（植物学专业论文）利用est技术克隆莲（nelumbo+nucifera+gaertn）热激蛋白基因.pdf

符同浩利用b s t 技术克隆莲熬i i l 蛋白基因中山大学项士学位话文 2 0 0 5 利用e s t 技术克隆莲 n e l u m b on u c i f e r ag a e r t n 热激蛋白基因 中山大学生命科学学院 广州5 1 0 2 7 5 摘要 莲作为地球幸存的冰期以前的古老植物之一 它与水杉被称为 中国的两种 绝妙植物 莲子有 4 个最 种子寿命最长 种子耐热性最高 莲胚f e s o d 稳定性最高 种子抗衰老的修复能力最强 为了克隆中国莲的热激蛋白基因 构建了萌发3 d 经4 2 2 热激2 h 的莲胚轴 c d n a 文库 随机挑选单克隆 获得可分析的2 8 7 个e s t 序列 其中1 7 0 条 5 9 5 的e s t 属于已知功能的基因 萌发莲胚轴在4 2 c 下热处理2 h 后 热激蛋白基因丰富表达 分离到2 个 i a h s p s 和6 个s m h s p s 等热激蛋白e s t 序列 占全部测定e s t 的2 8 分离到莲h s p l z 5 基因的全长e d n a 长度为9 0 1 b p 5 非编码区为1 6 5 b p 开放读码框为4 6 8 b p 3 非编码区为2 6 8 b p n n h s p l 7 5 基因编码1 5 6 个氨基酸 分子量 姗 为1 7 5 4 4 1 7d a 等电点 p i 为6 6 1 利用半定量r t p c r 技术 分析了莲种子萌发过程中热激蛋白基因的表达 n n h s p l z5 基因表达结果表明 热激的干种子胚轴 吸胀l h n n h s p l z5 基因表 达量比未热激的干种子胚轴 吸胀l h 明显增加 吸胀1 d 的胚轴 对照 n n i i s p i z 5 基因表达量比热激的胚轴 吸胀l d 高很多 莲胚轴吸胀2 d 和3 d 后 热激增加了n n h s p l 7 5 基因表达 n n h s p l z5 n n s h s t 蛩i i 2 和n n s t t s p c i i 3 都属于细胞质二型s m h s p 然而 肋叫s 彤 誓和肋幽即吁 书在莲种子萌发中 的表达模式与n n h s p l 7 5 的不同 吸胀l d 内 莲胚轴莲n n s h s p c i i 2 和 n n s h s p c i l 3 基因在热激下表达量并没有增加 吸胀2 d 后 热激的莲胚轴 n n s h s p c i i 2 和m 幽印日 书的表达量均升高 吸胀3 d 时热激的莲胚轴 n n s h s p c i i 2 的表达量增加更显著 以上结果表明吸胀2 d 和3 d 后莲胚轴被热激 符同浩利用b s t 技术克隆莲热激蛋白基因中山大学硕士学住论文 2 0 0 5 后3 个s m t t s p 基因表达均升高 n n h s p l 7 5 基因在吸胀l d 内的表达除了受热激 诱导外 还可能受其它因素的诱导 值得进一步研究 莲种子萌发过程中 热激处理的和非热激处理的莲胚轴n n t l s p 7 0 和n n h s p g o 基因都有表达 但是热激处理的表达量比对照的高 关键词 莲e d n a 文库表达序列标签热激蛋白半定量r t p c r i i 符同浩 利用b s t 技术克隆莲热漱蛋白基因中山大学硕士学位论文 2 0 0 5 m o l e c u l a rc l o n i n go fs a c r e dl o t u sg e n e se n c o d e dh e a t s h o c kp r o t e i n sb ye x p r e s s e ds e q u e n c et a g t o n g h a of u s c h o o lo f l i f es c i e n c e s s u ny a t s e nu n i v e r s i t y g u a n g z h o us 1 0 2 7 5 a b s t r a c t s a c r e dl o t u s n e l u m b on u c i f e r ac r a e r t n ap r i m i t i v ea n g i o s p e r ma n do n eo f t h eo l d e s tp l a n t ss u r v i v a l 丘o mi c ea g e w a sr e g a r d e da s t w ow o n d e r f u lp l a n t s i nc h i n a t o g e t h e rw i t hm e t a s e q u o i ag l y p t o s t r o b o i d e s s a c r e dl o t u ss e e d sw e r e r e c o g n i z e ds c i e n t i f i c a l l ya st h es e e d sw h i c hh a dt h el o n g e s tl i f es p a na n dt h e h i g h e s th e a tr e s i s t a n c e i no r d e rt oi s o l a t et h es a c r e dl o t u sg e n e se n c o d i n gh e a ts h o c kp r o t e i n s a e d n a l i b r a r yw a sc o n s t r u c t e du s i n ge m b r y o n i ca x e sg e r m i n a t e df o rt h r e ed a y s a n dh e a ts h o c kf o r2h o u r sa t4 2 c 2 8 7r a n d o m l yc l o n e s 丘o mt h ee d n a l i b r a r y w e r es e q u e n c e da n da n a l y z e d w h i c hs h o w e d1 7 0e s t s 5 9 o ft h e s eh a d h o m o l o g i e sw i t ht h eg e n e sk n o w nf u n c t i o n t w ot a h s pa n ds i xs m h s pe s t s e q u e n c e sw e r ei s o l a t e d o n eh e a ts h o c kp r o t e i ng e n en n h s p l z 5w i t hf u l l l e n g t he d n a 9 0 1 b p w a si s o l a t e d t h ee d n ac o n t a i n e da l lo p e nr e a d i n gf i a n a eo f4 6 8n u l e o t i d e s f l a n k e d5 b y1 6 5b a s e so f n o n c o d i n gs e q u e n c ea n d3 b y2 6 8b a s e so f n o n c o d i n g s e q u e n c ea n de n c o d e dap e p t i d eo f15 6a m i n oa c i d s t h ec a l c u l a t e dm o l e c u l a r w e i g h ta n di s o e l e c t r i cp o i n tw e r e17 5 4 4 17d a a n d6 61r e s p e c t i v e l y e x p r e s s i o no f h e a ts h o c kp r o t e i ng e n e si ng e r m i n a t i n gs a c r e dl o t u sa x e sw a s d e t e r m i n e db yr t p c r t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h en n h s p i7 5g e n ee x p r e s s e d o b v i o u s l yh i g h e ri nd r ye m b r y o n i ca x e s i m b i b i t i o nf o ro n eh o u r c o m p a r i n gt o l l l 符同浩利用f i s t 技术克隆蓬热漱蛋白基因中山大学项士学位论文 2 0 0 5 t h e s ew i t h o u th e a ts h o c kt r e a t m e n t n n h s p lz 5g e n ee x p r e s s i o ni no n ed a y g e r m i n a t e de m b r y o n i ca x e sw a sh i g h e rt h a nt h o s ew i t hh e a ts h o c kt r e a t m e n t h o w e v e rh e a ts h o c ki n c r e a s e dt h en n h s p lz5g e n ee x p r e s s i o ni ne m b r y o m c a x e s g e r m i n a t e d f o rt w oo rt h r e e d a y s n n h s p l7 5 n n c h s p c i l 2 a n d n n c h s p c i l 3b e l o n gt oc y t o p l a s m i cc l a s si is m a l lh e a ts h o c kp r o t e i ni nh i g h e r p l a n t s b u tn n c h s p c i l 2a n dn n c h s p c i i 3e x p r e s s i o np a t t e r n sw e r en o tt h e s a m ea sn n h s p l7 5 n n c h s p c i i 2a n dn n c h s p c i i 3e x p r e s s i o ni ns a c r e dl o t u s e m b r y o m ca x e sd i d n tc h a n g eo b v i o u s l yd l l r i n gi m b i b r m nf o ro n ed a y t h e s e t w og e n e se x p r e s s i o ni n c r e a s e do b v i o u s l yb yh e a ts h o c ka f t e ri m b i b i t i o nf o r2t o 3d a y s h e a ts h o c ka l s oi n d u c e di n c r e a s eo f n n h s p 7 0a n dn n h s p 9 0e x p r e s s i o n d u r i n gg e r m i n a t i o no f s a c r e dl o t u s s e e d s k e yw o r d s s a c r e dl o t u s n e l u m b on u c i f e r ag a e r t n h e a ts h o c kp r o t e i n s e d n ah b r a r y e x p r e s s e ds e q u e n c et a g g e n ee x p r e s s i o n 符同浩 利甩e s t 技术克隆莲熟激蛋白基因中山太学硕士学位论文2 0 0 5 缩略语表 a m pa m p i c i l l l n b l a s tb a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o l b p b a s e p a i r c y sc y s t e i n e d e p c d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e d m s o d i m e t h y ls u l f a t e d n t p d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e d s e d n ad o u b l e s t r a n d c o m p l e m e n t a r y d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d t t d i t h i o t h r e i t o i e b e t m d i u mb r o m i d e i p t g i s o p r o p y l 一1 t h i o b d g a l a c t o s i d e k bk i l ob a s ep a i r k dk i l od a l t o n m e t r n e t h i o n i n e p a g e p o l y a e r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r a c e r a p i da m p l i f i e do f c d n ae n d s s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e s s e d n a 出g l e s t r 锄dc o m p l e m e n t a r y d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d u v u l t r o v i o l e t v 氨苄青霉素 局部相似性基本查询工具 碱基对 半胱氨酸 焦碳酸二乙酯 二甲基亚砜 脱氧核苷三磷酸 双链互补d n a 二硫苏糖醇 溴化乙锭 异丙基一硫代一b d 半乳糖苷 千碱基对 千道尔顿 甲硫氨酸 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚合酶链式反应 e d n a 末端快速扩增 十二烷基硫酸钠 单链互补d n a 紫外 符同活利用b s t 技术克隆莲熬漱蛋白鲞目中山大学硬士学位论文2 0 1 1 5 1 前言 1 1 热激蛋白的功能及其调控 热激蛋白 h e a ts h o c kp r o t e i n s h s p s 又称热休克蛋白或应激蛋白 h e a t s t r e s sp r o t e i n s 是细胞在应激源 如高温 刺激下所生成的一组蛋白质 r i t o s s a 于1 9 6 2 年首先在果蝇中发现这种现象 若将果蝇的培养温度从2 5 升 高到3 0 热刺激温度升高 3 0 r a i n 后就可在多丝染色体上看到蓬松现象 或称 膨突 表明这些区域基因的转录加强并可能有某些蛋白质合成的增加 十几年 后t i s s i e r e s 1 9 7 4 发现热激蛋白 t i s s e r e s 从热激果蝇幼虫的唾液腺等部 位分离到了6 种新的蛋白质 即h s p 1 9 9 2 年h o r w i t z 提出小分子量h s p s h s p 是分子伴侣的理论 1 1 1h s p s 的分类 定位和多样性 根据分子量的大小将h s p s 分成h s p l1 0 s h s p 9 0 s h s p 7 0 s h s p 6 0 s 和分子 量在1 5 3 0k d 之间的l m wh s p s 1 0 wm o l e c u l a rw e i g h th s p s 或s m t t s p s s m a l lh s p s h s p 6 0 s 以上的又统称h 姗h s p s h i g hm o l e c u l a rw e i g h th s p s 或l a h s p s 1 a r g eh s p s 在真核生物中 只有在高等植物中才发现h s p l 0 0 的 同源蛋白 h m wh s p s 可分为两类 一类为胞质c l p 蛋白 另一类为质体c l p 蛋 白 s c h i r m e r 等1 9 9 4 从拟南芥和大豆胞质中分离到的c l p 蛋白分别被称为 a t h s p l 0 1 s c h i r m e r 等1 9 9 4 和g m 4 s p l o t l e e 等1 9 9 4 在某些植物中h s p 9 0 由一个多基因家族编码 包括5 6 个成员 在热激下诱导显著 y a b e 等1 9 9 4 此外 植物的h s p 9 0 还受发育时空的调节 如某些h s p 9 0m r n a 的量在根冠 芽 端 花和发育花粉中特别高 y a b e 等1 9 9 4 在高等植物的细胞质 叶绿体中都 有h s p 7 0 存在 g i o r i n i 等1 9 9 1 k ok 等1 9 9 2 黄上志等 2 0 0 0 用4 0 热激 卷心菜种子 观察到9 7k d 6 6k d 4 5k d 2 9k d 2 4k d 1 4k d 热激蛋白的存 在 s m h s p s 包括细胞质i 类s m l t s p s 细胞质i i 类s m h s p s 叶绿体s m h s p s 线 粒体s m h s p s 和内膜s m l t s p s 等五类约2 0 多种s m h s p s 蛋白 这些s m h s p s 大小 差别很大 1 20 0 0 3 00 0 0k d a 分布在细胞质 内质网 叶绿体和线粒体等细 符同浩 利用b s t 技术克隆莲燕漱蛋白基罔中山大学硕士学位论文 2 0 0 5 胞器 n o v e r1 9 9 4 v i e r l i n g1 9 9 1 w a t e r s 等1 9 9 6 遗传分析表明植物 中如此多的s i i l h s p 是从进化过程中的基因复制而来的 w a t e r s 等1 9 9 6 除热 激外 正常生活的细胞中也有h s p s 这类h s p s 是组成型表达的 称为h s c h e a t s h o c kc o g n a t ep r o t e i n h s c 和诱导型h s p 在结构和功能上很难区分 统称 h s p u b i u b i q u i t i n 遍在蛋白 是一种依赖a t p 促进细胞蛋白质水解的小分 子量热激蛋白 l i n d q u i s t 和c r a i g1 9 8 8 v i e r l i n g1 9 9 1 p d i p r o t e i n d i s u l p h i d e i s o m e r a s e 蛋白质二硫键异构酶 也被认为是一种热激蛋白 目前 发现热激蛋白定位于细胞的多种细胞器 包括细胞质 叶绿体 线粒体和内膜系 统 v i e r l i n g1 9 9 1 1 1 z 热激反应的特点 通常h s p s 诱导合成的持续时间较短 植物h s p l l 0 比其它h s p s 合成的时间 更短 主要在热激的第1 小时合成 v i e r l i n g1 9 9 1 大豆幼苗热激时3 5m i n 就 可检测到大豆幼苗h s pm r n a s 的积累 l 2h 达到高峰 6h 后显著下降 1 2h 就 检测不出了 k i m p e l 等1 9 9 0 放射性标记显示 氨基酸渗入h s p s 在4h 达 到高峰 随后下降 但2 8 和4 0 c 自u 入氨基酸类似物a z e a z e t i d i n e c a r b o x y l i c a c i d a z e 三甲叉亚胺甲酸 1 2h 后h s p s 合成仍不变 a z e 和高温诱导h s p 合 成的机理可能不同 l e e 等1 9 9 4 然而 热激蛋白的诱导因子不仅局限于高 温 其他环境胁迫也可以提高它的含量 c e l l e r 等 1 9 9 8 指出 植物在干旱情 况下合成的脱水蛋白 d e h y d r i n s 中的一个亚类属于l e a 蛋白 1 a t e e m b r y o g e n e s i sa b u n d a n tp r o t e i n s 家族 而与小分子量热激蛋白具有很高的同 源性 陈忠等 1 9 9 9 的研究表明 p e g 可以提高h p c 6 0 的表达水平 其最强诱导 能力与3 8 热激相近 除此之外 砷化物 高盐 氧化剂和辐射胁迫都可以诱导 热蛋白的表达 h o l l a n d 等1 9 9 8 1 1 3 热激蛋白的功能 1 1 3 1 热激蛋白与生物的耐热性 许多研究已经表明 高温热激下产生的h s p 可以提高植物的耐热力 j a b o k 等 1 9 9 3 在体外热变性实验中证明 l m wh s p s 可阻止葡萄糖氧化酶和柠檬酸 符同浩 利用e s t 技术克隆莲热囊蛋白基目中山大学硕士擎位论文 2 0 0 5 合成酶的热变性 而且还可加速这些变性的蛋白质复性 s h r a v a n 等 2 0 0 2 把 编码h s p l 6 1 的转录因子h s fa1 基因转入蕃茄中 在热激条件下 h s f aj 的 表达量为对照的l o 倍 并且获得了一定的耐热能力 刘箭等 2 0 0 1 利用转基 因方法 将线粒体小分子热激蛋白基因导入烟草 导入烟草的线粒体小分子热 激蛋白基因可在烟草细胞中组成性地表达 转基因烟草线粒体的氧化磷酸化效 率高于对照 说明线粒体小分子热激蛋白对线粒体具有保护作用 砷 丙二酸可 诱导高梁的小苗产生h s p 砷和丙二酸处理后的高粱小苗具有较强的耐热力 这就间接表明了h s p 与植物耐热力有关 b a n e y x 等1 9 9 5 在非胁迫条件 下 s m i t s p s 在高等植物的营养组织中几乎检测不到 但在热激胁迫下s m h s p s 表 达量可提高2 0 0 倍以上 成为主要蛋白组分 a r r i g o 等1 9 9 4 刘箭等 2 0 0 1 研究证实线粒体小分子热激蛋白可以减缓柠檬酸的热变性 并促进热变性的柠 檬酸合成酶活性 说明高温下线粒体小分子量热激蛋白对柠檬酸合成酶有保护 功效 s m h s p s 蛋白的积累量随着热激温度与持续时间的增加而增高 其最高表达 量出现的时闻恰恰在胁迫程度最强时 而且半衰期特别长 a r r i g o 等1 9 9 4 这暗 示s m h s p s 在植物热激后的恢复过程中有重要作用 s h a r o n 等 2 0 0 0 研究表明 小分子量热激蛋白和植物的耐热性有很大关系 但是小分子热激蛋白对具体的 细胞区域的保护和修复还不很明确 叶绿体小分子量热激蛋白和线粒体小分子 量热激蛋白可咀保护电子传递和光系统i i p s l i 避免受到高温伤害 陈忠等 1 9 9 8 用不能合成h s p 的突变体 h s p 7 0 合成受阻遏的细胞以及不能合成 h s p 7 0 的细胞为材料 发现热激时这些细胞对热敏感性增加甚至死亡 j o r g e 等 2 0 0 2 研究还发现转基因烟草花粉粒高温萌发率也高于对照 说明线粒体小分 子量热激蛋白可以提高细胞的抗热能力 把h s p l 0 0 ct p b 基因转入大豆中 在 热激下h s p l 0 0 c i p b 蛋白基因不断地表达 清楚地表明了h s p i o o c i p b 蛋白基 因对热激的响应 s h a r o n 等2 0 0 0 在非胁迫条件下 a t h s p l o l 和g m h s p l 0 1 的 m r n a 在植物营养组织中检测不到 但热激胁迫后迅速积累 s c h i r m e r 等1 9 9 4 l e e 等1 9 9 4 说明这两种蛋白与植物的胁迫响应关系密切 采用酵母h s p l 0 4 2 基因互补实验证实a t h s p l o l 和g m h s p l 0 1 均可以部分恢复h s p l 0 4 2 突变的酵母 的耐热能力 s c h i r m e r 等1 9 9 4 这间接证实h s p l 0 0 蛋白在植物抗高温中起 作用 玉米在热胁追下 可以诱导h s p i o i 的产生 可以提高玉米的耐热性 研 符同浩利用b s t 技术克隆莲热澈蛋白基因中山大学硕士学位论文 2 0 0 5 究发现 在热胁迫后 恢复玉米的最适生长温度 h s p l 0 1 在3d 以后消失 j o r g e 等2 0 0 2 1 1 3 2 热激蛋白与植物的抗冷性 h s p 的主要功能是提高植物的耐热性 但越来越多的研究证实h s p 与植物 的耐冷性的提高存在明显相关 但耐冷性的提高大部分需高温诱导彳 能实现 冷 胁迫可以诱导植物h s c 7 0m r n a 和特异蛋白质合成 但也有耐冷性和非耐冷性植 物都有h s p 7 0 的积累的报道 g u y1 9 9 0 v i e r li n g1 9 9 1 高温热激和化学物 质处理可增强冷敏感植物和组织的耐冷性已有不少报道 c o l l i n s 等1 9 9 3 番茄经3 8 y 2 处理合成分子量为1 8 2 3 和7 0k d 的新蛋白质在低温下也能继续合 成 只是合成速度较慢 s a b e h a t 等1 9 9 5 分离的番茄果实h e f t 2 基因只被高 温诱导 经高温处理的番茄果实在2 下储存两周 h o l t 2 基因编码的h s p 仍在 高水平表达 果实的耐冷性也高 c o l l i n s 等1 9 9 3 c o l l i n s 等 1 9 9 5 首先 证实了h s p 和耐冷性的直接关系 油梨经3 8 处理的耐冷性比3 4 和3 0 处理的 耐冷性强 提取3 8 c 处理的油梨m r n a 于h s p 7 0 和h s p l 7c d n a 作n o r t h e r n 杂 交 其杂交信号强于3 4 c 及3 0 c 处理 4 0 c 处理的最强 而未经处理的则没有杂 交信号 果实不能产生耐冷性 w o o l f 等1 9 9 5 水稻热激蛋白h s p l l 0 也可对 低温应答而积累 s i n g l a 等1 9 9 7 在马铃薯中观察到低温处理可以诱导植物 小热激蛋白的转录物积累 s m h s p 具有分子伴侣的功能 j a c o b 等1 9 9 3 m e r c k 等1 9 9 3 这些蛋白能以没有a t p 参与的方式重新折叠变性蛋白 m e n d r i c k 等 1 9 9 3 将黄瓜子叶罱3 7 c 或4 2 c 处理6h 诱导产生了5 个i t s p 分子量分别为 2 5 3 8 5 0 7 0 和8 0k d 这些h s p 的出现与抗冷性的增强恰好吻合 l a f u e n t e 等1 9 9 1 低温引起的生理变化会促进蛋白变性 h s p 可能具有稳定功能 帮助 冷胁迫造成的变性蛋白进行重新折叠 以恢复其功能 刘良式1 9 9 8 在甘蓝 型油菜中发现一种热激蛋白h s p 9 0 基因可被低温诱导 k r i s h n a 等1 9 9 5 大 豆中编码2 7k dh s p 的r n a 在冷处理的大豆中提高了 k u z n e t s o v 等1 9 8 7 菠菜在冷驯化处理过程中积累了分子量为7 9k d 的蛋白质与h s p 有很高的同源 性 g u y 等1 9 9 0 y a c o o b 等用蛋白质印迹法分析受冷激的玉米 发现其积累 了h s p 并且既有高分子量的也有低分子量的 y a c o o b 等1 9 8 6 y a c o o b 等 4 符同浩 利用h s t 技术克隆莲熬激蛋白基因 中山大学硕士学住论文 2 0 0 5 1 9 8 6 l 1 3 3 热激蛋白具有分子伴侣作用 分子伴侣 m o l e c u l a rc h a p e r o n e s 是指与新生肽链的折叠 寡聚蛋白质的 组装和蛋白质的跨膜运输有关的一类特殊蛋白质分子 h s p 6 0 最早被称为分子伴 侣 目前已经证明h s p 9 0 h s p 7 0 s m h s p s 都具有分子伴侣作用 高等植物的多数h s p 6 0 成员在非胁迫下都有组成型表达 这些h s p 6 0 蛋白 以依赖a t p 的方式参与新生肽的折叠过程 h a r t l1 9 9 6 其中最重要的h s p 6 0 成员为叶绿体中的r u b i s c o 亚基结合蛋白 它能与新合成的r u b i s c o 大 小亚基 结合 防止它们发生不正确的聚集 e l l i s1 9 8 1 豌豆离体h s p 6 0 由分子量约 6 1k d 和6 0k d 的两种亚基组成7 2 0k d 的复合体 r o y1 9 8 9 主要参与r u b i s c o 全酶的装配 如果向叶绿体提取液中加入结合蛋白的抗体 就会阻止r u b i s c o 大 亚基组装成全酶 c a n n o n 等1 9 8 6 消耗掉溶液中的a t p 也影响r u b i s e e 大 亚基向全酶的转化 由此可见 r u b i s c o 亚基结合蛋白在行使功能时需要a t p 提 供能量或引发构象的改变 c a n n o n 等1 9 8 6 植物r u b i s c o 全酶由2 类1 6 个 亚基组成 8 个由叶绿体基因编码的大亚基和8 个由核基因编码的小亚基 新合 成的大亚基首先和h s p 6 0 结合才能装配成全酶 h e m m i n g s e n 等1 9 8 6 l u b b e n 等发现 r u b i s c o 亚基结合蛋白在体外可以与用放射性同位素标记合成的线粒体 多肽 如铁氧还蛋白 超氧化物歧化酶 结合 因此推测r u b is c o 亚基结合蛋白 的功能不仅局限于r u b i s c o 的组装 可能还象线粒体h s p 6 0 一样负责叶绿体内 蛋白的折叠 组装 l u b b e n 等1 9 8 9 植物h s p 7 0 蛋白既有组成型表达的 也有 受各种胁迫诱导而高表达的 b o o r s t e i n 等1 9 9 4 热激诱导的h s p 7 0 的量比细 胞中原有的少得多 诱导h s p 7 0 蛋白高表达的因素很多 如高温 低温 以及其 它导致蛋白错误折叠或影响蛋白分泌的胁迫因素都可以诱导h s p 7 0 大量合成 v i t a l e 等1 9 9 5 c a b a n e 等1 9 9 3 k a l i n s k i 等1 9 9 5 在体外利用大肠杆菌 的d n a k 监护蛋白系统的研究中发现 它可与胞质 线粒体和内质网中大量的解折 叠蛋白结合 在a t p 存在下可以恢复变性蛋白的活性 于是推测在胁迫条件下植 物的h s p 7 0 可能具有类似的功能 大豆种子干旱脱水时会出现变性蛋白 而变 性蛋白出现会诱导7 0k d a 热激蛋白的合成 h s p 7 0 合成能使已变性的蛋白恢复 活性 使细胞功能恢复正常 p e l h a m1 9 8 6 所有高等真核生物高温胁迫时产生 符同浩利用b s t 技术克隆莲搞激蛋白基因中山大学硕士学位论文 2 0 0 5 的h s p t o 主要定位于核仁 恢复时再从新分布于细胞质中 l i n d q u i s t 等 1 9 8 8 热激时i t s p 7 0 和热变性蛋白结合 当热激恢复时 通过水解a t p 促使蛋自 质的折叠和组装 从而恢复活性 p e l h a m 等1 9 8 6 最近有人发现c l p c 可以与叶 绿体蛋白的前体共沉淀 推测它可能还参与叶绿体多肽的跨膜转运 n i e l s e n 等 1 9 9 7 1 1 3 4 热激蛋白在植物种子发育中的作用 s m h s p s 除受胁迫诱导外 还受内源调控信号的调节 d e r o c h e r 等1 9 9 4 w a t e r s 等1 9 9 6 k o b a y a s h i 等1 9 9 4 最明显的例子是在花粉减数分裂时期 及种子成熟过程中s m h s p s 的表达 d e r o c h e r 等1 9 9 4 k o b a y a s m 等1 9 9 4 s m h s p s 在种子成熟阶段的表达发生在种子成熟的后期 这时细胞分裂已经停止 种子开始适应脱水以及尔后的长时间保存 在向日葵中 i 类s m h s p s 的积累与 种子脱水过程一致 而i i 类s m h s p s 的表达大体上与储存蛋白和脂类的积累同步 这暗示s m h s p s 的积累可能对种子耐受脱水过程以及吸胀后的萌发是十分重要 的 d e r o c h e r 等1 9 9 4 w a t e r s 等1 9 9 6 a t h s p l 0 1 蛋白伴随着种子的贮藏进 程也大量累积 种子萌发后它在营养组织中则逐渐消失 这一点与s m h s p 在种子 成熟过程中的积累现象十分相似 暗示h s p l 0 0 可能在种子发育过程中具有重要 作用 d e r o c h e r 等1 9 9 4 大豆热激蛋白的研究开始于1 9 8 2 年 经高温处理 4 3 4 5 后 发现大豆胚中出现某些热激m r n a 另外发现在种子中出现 1 5 1 6 k d a 2 1k d a 7 5k d a 热激蛋白 m i t c h e l l1 9 8 5 c z a r n e c k a1 9 8 5 大豆 种子干旱脱水时会出现变性蛋白 而变性蛋白出现会诱导7 0k d a 热激蛋白的合 成 h s p 7 0 合成能使已变性的蛋白恢复活性 使细胞功能恢复正常 p e l h a m 1 9 8 6 张性坦等 1 9 9 7 研究发现大豆京黄3 号品种不管在任何年份 h s c 3 5 合 成后很快消失 在成熟种子中缺少h s c 3 5 1 1 3 5 热激蛋白在植物减数分裂中的作用 人们在研究众多植物的h s p s 时 发现雄性不育植株的热激反应更有其特殊 的表现 和雌性组织不同 成熟花粉没有热激反应 w e h m e y e r 等1 9 9 6 c h e n j i a n n a n 等 1 9 9 6 研究发现 在常温条件下 高粱不育系线粒体中缺乏 线位体 6 符同活刺用e s t 技术克隆莲燕数蛋白基因 中山太学硕士学位论文 2 0 0 5 数目大幅度减少 花粉发育缺乏能量供应 造成花粉败育 高粱不育系花粉母细 胞线粒体中缺少h s c t o 当温度升高 4 0 4 5 后 线粒体中出现了h s p 7 0 线 粒体数目增加8 倍 与可育系相近 保证了花粉发育的能量供应 不育系由不 育变成了可育 从而表明 高梁不育系线粒体中缺少h s c 7 0 很可能是造成雄性 不育的原因 t h e n 等1 9 9 6 陈建南等1 9 9 7 w a r m k e 等 1 9 7 8 发现玉米在花粉 形成期 线粒体数目增加了4 0 倍 才能保证花粉发育的能量供应 保证了玉米 的正常花粉的形成 1 9 8 9 年 f r o v a 等 1 9 8 9 证明在花粉萌发过程中 合成h s p 的能力是逐渐丧失的 单核花粉粒热激反应最强 g a 9 1 i a r d i 等 1 9 9 5 研究显示 h s p 合成能力逐渐丧失是由于没有h s p sm r n a 的积累 所以 玉米花粉的热敏感 性可能是从单核到双核花粉粒的转变开始 合成h s p s 的能力逐渐下降 花粉成 熟时完全丧失 从单核到双核花粉粒的转变是花粉发育的一个重要阶段 其特征 是 早期 花粉基因表达关闭 晚期 花粉基因开始表达 m a g n a r d 等1 9 9 6 因此h s p 合成能力的变化尤为值得注意 但也有一些研究表明玉米花粉萌发对 高温敏感存在遗传差异 总之 植物雄性不育的育性转变现象 以及不育系对热 激的反应 可能存在某种特殊的联系 其机理还有待于从发育生理和分子生物学 方面作更深入的研究 1 1 4 热激蛋白基因表达的调控 热激时h s p 基因转录被激活 多数正常蛋白质基因的转录被抑制 同时正常 温度下存在的大多数m r n a 的翻译降低或停止 生物体优先翻译h s pm r n a s 合 成h s p s 迅速对热激作出反应 b r o d l1 9 8 9 g u r l y 和k e y1 9 9 1 植物h s pm r n a 的快速积累主要是由h s p 基因转录水平提高所致 k i m p e l1 9 9 0 高温是热激 蛋白的主要诱导因素 除此之外大量的代谢干扰因素 如氧化磷酸化解偶联剂 嘌呤霉素或氨基酸结构类似物都可以诱导热激蛋白的高表达 b o n n e r1 9 8 1 c r a i n e 等1 9 8 1 d o n a t i 等1 9 9 0 关于h s p 基因表达的信号传递途径目前还 不清楚 由于诱导h s p 合成的逆境可直接损伤蛋白质或合成异常蛋白质 因此认 为异常蛋白质的积累激活了h s p 基因 a n a n t h a n 等1 9 8 6 有人发现细胞内存 在的热激因子 h e a ts h o c kf a c t o r h s f 在热激条件下可以激活热激基因的表 达 首先是p e l h a m 等 1 9 8 6 在果蝇上发现h s p 基因转录中起调控作用的d n a 序 特同瑶刺甩e s t 技术克隆莲热美蛋白基蜀中山大擘硕士擎值论文 2 0 0 5 列 称之为热激元件 h e a ts h o c ke l e m e n t h s e 为一种顺式元件 位于热激 蛋白基因5 端的启动子区域 经热激而活化的热激因子t t s f 可识别存在于h s p 基因上游启动子区域的h s e h s f 和h s e 结合就会激活热激基因的表达 常温 下 h s f 以单体形式与阻遏蛋白结合 而不能结合到h s e 上 热刺激下 h s f 与 阻遏蛋白分离 在h s e 附近形成三聚体 三聚体一旦形成 便与h s e 特异结合 促进基因转录起始 y u k i 等2 0 0 0 m o r i m o t o 1 9 9 3 提出热激基因表达的调 节模式 在正常条件下 h s f 通过与h s p 7 0 的相互作用来保持不与d n a 结合的 非活性状态 热激时 错误折叠的和凝集的蛋白质与h s p 7 0 竞争结合h s f 解除了 抑制h s f 和d n a 结合的因素 i i s f 组装成具有d n a 结合活性的三聚体并结合到 h s e 上 激活热激基因的表达 合成热激蛋白 包括h s p 7 0 当h s p 7 0 积累到一 定程度又和h s f 结合 使其回复非活性的单体形式 h s f 和h s e 分离 转录停止 m o r i m o t o1 9 9 3 1 1 5l i s p 研究存在问题及展望 目前已发现的众多h s p s 热激蛋白在生物的耐热性 抗冷性 植物种子发育 植物减数分裂和分子伴侣等方面起作用 但目前对热激蛋白一系列特殊的生理机 制尚不十分清楚 因此 熟激蛋白在综合方面包括基因调控 转录及翻译的分 析 表达产物定性与定量分析等方面还需进一步研究 尤其是在植物对高温以及 其它逆境因素胁迫的响应这方面 这是一个多因子控制的复杂过程 对植物抗温 度胁迫的研究不能单纯寄希望于搞清楚一两个蛋白或通过转移一个基因来提高 植物的耐热性 应结合其它相关研究 综合地进行探讨 全面认识植物的抗逆 生理 如果能有选择性地利用生物技术 对热激蛋白的功能及理化性质等方面进 行实质性研究 将会产生很大的经济作用和科学价值 这必将有利于抗逆品种的 选择和培育 有助于对生物体在生长发育 分裂分化的研究 更好地为农业生产 服务 为生物进化的研究提供可靠的理论依据及实验基础 1 2 植物e s t 计划的研究进展 e s t 是c d n a 克隆的术端序列 平均长度为3 0 0 5 0 0 b p 称为表达序列标签 a d a m s1 9 9 1 e s t 的操作过程是 首先回收细胞中的m r n a 把m r n a 反转录 符同活利用h g t 技术克隆莲燕激蛋白基因中山大学硕士学位论文 2 0 0 5 成c d n a 并把反转录的c d n a 克隆到质粒或噬菌体等克隆载体上 构建该物种某 一发育阶段的c d n a 文库 然后大规模 随机地挑选a d n a 文库中的几百到几千个 克隆 最后获得e d n a 克隆的5 或3 序列 由于绝大多数的m r n a 3 端含p o l y a c d n a 3 端定向克隆和定向测序便成为e s t 的首选方法 一个e s t 代表生物体某 种组织在某一时期的一个表达基因 e s t 的数目可以提示它所代表的基因表达的 拷贝数 一个基因在组织中表达的次数越多其相应的e s t 也就越多 o k u b o 等 1 9 9 2 e s t 策略的优越性显而易见 首先表达基因只占整个基因组的3 5 e s t 反映的是基因的编码部分 可以直接获锝基因表达的信息 r o u n s l e y 等 1 9 9 8 其次实施e s t 速度快 费用低 效益高 e s t 已成为基因发现 基因表 达及重组蛋白表达等研究的强有力的分子生物学工具 基于e s t 的基因克隆已成 为e s t 的主要应用之一 由于e s t 的长度通常只有3 0 0 5 0 0 b p 不能代表基因 结构的全部信息 由e s t 扩增出全长的c d n a 已成为当前的研究热点 而c d n a 末端快速扩增技术 r a p i da m p l i f i c a t i o no fc d n ae n d r a c e 成为实现这一 目的的有效途径 在植物中 拟南芥由于其基因组小 生活周期短 繁殖速度快 易获得较多 突变体等特点 被选为