噬细胞表面特异性结合 上述结果表面v g 可能具有类似调理素 中国海洋大学博士学位论文 的功能 本论文第三部分主要对v g 的杀菌机制和v g 发挥杀菌作用的活性部位进行 了研究 实验表明v g 是通过分别与革兰氏阴性菌细胞壁上的l p s 和革兰氏阳性 菌细胞壁上的l t a 结合来发挥对ec o l i 和 a u r e u s 的杀菌功能 并且发现v g 分子肽链的完整性以及糖基化对于v g 发挥杀菌作用是必需的 抗菌蛋白的抗菌 机制有多种 大多数蛋白是通过与细菌细胞膜作用 而也有一些蛋白是通过与细 菌细胞壁上的特定成分结合直接破坏细胞壁引起细菌溶胀破裂 为阐明v g 的杀 菌机制 首先我们通过扫描电镜技术和细菌 原生质体裂解实验发现v g 能够引起 ec o l i 和 a u r e u s 的裂解 但不能引起无细胞壁的原生质体的裂解 说明v g 通过破坏细菌细胞壁来发挥对ec o l i 和sa u r e u s 的杀菌作用 而并非以细胞 膜为靶部位 其次通过抑菌圈实验发现l p s 和l t a 可以分别抑制v g 对ec o l i 和 a u r e u s 的杀菌作用 这与l p s 和l t a 能与v g 结合结果相一致 因此上述 结果可以说明v g 是通过与细菌细胞壁上的l p s 或l t a 结合来发挥杀菌作用的 另外本部分对v g 发挥杀菌作用的活性部位进行了研究 蛋白质的翻译后加 工和修饰对其功能作用至关重要 为鉴定v g 分子发挥杀菌作用的活性部位 我 们首先对v g 分别进行了肽链破坏 氧化糖基 去磷酸化以及去脂等处理 将上 述处理的v g 分别进行抑菌圈实验 结果显示v g 脱脂和去磷酸化对其抑菌作用 没有影响 而降解其肽链和氧化糖基却使v g 抑菌活性丧失 这说明v g 分子的 糖蛋白部分在抑茵作用中发挥重要作用 另外发现v g 对ec o l i 的抑菌作用可以 被d 一甘露糖抑制 对 a u r e u s 的抑菌作用可以被n 乙酰 d 氨基葡萄糖和d 海藻糖抑制 说明v g 可能具有类凝集素的活性 总之 本论文通过体外实验首次发现六线鱼v g 可以作为一种模式识别受体 与多种p a m p s 结合 首次报道了v g 具有调理素活性 可以促进巨噬细胞的噬 菌作用 首次阐明了v g 是通过与细菌细胞壁上的l p s 或l t a 结合来发挥杀菌 作用的 首次阐明了v g 分子肽链的完整性和糖基化与其杀菌活性的密切关系 关键词 六线鱼 卵黄蛋白原 模式识别受体 巨噬细胞 吞噬 机制 i l 中国海洋大学博士学位论文 i m m u n er o l e so ff i s hv i t e l l o g e n i n a b s t r a c t v i t e l l o g e n i n 曲i st h ee g gy o l kp r o t e i np r e c u r s o ri nn o n m a m m a l i a nv e r t e b r a t e s a n di n v e r t e b r a t e s i ti sah i 曲m o l e c u l a rm a s sp h o s p h o l i p o g l y c o p r o t e i nr e s p o n s et o e s t r o g e ns t i m u l a t i o n v gi sk n o w n 弱i t sn u t r i t i o n a lr o l et op r o v i d ed e v e l o p i n g e m b r y o sa n dl a r v a en u t r i e n t s m a n yr e p o r t sp r o v e dt h a tv gh a se v o l v e dp l e i o t r o p i c f u n c t i o n si nm a n yp h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e s v gh a sr e c e n t l 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l f o x i d e 二甲基亚砜 e d t a e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 e l i s a e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y 酶联免疫吸附 e 2 17 1 b e s t r a d i 0 1 17 1 3 雌二醇 e c o l i e s c h e r i c h i ac o l 0 大肠杆菌 f i t c f l u o r e s c e i ni s o t h i o e y a n a t e 异硫氰酸荧光素 f c s f o e t a lc a l fs e r u m 肽牛血清 h h o u r 小时 k d a k i l o d a l t o n 千道尔顿 l p s 1 i p o p o l y s s a c c h a r i d e s 脂多糖 l t a 1 i p o t e i c h o i ca c i d 脂磷壁酸 m i c m i n i m a li n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n 最小抑制浓度 o p d o p h e n y l e n e d i a m i n e 邻苯二胺 p a g e p o l y a e r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 p b s p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e 磷酸盐缓冲溶液 p m s f p h e n y lm e t h y ls u l f o n y lf l u o r i d e 苯甲基磺酰氟 p v p h o s v i f i n 卵黄高磷蛋白 p g n p e p t i d o g l y e a n 肽聚糖 p a m p s p a t h o g e n a s s o c i a t e dm o l e c u l a rp a t t e m s 病原相关分子模式 pp a s t o r p i c h i ap a s t o r 西 毕赤酵母 p a p h a g o c y t i ca b i l i t y 吞噬能力 p i p h a g o c y t i ci n d e x 吞噬指数 s d s s o d i u md o d e c y ls u l p h a t e 十二烷基硫酸钠 s s a s u l f o s a l i c y l i ca c i d 磺基水杨酸 v i i 中国海洋大学博士学位论文 a u r e u s s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s s p s s e r u mp r o t e i n s s r s s c a v e n g e rr e c e p t o r s ir i s t r i s h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e t m p s t o t a lm u s c l ep r o t e i n s v g v i t e l l o g e n i n v g r v i t e l l o g e n i nr e c e p t o r v v o l t a g e v 1 1 1 金黄色葡萄球菌 血清总蛋白 清除受体 三 羟甲基 氨基甲烷 肌肉细胞总蛋白 卵黄蛋白原 卵黄蛋白原受体 电压 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果 据我所知 除了文中特别加咀标注和致谢的地方外 论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果 也不包含未获得f 挂 塑塑直基地盖垩 壁型直盟鲍 奎壁亘窒2 或其他教育机构的学位或正书使用过的材料 与我一同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明菇表示谢意 兰竺兰兰竺兰兰兰名虿睦查 竺兰 翌 兰翌 兰星 乞 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留 使用学位论文的规定 有权保留并向国家 有关部门或机构 如中国科学技术信息研究所等 送交论文的复印件和磁盘 允许论文 被查阅和借阅 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位论文 保密的学位论文在 解密后适用本授权书 学位论文作者签磅珐 签字8 物 夕年妇夕8 学位论文作者毕业后去向 工作单位 通讯地址 聊辩 谁 签字日期弘 年 月7 日 电话 邮编 鱼类卵黄蛋白原的免疫功能研究 第一章文献综述 1 多l j 黄蛋白原的研究进展 卵黄蛋白原 v i t e l l o g e n i n v g 是特异存在于卵生非哺乳类性成熟动物血 液中的一种蛋白 是几乎所有卵生动物中卵黄蛋白 y o l kp r o t e i n 的前体 u t a r a b h a n d 等 1 9 9 6 最初是p a n 等人 1 9 6 9 对雌性昆虫血液淋巴蛋白的 特指称呼 后来广泛地把这种在卵生动物的卵黄形成过程中 雌性个体血浆中大 量存在的含磷 糖 脂的大分子蛋白描述为v g v g 为正在发育的动物胚胎提供氨基酸 脂肪 碳水化合物 维生素 磷 硫及微量元素等营养和功能性物质 随着研究的深入 人们逐渐发现 v g 在生 物体内还参与多个生理过程 具有多种生物学功能 另外 v g 还被认为是一种 理想的雌激素和类雌激素标志物 近年来被广泛应用于环境内分泌干扰物的筛选 及环境毒理 污染调查等研究中 周庆祥等 2 0 0 3 1 1 卵黄蛋白原的发现 在卵生动物中 卵黄生成与雌性动物血浆蛋白的许多变化相关 这些变化受 激素控制 并且无论雌性还是雄性甚至去势的未成熟动物 在外源雌激素作用下 均能诱导产生 在近一个世纪以前 u h l e r t h u t h 和k o d a m a l u h l e n h u t h 等 1 9 1 4 发现了一种在性成熟的雌性鲤鱼血浆中特异存在的血清蛋白 并命名为 o v u m i n l a s k o w s k i 1 9 3 6 r o e p k e 和h u g h e s 1 9 3 5 后来发现在产卵期禽的血清中 含有一种磷蛋白 而且这种蛋白在非产卵期禽和雄鸟以及哺乳动物血清中并不存 在 命名其为 v i t e l l i n 在早期鱼类研究中 注射雌激素可以导致血清总蛋白 和与蛋自结合的磷含量的升高 而且会诱导血浆中卵黄蛋白的重新产生 b a i l e y 1 9 5 7 h o 等 1 9 6 1 u r i s t 等 1 9 6 1 u t t e r 等 1 9 6 7 在卵黄发生期的雌鱼 或经雌激素处理的鱼类血浆中发现的特异蛋白最初被不同的命名 如s e r u m v i t e l l i n v a n s t o n e 等 19 61 s m a n t i g e n k r a u e l 等 19 6 3 h m f a c t o r u t t e r 等 1 9 6 7 s e r u ml i p o v i t e l l i n a m i r a n t e 1 9 7 2 以及f e m a l e s p e c i f i cp l a s m a p r o t e i n f s p p a i d a 等 1 9 7 3 等 鱼类卵黄蛋白原的免疫功能研究 p a n 等 1 9 6 9 第一次使用 v i t e l l o g e n i n 这个术语来描述一种昆虫 c e c r o p i a 血淋巴中的一种雌性特异性蛋白质 后来这个命名便逐渐为人们所 接受用以描述上述脊椎动物血清蛋白 在硬骨鱼研究中 h a r a 和h i r a i 1 9 7 6 在大马哈鱼 o n c o r h y n c h u sk e t a 和虹鳟鱼 dm y k i s s 血浆中发现了一种结合 铁的雌性特异性血清蛋白 f e m a l e s p e c i f i cs e r u mp r o t e i n f s s p e m m e r s e n 和 p e t e r s e n 1 9 7 6 在卵黄生成期的比目鱼 p l a t i c h t y s f i e s u s 血清中发现了一种类 似的雌性特异性脂磷蛋白 并且将其部分纯化 后来从虹鳟鱼中纯化了这种雌性 特异性血清蛋白 并且在硬骨鱼中第一次从免疫学上鉴定为v g h a r a 等 1 9 7 8 v g 由此定义为一种由动物卵巢外器官或组织产生的蛋白 是卵黄蛋白的前体蛋 白 迄今为止 v g 可由多种不同的生物化学和免疫学方法纯化和鉴定 w a l l a c e 1 9 8 5 m o m m s e n 等 1 9 8 8 s p e c k e r 等 1 9 9 4 1 2 卵黄蛋白原的结构特性 v g 是一种高分子量的含糖 含磷 含脂的蛋白 与脊椎动物载脂蛋白b a p o l i p o p r o t e i nb 及微粒体甘油三酯转运蛋白 m i c r o s o m a lt r i g l y c c r i d et r a n s f e r p r o t e i n 同属于古老的脂转运蛋白超家族 b a b i n 1 9 9 2 a v a r r e 等 2 0 0 7 v g 在不同种类的动物 如昆虫 甲壳类 鱼类 两栖类 爬行类和鸟类中 从无 脊椎动物到脊椎动物 在结构和功能上有一定的相似性 但也有许多不同点 无 脊椎动物的v g 大多是由分子量不同的多个亚基组成 而脊椎动物特别是鱼类的 v g 通常是由两个1 5 0 一 2 2 0k d a 的同源二聚体组成 而介于无脊椎动物和脊椎 动物之间的文昌鱼的v g 是由两个1 6 0k d a 的同源二聚体组成 张士璀等 2 0 0 2 v g 并非一种单一形式的蛋白 而是由若干基因编码的蛋白组成的一个家 族 a v a r r e 等 2 0 0 7 这种v g 基因及蛋白的多重性主要是因为在辐鳍亚纲 进化过程中的基因组复制以及很多硬骨鱼类后来附加的基因组复制造成的 由于 v g 结构和功能的多样性 目前对其命名和分类较为混乱 h i r a m a t s u 等提出一 种分类模型 具有完整的v g 结构n h 2 l v h p v l v l b c o m p o n e n t c t e r m i n a l c o d i n gs e q u e n c e c o o h 的被分为v g a 和v g b 两类 底鳓v g i 条形星蝶v g a 黑线鳕v g a 幂n 青鲻v g l 等都属于v g a 类 它的l v h 在卵母细胞成熟过程中 几乎被完全降解 底鲻v g l i 条形星蝶v g b 黑线鳕v g b 和青鳝v 醇等都 2 鱼类卵黄蛋白原的免疫功能研究 属于v g b 类 它的l v h 在卵母细胞成熟过程中不被降解 或者被部分水解 还有一类v g 缺少p h o s v i t i n 结构域 或者仅具有一个高度缩短的p h o s v i f i n 结 构域 这类v g 被分类为v g c 斑马鱼v 够 昆虫v g 以及鸡v g i i i 属于此类 v g c 的磷酸和丝氨酸残基含量低 分子量比v g a 和v g b 都要低 h i r a m a t s u 等 2 0 0 5 一些鸟类 两栖类 爬行类和鱼类等脊椎动物的v g 氨基酸全序列或者部分