（植物学专业论文）绿豆、小麦钙调蛋白基因的克隆及分析.pdf

绿豆 小麦钙调蛋白基因的克隆及分析 摘要 钙调蛋白 c a l m o d u l i n 是生物体中广泛存在的一类结构保守的调节 蛋白 钙调蛋白通过和c a 结合 并与靶酶相互作用 调控细胞的发育和对外界刺 激的反应 它参与多种生理过程 如基因表达 调节细胞分裂和代谢 生殖发育 和细胞膜通道调控等功能 现已从多种植物 如拟南芥 大麦 水稻 辣椒 甜 菜 丹参和豇豆中成功克隆了钙调蛋白基因 绿豆是一年生豆科草本植物 它既是一种粮食作物 也是药用植物 以种子 和种皮 绿豆衣 入药 具清热祛暑 解毒之功效 小麦是世界上重要的粮食作 物之一 在谷类作物中其产量占到1 7 是世界3 5 人口的主要食品作物 因此 本研究选择这两种重要的粮食作物作为实验材料具有一定实际价值 绿豆 p h a s e m u s1 8 d i a t u sl 钙调蛋白基因未见报道 从小麦中已克隆出 钙调蛋白基因 本研究首次从绿豆 p h a s e o l u sr a d j a t u sl 中克隆了钙调蛋白 基因 并且克隆了小麦 t r i t i c u ma e s t j v u ml 钙调蛋白基因 对基因结构进 行了分析 分别从小麦 绿豆叶片中提取总r n a 逆转录为e d n a 通过p c r 扩增 得到钙调蛋白基因 绿豆和小麦钙调蛋白c d n a 全长均为4 4 7 b p 包含了完整的读 码框 编码1 4 8 个氨基酸 通过把小麦和绿豆钙调蛋白基因序列 推导的蛋白质 序列进行相似性分析 发现小麦钙调蛋白基因和绿豆钙调蛋白基因核苷酸的相似 性为8 4 6 氨基酸的相似性为9 5 6 本文得到的小麦钙调蛋白基因与已知的小 麦钙调蛋白基因相比 相似性高达8 5 以上 与已知的其它多种植物钙调蛋自基因 相比也有很高的相似性 核苷酸序列相似性在8 0 以上 编码的氨基酸序列相似性 在9 0 以上 在g e n e b a n k 进行了注册 绿豆钙调蛋白基因注册号为d q 7 7 8 0 7 0 小 麦钙调蛋白基因注册号为e f 5 7 7 2 7 0 将绿豆 小麦钙调蛋白基因分别正向 反向插入p c a m b i a l 3 0 4 表达载体 经 p c r 和酶切验证 绿豆 小麦钙调蛋白基因确已插入植物表达载体 再将植物反义 表达载体分别通过农杆菌介导法转入丹参植物体内 分析钙调蛋臼对植物的生长 发育的作用 这为进一步研究钙调蛋白的功能奠定了基础 用t 砌v l m p r o t s c a e s o p m a p f a m 等在线生物信息学软件分析了绿豆钙调蛋 白和小麦钙调蛋白的亲 疏水性 跨膜结构域 卷曲螺旋结构及功能域 并对它进 行了亚细胞定位和二级结构预测 结果表明绿豆钙调蛋白和小麦钙调蛋白亲水性 大于疏水性 是亲水性蛋白质 并且它们不具有信号肽 位于细胞质中 在细胞 质中合成并以可溶性状态保留在细胞质中 二级结构主要为n 一螺旋 含有四个功 能域 e f h a n d 可以和钙离子结合激活下游反应 起到信号传导的功能 热激蛋白 h e a ts h o c kp r o t e i n h s p 是一类受到高温或其它一系列逆境诱导 的蛋白质 细胞中主要的热激蛋白包括h s p 6 0 h s p 7 0 h s p g o 和低分子量h s p 的家 族 热激蛋白能消除热胁迫的影响 有效地保护细胞和生物体 在高温条件下 许 多生物体 包括植物 中 都能够产生热激蛋白 本研究同时从油菜 b r a s m c a c a m p e s t r i sl 中克隆了热激蛋白基因片断 对基因序列进行了分析 通过p c r 扩增得到了8 3 4b p 的片断 编码2 7 8 个氨基酸 通过在n c b i 上进行比对 发现它和 拟南芥热激蛋白基因有很高的同源性 核苷酸的同源性在8 8 1 氨基酸的同源性 在9 0 以上 利用d n a s t a r 和o n n a n 等在线生物软件分析了油菜熟激蛋白的核苷酸 序列 推导的蛋白质序列 开放读码框的亲水性 疏水性 卷曲螺旋结构 并对蛋 白质二级结构进行了预测 关键词 绿豆 小麦 油菜 钙调蛋白基因 热激蛋白基因 n c l o n i n ga n da n a l y s i so fc a l m o d u l i n g e n ef r o mp h a s e o l u sr a d i a t u sl a n dt r i t i c u ma e s t i v u ml y a n gj i n g a b s t r a c t c a l m o d n l i n c a m i sa l li m p o r t a n tr e g u l a t i v ep r o t e i nt h a te x i s t si ns i g u a t t r a n s f e r r i n ga n dh i 曲l yc o l l s c c si ne u k a r y o t e s c a mi sc o m b i n e dw i t hc a 2 a n dt a k e s p a r ti nm o d u l a t i n gt a r g e te n z y m e s s ot h a ti t c a nm o d u l a t et h ec e l l sg r o w t ha n dt a k e a c t i o nt oi r r i t a t i o no u t s i d et h ec e l l c a l m o d u l i nj o i n si nm a n ya s p e c t s g e n ee x p r e s s i o n c e l ld i v i s i o na n dm e t a b o l i s m c e l lm e m b r a n et r a n s p o r t a t i o na n dr e p r o d u c t i v e d e v e l o p m e n te t c b yf a r l o t so fc a l m o d u l i ng e n e sh a v e b e e nc l o n e df r o mm a n ys p e c i e s a r a b i d o p s i st h a l i a n a b a r e l y d e e h o tp e p p e r b e e t s a l v i am i l t i o r r h i z aa n dc o w p e ae t c p h a s e o l u sr a d i a t u l i sa na n n u a l h e r b a c e o u sp l a n ta sb o t hg r a i nc r o p sa n d o f f c i n a l s i t ss e e d sa n ds e e dc a p s u l e st a k ei m p o r t a n te f f e c t si nc l e a r i n gs u m m e r h e a ta n d d e t o x i f c a t i n g t r i t i c u ma e s t i v u mli so n eo fi m p o r t a n tg r a i nc r o p si nt h ew o r l d i t a c c o u n t sf o r1 7 o ft h es i z eo fw h i t ec r o p s w h i c hi st h em a i nf o o do f3 5 o f p o p u l a t i o no ft h ew o r l d i nt h i sp a p e r c a l m o d u l i ng e n e sf r o mp h a s e o l u sr a d i a t u sl a n dt r i t i c u ma e s t i v u m lh a v eb e e nc l o n e d a n dt h es t r u c t u r eo fc a l m o d u l i ng e n eh a v eb e e na n a l y z e d t o t a l r n aw a si s o l a t e df r o ml e a v e so fw h e a ta n dm u n gb e a na n dl c v e r s et r a n s c r i p t e dt o c d n a b yp c r t h ec a l m o d u l i ng e n ef r o mt r i t i c u ma e s t i v u ml a n dp h a s e o l u sr a d i a t u s l w a sc l o n e d t h ec a l m o d u i i nc d n af r o mp h a s e o l u sr a d i a t u sl a n dt r i t i c u m a e s t i v u mlh a s4 4 7 b p i n c l u d i n gaf u l lo p e nr e a d i n gf r a m e o r f a n dc o d i n g1 4 8 a m i n oa c i d s b yc o m p a r i n gw i t ht w oc a l m o d u l i ng e n e s w ef i n dt h a tt h es i m i l a r i t yo f n u c l c o t i d ei s8 4 6 a n dt h es i m i l a r i t yo fa m i n oa c i di s9 5 6 t h e r ea r eh i g l l s i m i l a r i t i e si nc a i m o d u l i ng e n e sa m o n gm a n yo t h e rd i f f e r e n tp l a n t s t h es i m i l a r i t yo f n u c l e o t i d ei so v e r8 0 a n dt h es i m i l a r i t yo fa n l i n oa c i di so v e r9 0 t h ec a l m o d u l i n g e n eo f p h a s e o l u sr a d i a t u al w a sr e g i s t e r e di ng e n e b a n k d 0 7 7 8 0 7 0 t h a to f t r i t i c u m a e s t i v u mlw a sr e g i s t e r e da se f 5 7 7 2 7 0 t h ec a l m o d u l i ng e n ew a si n s e r t e d i n t op c a m b i a l 3 0 4p l a n te x p r e s s i o nv e c t o r p o s i t i v e l ya n dr e v e r s e l y b yp c ra n de n z y m ec u t t i n g t h ec a l m o d u l i ng e n ef r o m h 1 p h a s e o l u sr a d i a t u sl h a db e e ni n s e r t e di n t ot h ep l a n te x p r e s s i o nv e c t o r s t h ea n t i s e n s e h a db e e nt r a n s f e r r e di n t os a l v i am i l t i o r r h i z a b u n g e t h i sw i l lg r e a t l yh e l p u st o u n d e r s t a n dt h ec a l m o d u l i ni n f l u e n c ei np l a n t s u s i n gb i o i n f o r m a t i c ss o f t w a r e ss u c ha st m h m m p r o t s c a l e s o p m aa n dp f a m w ea n a l y z e dh y d r o p h i l i c i t ya n dh y d r o p h o b i c i t y t r a n s m e m b r a n es t r u c t u r e c u r l h e l i x s t r u c t u r e f u n c t i o nr e g i o no fc a i m o d u l i nf r o mp h a s e o l u sr a d i a t u sl i d e n t i f i e dt h e s u b c e l lp o s i t i o na n dp r e d i c t e ds e c o n d a r ys t r u c t u r e t h ec a l m o d u l i nf r o mp h a s e o l u s r a d i a t u sl i sah y d r o p h i l i c i t yp r o t e i n a n dh a sn os i g n a lp e p t i d e i te x i s t s i sp m d u c 默l a n ds 诅y si nt h ec y t o p l a s m t h es e c o n d a r ys t r u c t u r ei sm a i n l y a h e l i x i n c l u d i n gf o u r e f h a n d st h a tc a nc o m b i n ew i t hc a 2 t ot r a n s f e rs i g n a l s h e a ts h o c kp r o t e i ni sak i n do f p r o t e i n t h a t e x p r e s s e s h i g h l y u n d e rh i g h t e m p e r a t u r e so ro t h e re n v i r o n m e n ti r r i t a t i o n s t h e r ea r es o m em a i nh s p se x i s t i n gi n c e l l ss u c ha sh s p 6 0 h s p 7 0 h s p 9 0a n ds h s p s h s p s 啪e l i m i n a t et h ee f f e c to fh e a t s h o c kt op r o t e c tc e l l sa n do r g a n i s m s m a n yo r g a n i s m si n c l u d i n g a n t sc a r lp r o d u c e h s p sa th i g ht e m p e r a t u r e s t h i sa r t i c l ec l o n e dh e a ts h o c kp r o t e i ns e q u e n c ef r o m b r a s s i c ac a m p e s t r i sla n da n a l y z e dt h eg e n es e q u e n c e b yp c r w eo b t a i n e dt h e f r a g m e n to f8 3 4 h p c o d i n g2 7 8a m i n oa c i d s b yc o m p a r i n gi nn c b i ah i g hs i m i l a r i t y o fh e a ts h o c kp r o t e i ne d n ai sf o u n db e t w e e nb r a s s i c ac a m p e s t r i sla n da r a b i d o p s i s t h es i m i l a r i t yo fn u c l c o t i d ei s8 8 1 a n dt h es i m i l a r i t yo fa m i n oa c i di so v e r9 0 u s i n gd n a s t a ra n dd n a m a nb i o i n f o r m a t i c ss o f t w a r e s w ea n a l y z e dn u c l c o t i d e s e q u e n c e a m i n oa c i ds e q u e n c e h y d r o p h i l i c i f ya n dh y d r o p h o b i c i t yo fa no r fa n d c u r l h e l i xs t r u c t u r e a tl a s t s e c o n d a r ys t r u c t u r eo fh e a ts h o c kp r o t e i nw a sp r e d i c t e d k e y w o r d s p h a s e o l u sr a d i a t u sl t r i t i c u ma e s t i v u ml b r a s s i c ac a m p e s t r i sl c a l m o d u l i n h e a ts h o c kp r o t e i n i 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的 研究成果 尽我所知 除文中已经注明引用的内容外 论文中不包含其他个人 已经发表或撰写过的研究成果 也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体 均 已在文中作了明确说明并表示谢意 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r o t e i n k i n a s e c d p k 及无e f 手型c a 2 结合域的钙结合蛋自 时 现分述如下 1 钙调素 c a l m o d u l i n c a m 及其同工型 是狭义的钙调蛋白 作为c f 的受体 在c a 2 信号转导系统中起重要作用 它通过结合c 矿激活一系列的靶酶 从而调控基因表达及生理代谢 c a m 的氨基酸序列在动 植物中都具有高度的保守 性 在细胞中c a m 都具有4 个典型的e f h a n d 结构 2 钙调蛋白相似蛋白和其它具有e f 手型c a 2 结合域的钙结合蛋白 c a l c i n e u r i nb l i k ep r o t e i n c b l 这是一类新的c a 2 结合蛋白 这类蛋白 既和调控亚基b 相似 又具有动物神经元中c 矿结合蛋白的特征 因此称植物中的 这类c 矿结合蛋白为c a 结合域的钙结合蛋白 这是植物中特有的一类钙离子受体 它都具有3 个e f h a n d 结构叫 3 钙依赖型蛋白激酶 c a l c i u m d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e c d p k 及无 e f 手型c 矿结合域的钙结合蛋白 这是一类典型的c a 2 依赖的蛋白激酶 它包括像 钙调素一样的钙离子结合区和激酶区域 从而可以直接作为效应器发挥作用 它 不像c a m 和c b l 只能作为钙离子的受体 这类蛋白分子中具有 个激酶位点和4 个 e f h a n d c d p k 在豌豆中首次报道 它在藻类 植物和一些原生动物中都有存在 但在动物 细菌和酵母中还未见报道 这三类钙离子结合蛋白在来源上c a m 和c d p k 关系更为紧密 同源性更高 从 而就可能推测c d p k 来源于蛋白激酶和c a m 的融合 而从功能上看 c a m 和c b l 功能较 相似 都是作为钙离子结合的受体 c d p k 还可具有激酶活性发挥作用 在植物细 胞中 这三类钙离子结合蛋白有可能同时存在 根据钙离子结合蛋白的种类不同 蛋白所含的e f h a n d 的数目不同 和钙离 子的结合能力就存在差异 因此它们在钙一钙离子结合蛋白信号转导途径中的功能 也存在差异 1 1 2 钙一钙离子结合蛋白信号传导系统及其功能 1 1 2 1 钙作为植物信号转导中第二信使的作用 钙离子作为植物信号转导系统中的第二信使 当细胞受到外界刺激 冷 早 光等 时 c a 2 通过质外体或胞内钙库向胞液输送 细胞内c a 2 浓度升高 使c a 2 调 节的靶酶激活 如c d p k 蛋白磷酸酶等的激活 从而通过c a 2 浓度的变化将胞外信 号转化细胞内的生理生化反应 c a m 作为细胞内c a 2 的受体蛋白 可以和多种激酶结合 传导信号 信号被逐 级放大 从而启动了钙一钙离子结合蛋白信号系统 钙依赖型蛋白激酶 c d p k 是 该系统主要的蛋白激酶 它们很可能是c a 2 的生物传感器 植物和原生质中都有分 离到 有报道表明 在拟南芥中已分离到了超过1 2 种c d p k 的亚家族 通过大量实验已经证明 钙离子在植物各种生理活动中有着广泛的作用 在 细胞生长 分裂 分化 衰老等活动中起着重要的调节作用 钙调蛋白c a k l 是功能 最广泛 分布最广的高度保守的蛋白 能和其它靶蛋白分子结合调节细胞的生命 活动 从而形成了钙一钙离子结合蛋白信号系统 1 1 2 2 钙 钙调蛋白信号系统的主要作用方式 目前 在动物细胞中发现了三种钙一钙调蛋白信号系统的作用方式 解除自 动抑制作用 激活位点变形作用和c a g 诱导的二聚体作用 当然 这些作用方式也 给植物中钙调蛋白作用方式提供了证据 1 解除自动抑制作用 钙调蛋白c a m 结合位点邻近或在酶的自动抑制区内 当c a 2 和c a m 结合后 c a m 和靶酶结合 从而改变靶酶的结构 解除靶酶的自动抑制 作用 启动全酶活性 诱发一系列下游反应 2 激活位点变形作用 这是细胞中激活方式的第二种 在研究炭疽病腺嘌呤 2 环化酶 浮肿因子 时 得腺嘌呤环化酶表面四个相互分离的区域 该区域能识 别并和c a m 结合 当c a 和c a m 结合后 腺嘌呤环化酶结构重排 和c a m 结合 产生 激活位点 引发全酶活性 3 c a m 诱导的二聚体作用 该方式是通过两个c a m 分子紧密结合形成二聚体 中间结合k 通道区域的c a 激活通道 它依赖于和c a 2 的结合 在未激活状态下 两 个c a m 分子紧密结合形成二聚体和k 通道相互结合 k 通道闭合 当c a 和c a m 结合 后 二聚体结构改变 k 通道打开 c 矿通道被激活 启动酶活性 1 1 2 3 钙调蛋白的表达特点 生物体内的钙调蛋白结构多样 有多种基因对其编码 因此在植物的各个发 育时期 各个器官中 钙调蛋白的表达无论在数量上还是在功能上都存在显著的 差异 1 9 9 6 年a f r a i c h a r d 等人对玉米根部进行了亚细胞定位 研究了钙调蛋白的 分布及表达情况 为了对玉米根部进行亚细胞定位 分离了玉米根部细胞膜 通 过免疫杂交实验 用脊椎动物的c a g 作为探针对玉米根部的c a m 进行亚细胞定位 发现c a m 主要和高密度蔗糖结合 并位于原生质膜和周质微管上 随后又通过 n o r t h e r n 杂交 研究钙调蛋白的表达情况后 得出钙调蛋白稳定的分布在原生质 膜上 这表明钙调蛋白信号转导和调控蛋白激酶反应的主要部位是原生质膜 该 研究还表明 钙调蛋白一般在代谢较旺盛的部位分布多 因此在玉米根部 钙调 蛋白在分生组织的分布较成熟组织多 由此可见 钙调蛋白在植物细胞生长中有 重要作用 k y e l u t h a m b i 等 1 9 8 4 研究了c 矿促使细胞膜蛋白的磷酸化 进而增加了 钙调蛋白的数量 钙调蛋白的阻断剂甲哌氟丙嗪可以抑制可溶性多聚氨基酸的磷 酸化 减少c a 的聚集 增加c a m 可以促进依赖于c a 的蛋白磷酸化过程 依赖于c 矿 和依赖于c a 2 的蛋白磷酸化过程都需要有最佳浓度的m 矿的参与 已知的环化a l i p 对 蛋白磷酸过程没有特殊的激活作用 哺乳动物细胞内对胞外刺激所做出的反应主 要是由这样一种机制引发的 即蛋白磷酸化过程是由依赖于c a m p c a 2 以及钙调蛋 白激活的蛋白激酶 对于钙调蛋白抑制剂的研究表明钙调蛋白参与了向地性和对 于各种不同激素的反应 因此可以推断钙调蛋白在细胞对各种胞外刺激的反应中 发挥了不可忽视的作用n 一 周华林等 2 0 0 1 用6 f p 作为报告基因研究了大豆s c a m l 和s e a m 4 的基因 并对 其进行了亚细胞定位 本研究通过利用g f p 亚细胞定位技术 选用了稳定表达的 s c a m 6 f p 融合基因的愈伤组织单细胞为材料 观察钙调蛋白在细胞壁上的分布情 况 采用质壁分离方法区分细胞膜和细胞壁 观察s e a m l 6 f p s c a m 4 6 f p 和g f p 基 因在细胞壁上发出的荧光 发现对照组细胞的细胞壁上没有绿色荧光 实验组细 胞壁上出现了绿色荧光 说明生成了s c a n g f p 融合基因 即证明了细胞外钙调素 在植物细胞中是钙调素基因的表达产物转运到细胞外发生作用的 m a i nv i a n 等 1 9 9 6 研究了鬼针草属植物在受到外界伤害部位刺激后钙调 蛋白基因的表达情况 分别用慢波和转移电子信号描述了刺激施加于受到伤害部 位和未受到伤害部位的植物中钙调蛋白在细胞膜上的分布及其变化 通过对未受 损伤部位邻近区域进行冷刺激 发现邻近部位钙调蛋白基因的表达量上升了 而 对于远距离部位 钙调蛋白基因的表达量在细胞膜上却没有变化 进一步通过对 受损伤部位邻近区和非邻近区进行热刺激 2 0 分钟后在非邻近区也就是远距离部 位 钙调蛋白基因的表达量上升 在损伤部位邻近区和非损伤部位钙调蛋白基因 的表达量也同样有增加 以上实验表明在未受损伤的植株不同部位进行刺激 只 有在刺激邻近部位钙调蛋白基因的表达量才上升 对受损伤的植株不同部位进行 刺激 不论是哪个部位 钙调蛋白基因的表达量均有增加 以上各实验均说明了钙调蛋白在不同刺激下 不同的生长部位 生长时期 表达量都不同 这也表明植物中编码钙调蛋白的基因有很多种 它们在不同的信 号刺激下会做出不同的反应 1 1 3 钙调蛋白的功能 目前 对钙调蛋白的功能研究面非常广 很多经典实验表明 钙调蛋白参与 了细胞的生长 分裂和分化 作为第二信使参与了激素 光敏素的反应 调节酶 的活性 细胞分泌和种子 花粉管萌发等多种生命活动 由此可见 钙调蛋白对 生物体具有重要作用 1 1 3 1 作为第二信使的功能 1 对外界刺激做出反应 植物在自然界中会受到各种外界刺激 这些刺激会通过信号转导系统转化为 细胞内信号 从而引起一系列生理生化反应 而钙一钙调蛋白就是信号转导中的一 种 钙调蛋白在该系统中作为第二信使起着重要的功能 在植物中 调节愈伤组织的形成及核酸和氨基酸代谢 植物激素起着重要的 作用 它是通过钙一钙调蛋白系统调节的 如植物激素i 从和脱落酸a b a 等均通过该 系统对细胞进行调节 i 从通过钙一钙调蛋白系统的介导使细胞壁的酸化 从而使 细胞伸长 即当c a 和c a m 结合后 活化细胞膜上的c a n a t p 酶 促使由i 从诱 导的f i 进入细胞壁 有实验表明 用2 4 一d 或6 一b a 处理向日葵下胚轴愈伤组织后 钙调蛋白含量上升 随后诱导愈伤组织的生长与分化 脱落酸a b a 在植物受胁迫下 对胁迫诱导基因的表达起着重要的作用 c 矿作 4 为第二信使参与了对胁迫诱导基因的表达过程 在拟南芥中 c i p k 3 丝氨酸 苏 氨酸蛋白激酶 与钙调蛋白相似蛋白 c b l 结合 共同参与调控a b 诱导的以及 胁迫诱导种子萌发初期胁迫基因的表达 c i p k 3 基因本身可被a b a 诱导 其它胁迫 因素 寒冷 高盐 物理伤害 干旱等也可诱导该基因 在某些特定条件或特定 环境下 c i p k 3 基因可对外界胁迫以及a b a 诱导的信号进行影响 除此之外 受寒 冷诱导的信号途径与a b a 信号途径无显著联系 在植物中 依赖于a b a 信号途径和 非依赖于a b 信号途径的胁迫信号途径中 c i p k 3 基因可能起连接作用 在研究拟南芥气孔运动时 对其施加外源钙调蛋白 检测出细胞内h 2 0 2 和钙离 子浓度有所增加 最终导致气孔关闭 随后在实验中对三聚体g 蛋白 一种帮助外 源钙调蛋白运输的蛋白质 可增加h 2 0 2 和钙离子的含量 缺失株和高表达的拟南芥 植株施加外源的钙调蛋白 发现外源钙调蛋白对缺失株无显著影响 细胞内h 0 2 含 量和钙离子含量也没有增加 然而外源钙调蛋白对高表达植株影响显著 细胞内 h 她含量和钙离子含量大量增加 调控气孔运动 由此可见 外源钙调蛋白参与气 孔运动的调控 t a h a rt a y b i 等 1 9 9 9 通过一种快速的半定量反转录链式聚合反应研究了离 体普通抗冻植物中景天酸代谢途径的信号转导 在某些胁迫下 渗透胁迫 离子 胁迫 外源脱落酸等 转录的p p c l 基因 碳酸酵素酶特异性结合钙调蛋白的异 构体基因 可以迅速得到扩增 但是在另外一些胁迫 细胞分裂素和茉莉酮酸酯 下 转录的p p c l 基因无明显增加 通过胁迫诱导 p p c l g a p e l a n dm d h l 基因的 转录产物的积累被钙调蛋白的螯合剂抑制 表明外源钙离子参与了钙调蛋白诱导 的信号转导 对未被胁迫的离体叶片施加肌霉素和依赖于c a 2 的a t p 酶抑制剂可以 增加p p c l 基因的转录 这表明胞内c a 2 可能参与了景天酸代谢途径的信号转导 依 赖于c a 2 或钙调蛋白的蛋白激酶和蛋白磷酸化酶的活性抑制了p p c l 基因的转录 这 是由于离子胁迫 渗透压和脱落酸的胁追 以上结果表明蛋白质的磷酸化和去磷 酸化都参与了景天酸代谢途径中的信号转导 蛋白磷酸化酶的抑制剂通过直接或 间接的减少水含量 促进p p c l 基因的转录 虽然钙离子是信号转导途径中的关键成分 而这个信号途径又诱导了高等植 物中胁迫基因的表达 但是对钙离子功能的分子机制了解得较少 细胞内钙离子 浓度的变化通过离子结合受体 包括钙离子结合受体 被观察到 钙调蛋白相似 蛋白c b l 是植物中一种特殊的钙离子受体家族 这个家族的成员之 一c b l l 被外 界多种刺激信号诱导 表明c b l l 在胁迫诱导的信号转导途径中有作用 在转基因 拟南芥中 c b l l 蛋白质的数量增加了 c b l l 改变了胁迫诱导的信号转导途径 虽 然在干旱诱导下 基因的表达量上升了 但在冷刺激下 基因的表达量却受到抑 5 制 另外 c b l l 过表达的植株显示对盐和旱胁迫该基因有很高的耐受力 而在低 温诱导下 它的耐受力却下降了 相比之下 c b l l 的突变株显示对低温诱导有高 的耐受力 而在旱诱导下 c b l i 基因的表达量下降 由此可见 突变株对盐和旱 胁迫有较低的耐受力 对低温诱导 具有很高的耐受力 以上实验结果表明 c b l l 基因在盐和旱胁迫下具有正调控功能 在低温胁迫下具有负调控作用o 2 参与调控对光 重力及机械的反应 有大量证据表明钙一钙调蛋白系统参与调节内 外部机械胁迫信号对植物构造 的影响 如茎的长度 细胞壁木质化 花粉管伸长 气孔运动等 此外 钙一钙调 蛋白系统对光敏素复合体相关基因有明显影响 有实验用红光和远红光分别照射 球子蕨孢子 红光照射下 孢子细胞内的钙离子浓度升高 达到一定浓度时 孢 子萌发 用远红光照射 孢子萌发受到抑制 可以推测在植物中红光照射可促使 细胞内c a 2 浓度增加 激活钙一钙调蛋白系统 促进细胞生长 而远红光则使细胞 内c a 2 浓度下降 抑制了细胞的生长 有实验证明根的向地性除由于生长素分配不均引起外 还和钙一钙调蛋白系统 的调控有关 在重力的影响下 根部的淀粉粒沉积在下侧细胞的内质网上 使胞 内c a 2 浓度增加 c a 2 和c a m 结合激活质膜中的钙泵和生长素泵 从而引起c 矿与i a a 在下侧细胞的内质网上堆积 这样根部下侧细胞生长素浓度过高 抑制了细胞的 生长 根随即沿着重力方向向下生长 在拟南芥的研究中 分别用c a m 和低浓度的 c a m 拮抗剂观察根的向地性 发现钙一钙调蛋白系统参与了根的向地性生长 而低 浓度的c a l d 拮抗剂对根的向地性生长并没有显著影响 同时钙一钙调蛋白系统还参 与了其它由于重力引起的反应如细胞极性 细胞骨架的变化等馏1 另外 m a i nv i a n 等 1 9 9 6 研究了植物在受到机械伤害后钙调蛋白基因的 表达情况 未受损伤的植株不同部位进行刺激 只有在刺激邻近部位钙调蛋白基 因的表达量才上升 对受损伤的植株不同部位进行刺激 不论是哪个部位 钙调 蛋白基因的表达量均有增加 1 1 3 2 作为酶的反应器 w a y n ea s n e d d e n 等 1 9 9 5 研究了谷氨酸脱羧酶 c a d 对钙一钙调蛋白系 统的影响 在实验中 从不同大豆组织中提取纯化了在敖合剂e d t a 存在下的c a d 结果显示在p h5 8 时c a d 的活性最强 而在p h7 o 时c a d 的活性为最大活性的1 2 这主要是由于在p h7 o 时钙一钙调蛋白系统被激活 在p h5 8 时不被激活 当蛋白 酶抑制剂被去除时 c a d 的活性对钙一钙调蛋白系统就不敏感 但和被c a m 激活的酶 活性类似 c 矿 c 酬对c a d 的刺激被c a m 的拮抗剂甲哌氟丙嗪抑制 增加c a m 或c a 2 的 浓度 c a d 的浓度就增加 这表明谷氨酸脱羧酶c a d 是通过钙一钙调蛋白系统被激活 6 的 c a 2 c a m 的作用能激活蛋白激酶 使蛋白质磷酸化 有利于物质的转运 c a 一a t p 酶是所有的真核生物中关键的调控因子 在动物原生质膜中 有两种 不同的钙调蛋白激酶泵 i i b 型泵 家族 在植物原生质膜中 没有钙调蛋白激酶 泵 i i b 型泵 的存在 只有一些钙调蛋白激酶泵 i i b 型泵 的异构体存在于非 质膜区 w o o 等 2 0 0 0 对大豆c a 2 a t p 酶s c a l 进行了研究 发现c a 2 一a t p 酶s e a l 的 活性会随着c a 2 浓度的增加而增加 钙调蛋白和c a 2 一a t p 酶s e a l 的n 端结合 如果 s e a l 的n 端的两个钙调蛋白结合位点缺失 整个s e a l 蛋白就会失活 研究表明大豆 的c a 2 a t p 酶s c a l 可被钙调蛋白激活 不能被渗透胁迫调控o n s u s a n n am a l m s t r o m 等 2 0 0 0 研究了花椰菜中依赖于c a m 激活的c 矿 a t p 酶 b c a l p 与钙一钙调蛋白系统的关系 b c a l p 的n 端能结合c a m 该实验用三种不同 的抗血清通过w e s t e r n 杂交显示 b c a l p 的n 端被胰岛素分开并且n 端含有依赖c a 2 的 c a m 结合位点 这个位点可以被依赖于c a 2 的低密度的细胞膜上的a t p 酶抑制 说明b c a l p 的n 端的c a m 结合区有自动抑制的功能 b c a l p 的n 端的表达和合成氨基酸 1 9 位丙氨酸 3 9 位甲硫氨酸 是蛋白激酶c 磷酸化的基础 通过对磷酸化的融合 蛋白进行测序表明1 6 位或2 8 位的苏氨酸很可能是磷酸化的靶位点 2 8 位的苏氨酸 对于c a m 和1 9 位丙氨酸 3 9 位甲硫氨酸结合没有影响 结果显示 b c a l p 的n 端作为 c a m 结合的靶位点 胰岛素分开位点和磷酸化位点有重要的调控作用 同时也对自 动抑制区有重要功能 由此可见 c 矿一a t p 酶是通过和c a m 结合并被它激活发挥作 用的 也就是说钙调蛋白 c a m 对依赖于c a 2 的a t p 酶有激活作用 1 1 3 3 在植物生长发育调控中的作用 钙调蛋白除了作为第二信使对外界刺激做出反应和成为酶的反应器外 在植 物的生长发育 细胞分裂 花粉管深长等 和基因的表达调控中也起着十分关键 的作用 j a n 霄 v o s 等 2 0 0 0 探讨了一种钙调蛋白结合蛋白 驱动蛋白 k e b p 的功能 利用植物紫鸭趾草分裂中的细胞 观察在细胞分裂过程中 驱动蛋白 k c b p 和钙调蛋白的结合 实验用抑制钙调蛋白结合区结合的抗体作用于k c b p 发现k c b p 减少了与钙调蛋白的结合几率 推测这些抗体可能激活k c b p 其次 又 取紫鸭趾雄蕊前早期毛细胞 向其注射抗体 短时间内细胞核开始分裂 细胞很 快进入分裂中期 但此时细胞不再分裂 最后取处于细胞分裂后期的细胞 对其 注射抗体 发现抗体对后期分裂无影响 但会使细胞产生成膜体 因此可得出结 论 在细胞分裂的前 中期 用抗体激活k c b p 会加速细胞分裂 而在在细胞分裂 的中 末期 k e b p x 寸细胞分裂影响很小 说明钙调蛋白对植物细胞分裂有重要影 响 嘲 7 在未萌发的萝卜种子中 发现一种磷酸二酯酶 依赖于c a 2 的钙调蛋白 的抑 制剂在胚轴分裂的过程中出现 这种抑制剂依赖于c a 2 并且具有钙调蛋白结合位 点 这种抑制剂的作用可被蛋白酶极大的削弱 它和钙调蛋白发生相互作用并非 和c a 2 作用 在凝胶分离过程中 若有c a 2 出现 钙调蛋白与抑制剂就会共同显色 这种抑制剂有热稳定性且在p h7 5 时具有活性 在种子萌发早期 胚轴的鲜重及 细胞中的d n a 和r n a 两都有增加 而抑制剂减少了 钙调蛋白却增加了 在实验中 加入脱落酸 a b a 和壳梭孢 菌 素 f c 发现a b a 抑制了种子的萌发 使抑制 剂减少和钙调蛋白增加 f c 促使鲜重增加 但细胞中的d n a 和r n a 量都不增加 在 这种情况下 抑制剂水平下降了 而钙调蛋白的数量比对照组多 在a b a 和f c 都存 在时 和对照组相比 胚轴的鲜重增加了 细胞中的d n a 和r n a 量却不增加 钙调 蛋白数量增加 结果显示 在萝h 种子萌发早期 钙一钙调蛋白系统被钙调蛋白的 增加和抑制剂的减少激活口刀 t a k a y u k i s a n o 等 2 0 0 2 研究了水稻中一种依赖于c 矿的蛋白激酶s p k 对s u e 合成酶活性的调控 s u c 是一种光合作用的产物 在储藏产物的生物合成初期通过 s u c 合成酶的新陈代谢产生 据研究 s u c 合成酶的活性被可逆转的磷酸化调控 但具体细节尚不清楚 水稻中的s p k 是一种c a 2 t 依赖型蛋白激酶 在不成熟种子的 胚乳中特异表达 它参与了储藏产物的生物合成 反义的s p k 转化株缺少储存淀粉 等物质的能力 但能产生含有大量s u c 的含水种子 从而有效的防止了s u c 的降解 体外磷酸化表明s p k 的苏氨酸残基在s u c 的降解过程中起着重要的作用 研究表明 s p k 参与了s u c 合成酶活性的反应 s p k 可能是一种s u c 合成酶的激酶 它在储藏物 合成过