分子遗传学复习题终极版..pdf

分子遗传学复习题 名词解释 DNA甲基化 DNA methylation 是指由DNA甲基化转移酶介 导 催化甲基基团从S 腺苷甲硫氨酸向胞嘧啶的C 5位点转移的过程 ENCODE计划 The Encyclopedia of DNA Elements Project 即 DNA元件百科全书计划 简称ENCODE计划 是在完成人类基因组 全序列测定后的2003年9月由美国国立人类基因组研究所 National Human Genome Research Institute NHGRI 组织的又一个重大的国际合 作计划 其目的是解码基因组的蓝图 鉴定人类基因组中已知的和还不 知功能的多个物种的保守序列等在内的所有功能元件 ENCODE计划的 实施分为3个阶段 试点阶段 a pilot phase 技术发展阶段 a technology development phase 和生产阶段 a producttion phase gRNA guide RNA 既指导 RNA gRNA guide RNA 能通过正 常的碱基配对途径 或通过G U配对方式与mRNA上的互补序列配 对 指导编辑的进行 GT AG规律 GT AG rule 真核生物所有编码蛋白质的结构基 因 其RNA前体在内含子和外显子交界处有两个较短的保守序列 内含 子的左端均为GT 右端均为AG 此规律称GT AG规律 miRNA 即小RNA 长度为22nt左右 5 端为磷酸基团 3 端为羟 基 miRNA广泛存在于真核生物中 不具有开放阅读框架 不编码蛋白 质 其基因的转录产物是发夹状结构 在RNase 酶切后以双链形式存 在 是近几年在真核生物中发现的一类具有调控功能的非编码 RNA 它们主要参与基因转录后水平的调控 RNA编辑 RNA editing 是指通过碱基修饰 核苷酸插入或删除以 及核苷酸替换等方式改变RNA的碱基序列的转录后修饰方式 RNA诱导的沉默复合体 RNA Induced Silencing Complex RISC 与siRNA结合后可识别并切断mRNA RNA指导的DNA甲基化 RNA Directed DNA Methylation RDDM 活性RISC进入核内 指导基因发生DNA的甲基化 密码子摆动假说 wobble hypothesis 密码子的第1 2位核苷酸 5 3 与反密码子的第2 3核苷酸正常配对 密码子的的第3位与反 密码子的第1位配对并不严谨 当反密码子的第1位为U时可识别密码子 第3位的A或G 而G则可识别U或C I 次黄嘌呤 可识别U或C或A 比较基因组学 comparative genomics 是一门通过运用数理理 论和相应计算机程序 对不同物种的基因组进行比较分析来研究基因组 大小和基因数量 基因排列顺序 编码序列与非编码序列的长度 数量 及特征以及物种进化关系等生物学问题的学科 表观遗传变异 epigenetic variation 基因的碱基序列未发生改 变 而是由于DNA甲基化 组蛋白的乙酰化和RNA编辑等修饰导致基 因活性发生了变化 使基因决定的表型发生变化 且可遗传少数世代 但这种变化是可逆的 超基因家族 supergene family 是DNA序列相似 但功能不一 定相关的若干个单拷贝基因或若干组基因家族的总称 沉默子 silencer 一种转录负调控元件 当其结合特异蛋白因 子时 对基因转录起阻遏作用 特点很象增强子 但不增强转录 而是 减弱转录 故称负增强子 代谢组学 metabolomics 是对某一生物或细胞在一特定生理时期 内所有低分子量代谢产物同时进行定性和定量分析的一门新学科 端粒 telomere 是由独特的DNA序列及相关蛋白质组成的线性真 核染色体的末端结构 它具有防止末端基因降解 染色体末端间的粘连 和稳定染色体末端及其精确复制等功能 反向遗传学 reverse genetics 是从改变某个感兴趣的基因或蛋 白质入手 然后去寻找相关的表型变化 反转座子 retroposon 或 反转录转座子 retrotransposon 先 转录为RNA再反转录成DNA而进行转座的遗传元件 核酶 ribozyme 具有催化活性的RNA 即化学本质是核糖核酸 RNA 却具有酶的催化功能 核酶的作用底物可以是不同的分子 有些 作用底物就是同一RNA分子中的某些部位 核心启动子 core promoter 是指在体外测定到的由RNA pol 进行精确转录起始所要求的最低限度的一套DNA序列元件 化学基因组学 chemogenomics 它是作为后基因组时代的新技术 是联系基因组和新药研究的桥梁和纽带 它指的是使用对确定的靶标蛋 白高度专一的小分子化合物来进行基因功能分析和发现新的药物先导化 合物 基因组印迹 genomic imprinting 也称作基因印迹 gene impringting 是一种新发现的非孟德尔遗传现象 指来自双亲的某些等 位基因在子代中呈现差异性表达的现象 程序性细胞死亡 凋亡 programmed cell death apoptosis 细胞应 答一类刺激剂 引起一连串特征性的反应 从而启动导致细胞死亡的途 经 焦磷酸化编辑 pyrophosphorolytic editing RNA聚合酶通过 PPi的掺入 聚合反应的逆反应 去除错误加入的核苷酸 然后加入正 常的核苷酸 虽然这种编辑不能区分正常和错误的核苷酸 但由于转录 在错误加入核苷酸后停留时间过长 而对其有优先校正功能 酵母双杂交 yeast two hybrid 利用杂交基因通过激活报道基因的 表达探测蛋白质与蛋白质间的相互作用 亮氨酸拉链 leucine zipper 是由伸展的氨基酸组成 每7个氨 基酸中的第7个氨基酸是亮氨酸 亮氨酸是疏水性氨基酸 排列在 螺 旋的一侧 所有带电荷的氨基酸残基排在另一侧 当2个蛋白质分子平 行排列时 亮氨酸之间相互作用形成二聚体 形成 拉链 密码子使用的偏好 relative synonymous codon usage RSCU 编码同一氨基酸的各个密码子的使用频率在不同生物中并不相同 也不 与该氨基酸在整个蛋白质中的频率成正比 这也就是密码子使用的偏好 现象 该现象可影响基因表达的效率 母系印迹 maternal imprinting 来自母本的等位基因 母源等位基 因 不表达 而父源等位基因表达的现象 母性基因 maternal gene 母体卵子发生时所表达的基因 母性 体细胞基因是在母性体细胞中表达 而母性胚系基因则在生殖细胞中表 达 如卵母细胞 染色质重塑 chromatin remodeling 是表观遗传修饰中一种常见的 方式 是指导致整个细胞分裂周期中染色质结构和位置改变的过程 染色质重塑因子 chromatin remodeling factor 依靠水解ATP提 供能量来完成染色质结构的改变 染色质重塑因子在组成及功能上不 同 但都包含类Snf2超家族的ATP酶亚基 增强子 enhancer 该DNA序列可增加与其连锁基因转录的频 率 增强子多位于基因的5 端 但也可位于基因的3 端 甚至基因的内 含子中 无位置及方向性 但可能有组织细胞特异性 一般能使基因转 录频率增加10 200倍 有的甚至可以高达上千倍 甚至远离靶基因达 几千kb也仍有增强作用 转座子沉默 transposon silencing 宿主积累了转座子的多个拷 贝 从而阻遏转座发生 组成型剪接 constitutive splicing 编码蛋白质的不连续基因通 过RNA剪接将内含子从mRNA的前体中依次去除 然后规范地将外显子 剪接成成熟的mRNA 这种剪接方式是一个基因只产生一种成熟的 mRNA 一般也只产生一种蛋白质产物 组蛋白密码 histone code 组蛋白氨基端的各种修饰 甲基 化 乙酰化 磷酸化 泛素化等 及组合通过改变染色质的结构或产生 效应蛋白质的结合位点而影响基因的表达活性 从而调控下游的细胞学 过程 组蛋白修饰 histone modification 是指染色质上的组蛋白被甲基 化 乙酰化或磷酸化的过程 中心法则 central dogma F Crick于1958年提出的阐明遗传信息 传递方向的法则 指出遗传信息从DNA传递至RNA 再传递至多肽 DNA与RNA之间遗传信息的传递是双向的 而遗传信息只是单向地从 核酸流向蛋白质 简答题 1 核小体与核小体定位在基因表达及其调控中有何作用 答 1 核小体与基因表达 核小体是染色质的基本结构单位 体内 外实验均证实 核小体是基因转录的通用抑制子 细胞内基因组包裹在 核小体内 如果启动子区在核小体中 则转录通常会被抑制 实验也证 明由于缺少H4组蛋白 在核小体不能形成的酵母细胞系中 很多基因变 为组成型表达 而在正常的细胞中 它们均处于抑制状态 2 核小体定位与核小体定位密码 核小体在DNA上的精确定位对细胞 正常功能的发挥起重要作用 由于核小体与DNA的动态相互作用 大多 数核小体的位置是不固定的 但是在有些情况下 某些核小体被限定在 基因组的固定位置上 或者说DNA序列仅以一种特定的构型组装成核小 体 则DNA上的每个位点将一直位于核小体上的特定位置 我们称这种 组装类型为核小体定位 nucleosome positioning 2 原核生物与真核生物的启动子结构有什么差别 答 原核生物的转录 操纵元 原核生物中很多功能上相关的基因前后相连成串 由一个共同 的控制区进行转录的控制 包括结构基因 控制区以及调节基因 原核生物的启动子 在操纵元中 从mRNA开始转录的位点以上都是启动子序列 20bp 200bp 特点 1 Pribnow框 TATAAT 位于 10左右 是 RNA聚合酶的牢固 结合位点 2 Sextama框 TTGACA 位于 35附近 是 RNA聚合酶的初始 结合位点 3 上述二者及之间的距离决定转录效率 一般距离17bp左右 4 CAP位点cAMP 受体蛋白复合物在启动子上的的结合位点 真核生物的转录 启动子 在基因的5 端 由RNA聚合酶及转录调控因子结合的区域称为 启动子 promoter 一般从转录起始点 1 到RNA聚合酶结合的区域 为核心启动子 在其上游还有增强子 沉默子等上游调控元件 它们和 反式作用因子一起调控基因的表达 真核生物启动子 真核生物有三类RNA聚合酶 与此对应 有三类不同 的启动子 事实上RNA聚合酶 所作用的启动子情况比较复杂 RNA聚合酶 识别的启动子 除5SrRNA基因外 其它rDNA基因组成一 个大的多拷贝基因族 转录成一个45S的rRNA前体 其启动子由起始位 点的核心启动子和其上游控制元件两部分组成 核心启动子包括 45到 20 负责转录的启始 上游控制元件从 200到 150 它们之间的序列 长度对转录效率影响很大 RNA聚合酶 启动子可分为两种类型 一种是启动子位于转录起始点下 游 又称下游启动子 downstream promoter 基因内启动子 intragenetic promoter 或内部控制区 internal control region 另一 种启动子是与常见的启动子相似 又称上游启动子 upstream promoter 下游启动子又分为两个亚型 型和 型 型内部启动 子有两个分开的序列boxA TGGCNNAGTGG 共同序列 RRYNNARYGG 和boxC CGGTCGANNCC 共同序列 RRTGGGA TGACC 而它们之间的距离比较固定 为中间元件 internal element IE 这是5SrRNA基因的典型结构 型内部启动 子由boxA和boxB GGTTCGANTCC 组成 两者之间距离较大 且不 固定 是tRNA基因启动子的典型结构 上游启动子包括三部分元件 即TATA框 近侧序列元件 proximal sequence element PSE 和远侧 序列元件 distal sequence element DSE 这是部分snRNA基因启动子 的典型结构 RNA聚合酶 启动子由四部分元件组成 即转录起始点 TATA盒 上 游元件和远上游元件 转录起始点 initiators 在有些 型转录酶启动 子中比较保守 其一致性序列为PyPyANT APyPy 转录起始点常和 TATA盒组成核心启动子起始基础转录 但与其相连的上游元件和增强 子可以促进其高效转录 对于含TATA盒的启动子 其启始点常在其下 游25bp 30bp 有的基因启动子无典型起始子序列 则RNA聚合酶根据 TATA盒下游30bp附近的第一个嘌呤碱基作为转录启始点 绝大多数 型转录酶启动子均含有TATA盒 一致性序列为 TATAAAA 第5和7位A有时可被T取代 看家基因 housekeeping genes 同源异形基因 homobox gene 和哺乳类发育中的免疫控制基 因无TATA盒 而奢侈基因 luxary genes 具有TATA盒 它可能是帮 助RNA聚合酶正确识别其下游的起始子 从正确的位置起始转录 有些 启动子的TATA盒对转录十分重要 一旦缺失则完全失去活性 故 TATA盒对有些 型转录酶启动子的功能是十分重要 上游元件 upstream element UE 位于TATA盒上游的元件种类较 多 常见的有GC盒 CAAT盒 八聚体元件 另外有些启动子还可见到 KB ATFu等 GC盒 位于TATA上游特定位置上 90bp 一个或几个含有高GC序 列的元件 保守序列为G TGGGCGGG AG AC T 该序列有位置依赖 性 但无方向依赖性 它与SP1蛋白结合后可以促进转录的效率 CAAT盒位于TATA盒上游 可极大的提高转录的效率 但对其起点 特异性等无影响 CTF家族因子识别CAAT盒 另外其它的蛋白因子也 可识别CAAT盒 例如CP1 CP2 CP3 C EBF ACF等 由于CTF家 族因子是同一基因经不同加工后的产物 对CAAT盒的识别能力相同 共同的保守序列为GGC TCAATCT 一般位于起始点上游 80到 75左 右 3 常见的反式作用因子有哪些 其结构特点是什么 第四章 答 反式作用因子 trans acting factor 与顺式作用元件 cis acting element 相结合直接控制着基因的转录 在反式作用因子中有些可促进 基因的表达称之为激活蛋白 activin 有些可阻遏基因的表达称之为阻 抑蛋白 arrestin 一般情况下 这些调节着基因转录活性的反式作用 因子 通称为转录因子 已鉴别的转录因子可分为普遍性和组织特异性 两类 转录因子有数千种之多 从其结构特点来看 主要有两大功能 区 DNA结合域 活性域 对于DNA结合域 根据其氨基酸结构 域的特点 又可分为 螺旋 转角 螺旋 helix turn helix HTH 锌指 zinc finger 螺旋 环 螺旋 helix loop helix HLH 亮氨酸拉链 leucine zipper ZIP 同源异型域 homeodomain HD 激素受体类 类固醇等 或核受体类 桶 barrels 结构等 大量的实验证明这 两大功能域是分开的 但不同转录因子的活性域其激活方式可能不同 例如通过蛋白合成 共价键修饰 例如蛋白质的磷酸化和脱磷酸化 等 与配体结合及与抑制因子 蛋白及RNA等 结合改变构象等发挥 作用 以下介绍几种重要反式作用因子的结构特点及调节基因表达的可 能机理 锌指蛋白 锌指蛋白 zinc finger protein 是由含有锌指结构域的两 类蛋白质组成 即传统的锌指蛋白和类固醇受体结合蛋白质 锌指结构 域是由蛋白质上保守的半胱氨酸及 或组氨酸与锌原子结合形成一个手 指状的结构 典型的锌指蛋白往往有多个锌指结构域 其保守序列为 Cys X2 Cys X3 phe X5 leu X2 His X2 His 锌原子与其中两个半胱氨酸 和2个组氨酸结合形成四面体结构 长23个氨基酸 两个锌指之间由78 个氨基酸相连 从每个锌指的三级结构来看 其N端形成 折叠 C端形 成 螺旋 反向平行的 折叠区含有2个半胱氨酸 与其后 螺旋中的2个 组氨酸一起与锌原子结合 而由锌原子稳定了整个锌指结构 一般来说 具有多锌指结构域的蛋白质可能就是与DNA结合的转录因 子 但有时锌指蛋白的底物可能还包括RNA 特别是仅有一个锌指结构 域的蛋白 有时甚至与DNA结合活性无关 同源异型域蛋白 同源异型域 homeodomains HD 蛋白几乎存在于 所有真核生物基因组中 含有60个氨基酸保守序列的DNA结合蛋白 首 先在果蝇中发现其可以调节个体形态发育过程 例如果蝇的触角足基因 发生突变 可使果蝇触角部位长出一对足 同源异型域蛋白属于HTH蛋 白 可形成三个螺旋区 其中螺旋2 螺旋3形成典型的HTH域 螺旋3 识别螺旋与DNA大沟结合 其N末端臂参与DNA小沟的结合 同源异型 域蛋白形成二聚体后才与DNA结合 barrels结构域 乳头瘤病毒E2编码一种激活蛋白 可促进所有病毒 基因的转录 由两个E2蛋白单体形成的二聚体 可以产生一个DNA结 合域 这个结合域是由多个反向平行的 折叠构成的 桶 barrels 结 构 每个亚基上的 螺旋则与DNA大沟相结合 两个相邻的大沟被识别 螺旋结合后可导致DNA分子发生45 的弯曲 螺旋 环 螺旋结构域 HLH长40 50个氨基酸 由两个长15 16个 氨基酸的亲水 亲脂的 螺旋及长度不同的环 连接区 将其分开 两 蛋白的两个 螺旋疏水面相互作用可形成同二聚体或异二聚体 多数 HLH附近有一强碱性的氨基酸区 但也有不含该区的HLH 含有碱性区 的HLH称为bHLH或HLP 是DNA的识别和结合所必需的 但与DNA结 合能力的差异则是由bHLH基序及二聚体的状况所控制的 bHLH可分为 两类 一类为组成型表达 例如哺乳类的E12 E47 果蝇的da 另一类 为组织特异性表达 例如哺乳类的MyoD和果蝇的AC S 亮氨酸拉链的结构域 亮氨酸拉链 leucine zipper ZIP 的双亲 螺 旋其疏水面亮氨酸突出 并与另一个平行的亮氨酸拉链蛋白的亮氨酸突 出交错排列 盘绕成卷 两个右手螺旋互相缠绕 每圈3 5个氨基酸 每7个残基构成一个完整的重复单位 因此亮氨酸在拉链区每隔6个氨基 酸残基重复出现一次 两个蛋白形成同源二聚体或异源二聚体 在每个 拉链蛋白质中与亮氨酸重复序列邻近的区域是高度碱性的 可作为一个 DNA的结合位点 整个二聚体呈Y型结构 拉链构成茎 两个碱性区分 叉形成臂 横跨在DNA分子上并与相邻的DNA两个大沟结合 这称为 bZIP 这种bZIP蛋白结合的靶序列为无间隔的反向重复序列 C EBP异二聚体 bZIP有4个重复区 可与CAAT框及SV40核心增强子结合 Jun Fos异二 聚体则有5个重复区 可与其靶序列结合 虽然Fos也为ZIP结构 由于 不能形成二聚体 故本身并不能与DNA结合 但Fos与Jun形成的异二聚 体及Jun Jun同二聚体均可与DNA结合 而且靶序列特异性相同 但异 二聚体与AP1位点的结合能力则比Jun同源二聚体低10倍左右 在真核生物中存在大量复杂的中介蛋白 它们很可能起到连接启动子与 增强子的桥梁作用 通过这些中介蛋白各种反式作用因子发生复杂的相 互作用 共同决定基因转录的特异性和强度 增强子对启动子的活化虽 具有远距离 无方向性 但基因和基因之间有时会存在一个绝缘子 Insulator 可以限制增强子作用的范围 绝缘子位于同一基因启动 子与增强子之间 可抑制增强子对转录的激活 但绝缘子并不能抑制启 动子下游的增强子对同一启动子的激活 也不能抑制该增强子对另外一 段基因的激活作用 绝缘子上可结合特定的蛋白质 从空间阻碍着增强 子与启动子的联系 绝缘子的作用机制是否通过阻碍DNA成环 还是阻 碍中介蛋白与增强子和启动子结合尚无定论 但绝缘子确实可以抑制修 饰染色质的展开 局部染色质发生修饰后可以影响其表达 而这种修饰 区域不能跨过绝缘子 如果将基因插入到异染色质区 往往会发生基因 沉默 而在其两端加上绝缘子 则可正常表达 4 原核生物与真核生物基因表达调节机制的主要差别是什么 答 1 在原核生物中 基因表达的调控以转录水平调控为主 在调 节基因的作用下 主要以操纵子为单位 转录出一条多顺反子mRNA 并指导蛋白质合成 而且转录和翻译是偶联的 很少发生mRNA的加 工 修饰 但也存在转录后水平的调控 例如反义RNA的调控 翻译的 调控 RNA开关等 2 在真核生物中 基因表达的调控十分复杂 可发生在多个层次 多个水平 包括从染色体和染色质的表观遗传学控制 DNA的复制 RNA的转录 加工与拼接 蛋白质翻译及翻译后加工 修饰等等 对于 真核生物基因的转录调控 主要是顺式作用元件 cis acting element 与反式作用因子 trans acting factor 的相互作用 3 另外 DNA的重排和RNA的交替剪接也是真核生物基因表达多样 性的重要机制 近年发现的小分子RNA通过RNA干扰途径也可调节基 因的表达 介导DNA的甲基化 mRNA的降解及翻译起始的抑制等 5 转座子的遗传学效应与应用 答 1 改变染色体结构 当转座子插入后而引起受体位点DNA一段短的同向重复序列 DR 即靶位加倍 target site duplication 如转座子切离在DR之间重组 结果是夹在两个DR之间的DNA序列被切离而缺失 deletion 中间的 DNA序列形成一个环 将从细胞中丢失 DR在染色体上只留下一个拷 贝 图6 51a 如重组发生在IR之间 结果是夹在两个IR之间的DNA发生 倒位 inversion 图6 51b 而反向重复得到保留 这将会导致下一次 的倒位 转座子附近序列的缺失是两步反应的结果 转座产生了DR 而重组又 发生在此DR之间的转座子分子内 当新拷贝的方向和原拷贝方向相反 时 重组会导致倒位 当方向相同时重组的结果产生了两个小的环状 DNA 其中一个无复制原点而被丢失 另一个有复制原点的可复制 因 丢失环带有转座子附近序列 结果造成转座子附近序列和一个重复序列 的缺失 有的转座子可以促进双重倒位 duplicative inversion 这些 转座子以相反的方向位于中心区的任一侧 中心区发生倒位时 它们的 方向也随之改变 2 诱发基因突变 当转座子插入到某个基因座位中往往导致该基因失活 在某些情况 插 入位点的基因保持正常转录 只是转录子中的插入序列通过转录后的剪 接过程而被除掉 因此插入位点的基因仍表现出显性性状 这种现象叫 做渗漏突变 leaky mutation 也就是仍有 些残余水平基因表达的突 变 该基因称为渗漏基因 leaky gene 又称亚效等位基因 hypomorph 即一种突变种基因与其野生型有相似的效应 但效应 较弱 插入失活和渗漏突变与转座子在插入位点中的方向有关 例如 当 dSpm和Ds因子插入与靶基因的方向相反时 前体mRNA中的dSpm或Ds 序列则可通过转录后的加工过程而被除掉 所以含有转座子的基因仍然 编码野生型蛋白质和mRNA 即所谓的渗漏突变 如果转座子在外显子 中的转录方向与所在基因的转录方向相同 转录过程常终止在转座子的 多聚A化信号位点上 形成半截子mRNA 因此也造成插入失活 对于Spm dSpm控制因子系统来说 由dSpm造成的渗漏突变只是在基因 组中不存在Spm因子时才能发生 如果植物基因组中存在Spm因子 无 论dSpm的插入方向如何 含有转座子的基因都不能正常表达 这种现 象进一步说明 Spm以反式互补方式为dSpm提供抑制功能 在细菌中 根据对乳糖操纵子和半乳糖操纵子的研究 当IS因子插入到 这两种操纵子的5 端顺反子中以后 往往严重降低其下游顺反子的表达 水平 这就是所谓的极性突变 polarity mutation 或突变的极性效应 polarity effect 当两个转座子被同一转座酶识别而整合到染色体的邻近位置时 则它们 之间的DNA将变得易于被转座酶作用而转座 如果它们之间的DNA中 含有外显子 则该外显子将被切离 并可能插入另一基因之中 这种效 应称为 外显子改组 exon shuffling 所谓外显子改组 即源自一个 或几个基因的若干个外显子像 洗牌 那样地进行重排 可以产生新的基 因 这也是生物体产生新基因和基因进化多样性的途径之一 转座子在染色体中经过一段长期沉寂之后 几种转座类型的转座子几乎 同时地进入一个活跃转座的时期 它们的转座 诱变效应将在种群的少 数个体中不时地被激活 这种突发的变化称之为转座爆炸 transposition burst 转座爆炸首先发现于发育中的玉米 使其染色体反复地断裂而 引发许多突变 另外 在果蝇某些品系的杂交中也发生转座爆炸 如果 这种转座爆炸发生于生殖系的细胞中 则引发 杂种败育综合症 hybrid dysgenesis 这种现象与通常的 杂交优势 hybrid vigor 现象形成鲜 明的对比 此外若干植物类型证明 转座爆炸可以因严酷的生存条件引 发 并由此产生众多的变异子代 这对于增强物种的生存能力 扩大物 种的适应性是有利的 因此 转座因子不仅仅导致生物基因组或基因的 变异 有时它们也是一种增强生物生存能力的调控元件 3 调节基因表达 我们已知酵母的Ty1因子 Ty1 element 是反转录转座子 其转座过程与 RNA病毒的反转录插入宿主染色体的过程一样 只是Ty1转座子不像 RNA病毒那样还制造外壳蛋白 因为它缺env基因 因此 RNA病毒称 为反转录病毒 而Ty1一类的转座子则称之为反转录转座子 正是这类 反转录转座子不产生蛋白外壳 故只限于细胞内活动 众所周知 反转 录病毒带有增强子 enhancer 序列 很多转座子也带有增强子 它们 像RNA病毒一样 能使其插入位点附近的基因活性增强 转座子除了含 有增强子外 有的转座子还含有启动子 也能促进基因的转录活性 如 Tn10的IS10R以某一方向插入到由于缺失了启动子而不能表达的argE基 因的5 端时 结果该沉默的argE基因重新表达 对Tn10的IS10R序列分 析表明 其末端含有一个内向启动子 Pin 一个外向启动子 Pout 它 们之间重叠36bp 而且Pout是比Pin更强的启动子 Pout可能是启动侧翼 宿主沉默基因表达的原因 6 53a 同时Pout的产物outRNA以反义 的形式在翻译水平上调节转座酶的合成 6 53bc 当然也存在转座 子插入某个基因的内含子或外显子中而影响该基因表达 通常表现为降 低该基因的转录水平 但有些情况下也会改变内含子的剪接位点 使某 些外显子丢失 因此也导致基因失活 如果转座子插入到某个基因的转 录控制区或启动子中 则导致该基因完全失活 当转座子从该座位上切 割后 该基因又可恢复到显性性状 但是由于切割后往往造成插入位点 发生缺失 重复或倒位等结构的变异 因而其表达活性就不可能完全恢 复到原来的状态 而使基因的转录活性和转录时空发生各种变化 如降 低基因的表达水平 或改变基因的组织或器官特异性表达等 4 产生新的变异 由于转座插入位点可能出现新的基因 如像Tn带的抗药性基因 它的转 座不仅造成某个基因的插入突变 同时在此位点上出现一个新的抗药性 基因 由于转座作用 使某些原来在染色体相距甚远的基因组合在一 起 构建成一个操纵子或表达单元 也有可能产生一些具有新的生物学 功能的基因和编码新的蛋白质分子 例如细菌的质粒由于转座而携带多 种基因 其中一些基因为人们提供了丰富的有用的蛋白质资源 有的蛋 白质或酶可使该细菌分解代谢多种有害的化学物质或元素 如分解甲 苯 奈 石油 并抗有毒金属汞等 因而含有这种质粒的菌株可清除海 水中石油等物质的泄漏和环境中的污染物 成为环境保护中很有价值的 超级菌种 super bacteria 另一方面 如在此类质粒中携带多种引起 植物疾病的致病基因或多种药物产生抗性的基因 那么携带该质粒的致 病细菌所引起疾病则难以治疗 这已成为公害问题 图6 54 由于转座而增加了同源序列的整合 如IS既可插入细菌染色体的不同位 置 又可插入质粒上 大肠杆菌F因子和染色体上都发现IS 由此构成 了F因子和染色体上存在一些相同的插入序列 如IS1和IS2 等 通过这 些同源序列间重组 扩充了F因子插入染色体而成为Hfr菌株的种类 此 外由于转座子也可以作为基因工程中的载体携带其他基因进行转座 形 成重新组合的基因组或产生新的类型 有利于进化 在某些情况下 插入到某个基因座位中的转座子也可能失活 转座子失 活过程主要与DNA的甲基化 methylation 有关 当转座子中的某些甲 基化位点脱甲基化后 转座子又可以恢复转座功能 使转座子表现出表 观遗传变异 epigenetic change 即某基因DNA序列并未变异 而基 因表型出现变化 转座子DNA序列的甲基化不仅影响转座子自身的表 达 而且还影响邻近基因也呈现出表观遗传变化 5 转座子标记克隆目的基因 基因克隆是研究基因结构和功能及基因转移的必要前提 目前常用的办 法是构建基因组文库或cDNA文库 然后从中筛选目的基因 可用的筛 选方法大多是建立在已知基因的表达产物的基础上进行的 然而对于发 育 生理和行为有关的一些调节基因及其产物往往是微量而且表达时间 短 不易分离 更难以提纯 何况调节基因的调控作用也不一定是通过 其基因产物参与调控 因此 分离这些基因就无法从蛋白质入手 其实 直到今日我们对很多基因表达的产物知之甚少 在基因产物未知的情况 下一般采用两种方法来分离控制发育的基因 一种是在特定的生理过程 或发育时期采用差别筛选 differential screening 来分离目的基因 称 之为减法杂交与差异筛选 subtraction hybridization and differential screening 另一种是转座子标记 transposon tagging 方法 该技术的原理是由于转座子序列可以在基因组中转座 如该序列转座正 好插入某一基因的外显子区域时 导致这一基因失活 结果表型改变而 成为突变体 如该突变是由于转座子的DNA克隆 其中必定会含有与该 突变体有关的基因 也就是说 用转座子给未知的目的基因加以标记 这样便于该基因的识别与分离 用该突变型提取DNA构建基因组DNA 文库 用标记的转座子序列作为探针 筛选出的克隆中 再对转座子两 端序列进行亚克隆 这是被转座子插入的基因序列 这些亚克隆又反过 来作为探针 用于筛选野生型个体的基因文库 获得完整的目的基因 应用转座子标记技术 在植物中已成功地克隆到几种调节基因 如调节 花色素苷合成的cl基因 抑制种子蛋白积累的Opaque 2基因 利用玉米 的转座子标记已克隆出雄性不育基因和抗病基因等 从克隆目的基因程 序可见 应用该技术的条件是 亲本之一必须含有活跃的转座子 所用的转座子必须已经分离和鉴定 否则无法对其进行标记作为探针 转座子插入后要有目的性状的突变型 由于转座子在突变型基因组中 插入的不定向 所以用转座子作为探针克隆到的基因并不只是预期的目 的基因 一般含有多种性状的突变类型 必须进行大量筛选 因此 该 项技术目前还只能应用于少数富含活跃转座子的植物 如玉米和金鱼草 等 6 转座因子作为基因工程载体 利用P因子作为载体 将外源基因转移到果蝇胚胎生殖系细胞中 对果 蝇进行遗传操作 将携带目的基因的缺陷P因子和完整的P因子同时注入 到胚胎的前胚盘 完整的P因子不仅能识别自身的末端序列 也能识别 缺陷P因子的末端而进行转座 结果两种P因子都被插入到基因组中 只 有P因子两末端之间的DNA序列才能被插入 两端外侧序列不是转座因 子的组成部分 不会被插入到基因组 因此该技术的优点是只插入一个 外源基因的拷贝 也就是说 所有转基因果蝇只携带一个拷贝的外源基 因 因而便于对其结构和功能进行研究 图6 55 利用P因子作为载体导入外源基因也只在适合的组织中和适当的发育时 期表达 并且表达与插入位点无关 对果蝇而言 基因座自身含有调控 基因表达所需的全部信息 基本不受外来因素干扰 由此可见 利用P 因子将外源DNA导入基因组 或者引入在体外构建或修饰过的新基因 或关闭内源性基因 研究它们的结构与功能和那些负责组织特异性表达 的机制与特征 并最终采用定位的方式替代基因组中的缺陷基因等都具 有重要意义 Ty因子也可用来作为载体 把基因转座到酵母基因组中的新位点上 将 待转座的基因插入到ORF2的3 端和3 delta 序列之间 只要插入的基因 没有转录终止信号 3 序列就会进行转录 这是转座的先决条件 这样的构建起放大盒的作用 因为一旦转入酵母 新基因就会转座到基 因组的多个位点上 6 简述染色质重塑的基本过程及其生物学功能 答 1 染色质重塑的概念 染色质重塑 chromatin remodeling 是表观遗传修饰中一种常见的方式 是指导致整个细胞分裂周期中染色质结构和位置改变的过程 此过程涉 及某些依赖能量供给的组蛋白修饰 从而导致许多蛋白 蛋白及蛋白 DNA的互作受到破坏 在染色质发生重塑的过程中 密集的染色质丝在 核小体连接处发生松懈造成染色质疏松 从而使启动子区中的顺式作用 元件得以暴露 为反式作用因子 转录因子 与之结合提供了空间接触 的可能 细胞基因组中的DNA通常并非处于裸露状态 而是与组蛋白一 起构成结构致密的染色质 故染色质结构状态的改变会影响基因的表 达 染色体重塑过程由两种蛋白复合体所介导 即ATP依赖型核小体重构复 合体和组蛋白修饰复合体 前者通过水解作用改变核小体构型 后者对 核心组蛋白N端尾部的共价修饰进行催化 染色质重塑是DNA修复和基因表达调控过程中的一个重要环节 染色质 重塑使染色质组织结构发生一系列重要的变化 如染色质去凝聚 核小 体变成开放式的疏松结构 使转录因子等更易接近并结合核小体DNA 从而调控基因转录等 论述题 1 有哪些方法可用于功能基因组学的研究 现在有何进展 答 随着多种生物全基因组序列的获得 基因组研究正在从结构基因组 学转向功能基因组学的整体研究 在功能基因组学的研究中通常运用高 通量技术 high throuput techniques 如DNA微阵列 DNA microarrays 反向遗传学 reverse genetics 技术如基因打靶 转基因 以及反义mRNA和RNA干扰等技术来系统地分析基因功能及基因间相互 作用 基因组的时空表达以及发现和寻找新基因等 1 DNA微阵列技术又称DNA芯片 DNA chips 或基因芯片技术 gene chips 它通过将对应于不同基因 或cDNA的DNA片段或寡聚 核苷酸点样于微芯片上形成高密度的矩阵 与荧光标记的总mRNA进行 杂交 然后通过激光共聚焦扫描检测并运用计算机软件对杂交信号进行 自动化定性定量分析 具有高通量 实时 灵敏 准确等特点 2 基因打靶是指通过转染的DNA序列与细胞内同源的基因组序列 靶序列 之间进行同源重组 以改变靶序列来研究其结构和功能或进 行基因治疗的技术 基因打靶技术包括基因敲除 knock out 和基因敲 入 knock in 前者是用无功能的DNA序列与靶序列重组 破坏原基因 组的遗传功能 后者是用有功能的DNA序列与受到破坏的靶序列重组使 其恢复遗传功能 基因打靶技术是一种从基因到表型的新研究方法 属 于反求遗传学范畴 3 反义mRNA技术通过向细胞导入一段与特定编码mRNA互补的非 编码RNA链 使其与该段mRNA特异性结合而定向阻抑靶基因表达的技 术 这一技术的成熟 为功能基因组学的研究和基因治疗提供了新的思 路 在反义mRNA技术的研究过程中 科学家们意外发现导入正义 mRNA sense RNA 与导入反义mRNA具有等效的阻抑效应 而更令 人吃惊的是如果导入相应双链RNA dsRNA 其阻抑效应比导入任一 单链RNA强十倍以上 dsRNA若经纯化则阻抑效应更强 这种双链 RNA特异性地作用于与其序列配对的基因而抑制其表达的现象叫做 RNA干涉 RNA干涉技术作为一种新的定点敲除knockdown技术 赋与 了功能基因组学 基因治疗等全新的思路 堪称生命科学近年来的革命 性的突破 因而发现RNA干扰机制的两位美国科学家Fire和Mello荣获 2006年诺贝尔生理学或医学奖 可见该项成果的重大科学意义 2 目前最常用的突变体创制方法有哪些 如何利用突变体进行功 能基因组学研究 答 突变体是遗传学研究的重要材料 其表型与基因型是基因功能研究 的直接证据 因此突变体的创制和特异突变体的筛选非常重要 已知突 变体可分为自发突变和人工诱变 自发突变不足以满足现代遗传学研究 的需要 诱发突变则可以利用人工的方法提高基因突变频率 在短时间 内创制大量突变体 还可以获得许多在自发突变下很难产生的新类型突 变体 基因诱变常用的化学诱变因素多为烷化剂 如EMS和N 甲基 N 亚硝基脲 methylnitrosourea MNU 等 物理诱变因素为电离辐射和快 种子等 生物诱变因素为转座子 逆转座子等 此外科研工作者还可通 过转基因 基因打靶等生物技术创制突变体 1 EMS突变体 EMS处理生物材料可使DNA的鸟嘌呤第六位酮基烷化而形成O6 乙基鸟 嘌呤 而O6 乙基鸟嘌呤可以与腺嘌呤配对而不能与胞嘧啶配对 因 此 原来DNA中的G C对通过随后的修复变为A T 通常EMS诱发突变 99 为C T突变 导致C G变为T A碱基替换 EMS也可以通过水解第七 位的7 乙基鸟嘌呤诱发极低频率的G C向 C G 或 G C 向T A的碱基替 换 或由于3 乙基腺嘌呤错配导致A T向G C转变 然而 也有报道EMS 处理也可以导致染色体的异常 如DNA片段缺失等 EMS诱发的特点是突变均匀分布于整个基因组中而不呈现明显的 热 点 根据模式植物拟南芥菜基因组的碱基组成情况 EMS引起的转录 提前终止突变约为5 而错义突变约为65 因此 我们不仅仅可以通 过EMS造成转录提前终止的功能缺失突变体来研究基因的功能 也可以 通过错义突变引起的一些表型较弱 中间类型的突变体来研究功能蛋白 中某个特定氨基酸残基的功能 EMS诱变操作简便 诱变效率高 可在一个基因组上产生多个突变位 点 只需要较小的突变群体就可以获得饱和的突变体库 对供体材料没 有特殊要求 适用于任何物种 同时可以获得转基因或转座子引起的插 入诱变的等位突变 是转基因或转座子引起的插入诱变技术的补充 因 此 EMS已经应用于许多不同物种的诱变 如果蝇 Drosophila Melanogaster 线虫 Caenorhabditis elegans 拟南芥菜 Arabidopsis thaliana 水稻 Oryza Sativa 等 但是 利用EMS进 行诱变也具有一定的缺点 首先EMS是一种很强的挥发性诱变剂 进行 诱变处理时一定要注意安全 其次 检测EMS突变位点比较困难 技术 上也比较复杂 需要构建遗传群体 通过图位法将突变位点逐渐定位在 一定的区域 最后通过对这段DNA序列进行测定而获得 此外EMS诱 变会在一个基因组上产生多个突变位点 使得后续分析时需要进行连续 的回交实验 诱变剂量 即EMS的浓度和处理时间 会直接影响突变体的诱发效率 以水稻 拟南芥种子诱发突变为例 首先要确定EMS的半致死剂量 在 固定处理时间的前提下EMS浓度越高基因突变的密度也就越大 国际水 稻研究所Hei Leung利用1 6 的EMS诱发的突变密度约为每1Mb一个突 变位点 由此可以推测整个水稻基因组 430Mb 上同时产生了四百多 个突变位点 比1 0 的EMS诱发突变的密度高了近一倍 而固定EMS浓 度的前提下处理时间越长突变位点也就越多 如胚致死频率和白花苗出 现的频率上升 浓度过高或处理时间过长都会导致种子萌发率下降 生 长发育迟缓 不育等问题 影响后续研究 另外过度的诱变处理可导致 基因组上的突变位点过于密集 增加后续分析回交实验的难度 因此诱 变处理需要在一个合理的范围内进行 2 快中子突变体 电离辐射是原子核发生衰变时所放出的射线 种类很多 主要有 射线 其本质是氦的原子核 穿透能力弱 在生物组织中穿透只有 几十微米 射线 一种电子流 其穿透能力较 粒子强 在生物组织中达数个毫 米 射线 有时也称为 光子 是不带电的粒子 比 粒子小 有很强 的穿透能力 n射线 也就是中子流 不带电 几乎不能与原子的电子相互作用 只能和原子核相互作用 一般中子源发出的中子为快中子 能量比较 高 质量小 速度快 穿透能力极强 电离辐射的直接作用是 射线或带电粒子作用生物体 从细胞中各种原 子成分的外层击出电子 产生很多离子对 引起细胞内 或DNA 原子 或分子的电离和激发从而引起遗传物质的改变 同时产生对细胞的辐射 化学效应 细胞内物质吸收辐射能量的主要是水分子 造成 水的射解 作用 形成离子和自由基 自由基能互相反应 并能和其他分子发生 反应 结果形成辐射的间接作用 H 和OH 这些分子与细胞中的核 酸 蛋白质 酶等大分子物质发生化学变化时 水的射解就具有生物效 应了 电离辐射的生物学效应就是导致水分子产生OH自由基 这种自 由基具有非常高的化学活性 能与DNA 蛋白质 脂类物质以及细胞膜 反应 造成细胞 细胞质的损伤甚至死亡 基因组DNA的缺失是电离辐 射造成生物诱变最常见的结果 总体来讲辐射能量越大 缺失的片段也 就越大 例如 射线往往引起1kb以下的DNA片段缺失 而快中子引起的 DNA片段缺失一般在5kb以下 可达60 有时则可达10kb以上 电离辐射广泛用于植物 动物和微生物的诱变育种 到2000年为止利用 电离辐射创造了超过2200个的作物新品种 其中水稻新品种就有400多 个 由于快中子具有能量高 辐射处理的剂量容易控制和操作简便等特 点 在生物诱变上具有独到的优点 如对子粒较大的玉米 大豆和营养 繁殖的植物如香蕉 马铃薯等进行诱变的效率较高 诱变的剂量 强度 和时间 容易控制 在一个基因组上可以存在多个突变位点 同时诱变 后生物材料仍保持较高的活性 如Hei Leung等利用250GY剂量的 射线 和33GY剂量的快中子处理水稻种子 M1种子仍具有90 和70 的萌发 率 诱变后的材料可以不经过任何处理直接进行筛选 3 T DNA标签突变体 T DNA标签技术是以农杆菌介导的遗传转化为基础的一种插入突变研究 方法 由于农杆菌的寄主范围较广 转化技术成熟 故是创造插入突变体 的有效途径 与转座子标签技术相比 该法的最大特点是插入后较稳 定 在获得稳定的突变表型后 可用报告基因为探针在突变体文库中克 隆相应的功能基因 若插入的片段内包括大肠杆菌的复制起点 则可通 过质粒挽救的方法克隆插入序列两翼的植物基因片段 T DNA插入的另 一特点是如果插入的是无启动子的抗生素抗性等报告基因 而T DNA插 入植物启动子附近 就可导致外源报告基因的表达 从而可在细胞或组 织水平上进行筛选 创建T DNA标签插入突变体库需要两个前提条件 第一是需要建立简 便 高效的农杆菌介导的遗传转化体系 这并不是在所有