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土壤微生物的分析测定 土壤微生物（soil microorganism)是指生活在土壤中借用光学显微镜才能看到的微生物。 土壤微生物是土壤的重要重要组成部分，特别是在土壤质量的演变过程中，土壤微生物具有相对较高的营养转化能力，土壤中占多数的分别是细菌、放线菌、真菌。由于在不同地带、不同土壤类型、不同季节和不同的土壤条件及农业措施等影响下，微生物的数量组成是不同的。为此对某一地区的土壤进行采样并分离菌株，对提纯所得的菌株作生理生化分析，对了解某一区域的土壤微生物性质意义深远。1. 土样的采集及处理1.1 采样工具 GPS导航仪、取土器、铁铲（锹）、小刀、卷尺、采样袋（布袋、纸袋或塑料网袋）、采样标签、记号笔等。1.2 土样采集 土壤采自郊外，采集深度020cm，采样时先刮去2-3cm厚的表层土，用铁锹挖成一个深20cm的完整垂直剖面，再取宽10cm、厚2cm的土片，采用5点采集法，共采集6个土样，每个土样500g。 取样时先用铁锹铲出一个耕层断面，然后与断面平行取土。每个采样点的取土深度及采集数量均一致，样品中上层土与下层土的含量相同；取土器入土时要与地面垂直，且保持同一深度。用刀和尺将土片削成宽2cm、厚2cm、长（自上而下）1520cm的土条，捏碎大块，剔除石砾、植物残体等混杂物。1.3 样品的处理 采样多点混合，充分拌匀成为混合土样。每一个混和土样中称取1kg，样品的数量过多时采用四分法除去多余的土壤，即将样品放在干净的平面上，将其碾碎、混匀，并铺成平面四方形，沿对角线将土壤平均分成四份，对角的两份混匀成为一份，取其中一份。如果得到的样品仍然比较多，可以再继续采取四分法处理，一直达到需求的数量为止。1.4 土壤稀释液的制备取土样10g，放入盛有90ml无菌水并带有10粒无菌玻璃珠三角瓶中，震荡10分钟，制成均匀的土壤悬液，取10ml原液于试管，用1支1ml无菌液盛有9ml无菌水的试管中充分混合，再用无菌试管从此试管中再吸取1ml悬液，加入另一盛有9ml的无菌水的试管中，以此类推配制10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6.、10-7不同稀释度的土壤溶液。2 土壤微生物的分离与计数2.1 土壤细菌MPN计数2.1.1 选择性试管分离 按牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的配方(蛋白胨5.0g， 琼脂18.0g，牛肉膏3.0g，蒸馏水 1000mL，pH 7.07.2)，依次按试剂加入500ml的容量瓶中，加入一定量的无菌蒸馏水，震荡均匀后定容至500ml，将溶液倒入三角瓶内，120灭菌20min。灭菌完毕后，待三角瓶温度降至50时，在无菌操作台上将溶液倒入试管。倒入试管时，右手持盛装培养基的三角瓶置于火焰旁，左手将试管塞塞拔出，瓶口保持对着火焰，然后用右手手掌边缘与无名指夹住瓶塞，左手拿试管并将试管塞在火焰附近打开，迅速倒入，待冷却。2.1.2 试管的标记选取10-710-3 5个相连的稀释度，将不同的稀释度悬液分别接种至不同培养基的试管中，每管接悬液1ml，每一稀释度重复3管，不同土壤稀释液细菌分离的培养皿标记如下表1所示：表1 不同稀释度土悬液细菌筛选试管编号 土壤浓度 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 I1 II1 III1 IV1 V1试管编号 I2 II2 III2 IV2 V2 I3 II3 III3 IV3 V3 于28培养714d，根据各稀释系列试管中有无细菌得出数量指标，并根据重复数量不同利用三次重复测数统计表查出细菌近似值。 每克干土中细菌数=2.2 放线菌的分离计数2.2.1 选择性试管分离按改良高氏I号培养基的配方(蛋白胨5.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，琼脂18.0g，硝酸钾1.0g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.5g，蒸馏水 1000mL，pH7.0)，临用时在已融化的高氏I号培养基中加入重铬酸钾溶液，以抑制细菌和霉菌的生长，每100ml培养基加入3%重铬酸钾。按上述方法把培养液倒入试管待冷却。2.2.2 试管的标记选取10-610-2 5个相连的稀释度，将不同的稀释度悬液分别接种至不同培养基的试管中，每管接悬液1ml，每一稀释度重复3管，不同土壤稀释液细菌分离的培养皿标记如下表2所示：表2 不同稀释度土悬液放线菌筛选试管编号 土壤浓度 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 A1 B1 C1 D1 E1试管编号 A2 B2 C2 D2 E2 A3 B3 C3 D3 E3于28培养714d，根据各稀释系列试管中有无细菌得出数量指标，并根据重复数量不同利用三次重复测数统计表查出放线菌近似值。 每克干土中细菌数=2.3 真菌的分离计数2.3.1 选择性试管分离 按马丁培养基的配方(蛋白胨5.0g，磷酸二氢钾1.0g，琼脂18g，琼脂18.0g，葡萄糖10.0g，硫酸镁0.5g，蒸馏水 1000mL)，为抑制大部分细菌及放线菌的生长，1000ml培养基中加入1%孟加拉红水溶液3.3ml，临用时每100ml培养基加1%链霉素液0.3ml。按上述方法把培养液倒入试管待冷却。2.3.2 试管的标记选取原液10-4 5个相连的稀释度，将不同的稀释度悬液分别接种至不同培养基的试管中，每管接悬液1ml，每一稀释度重复3管，不同土壤稀释液细菌分离的培养皿标记如下表3所示：表3 不同稀释度土悬液真菌筛选试管编号 土壤浓度 原液 10-1 10-2 10-3 10-4 a1 b1 c1 d1 e1试管编号 a2 b2 c2 d2 e2 a3 b3 c3 d3 e3 于28培养714d，根据各稀释系列试管中有无细菌得出数量指标，并根据重复数量不同利用三次重复测数统计表查出真菌近似值。 每克干土中细菌数= 取原液10ml于 土样 试管 10g 溶于三角瓶 并震荡10min 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 原液 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml I1 II1 III1 IV1 V1 I2 II2 III2 IV2 V2 1ml 1ml 1ml细菌筛选 试管 I3 II3 III3 IV3 V3 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml A1 B1 C1 D1 E1 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml A2 B2 C2 D2 E2 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 放线菌筛选试管 A3 B3 C3 D3 E3 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml a1 b1 c1 d1 e1 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml a2 b2 c2 d2 e2 真菌筛选试管 a3 b3 c3 d3 e3 2.4 土壤细菌、放线菌、真菌的生长情况及计数714天后将上述分离得到的培养细菌、放线菌、真菌的试管取出，观察各试管菌落生长情况、菌落数及计数出每克干土菌种含量，细菌、放线菌、真菌的筛选试验结果分别见下表4、表5、表6所示：表4 土壤细菌的MPN计数 土悬液 试管 菌体 生长 菌体 重复数 数量 近似值 每克 稀释度 编号 个数 情况 平均数 指标 干土菌数 I1 10-3 I2 I3 II1 10-4 II2 II2 III1 10-5 III2 III3 IV1 10-6 IV2 IV3 V1 10-7 V2 V3表5 土壤放线菌的MPN计数 土悬液 试管 菌体 生长 菌体 重复数 数量 近似值 每克 稀释度 编号 个数 情况 平均数 指标 干土菌数 A1 10-2 A2 A3 B1 10-3 B2 B3 C1 10-4 C2 C3 D1 10-5 D2 D3 E1 10-6 E2 E3表6 土壤真菌的MPN计数 土悬液 试管 菌体 生长 菌体 重复数 数量 近似值 每克 稀释度 编号 个数 情况 平均数 指标 干土菌数 a1 原液 a2 a3 b1 10-1 b2 b3 c1 10-2 c2 c3 d1 10-3 d2 d3 e1 10-4 e2 e33 土壤微生物生理生化分析3.1 细菌的生理生化分析 从培养细菌的试管中挑取长势良好的菌株至250ml 三角培养瓶培养皿进行扩大培养，一段时间后将所得的菌株接种至不同配方、不同编号的培养皿中，每个培养皿重复5次，待培养起满后观察菌落在不同培养皿上现象，以判断土悬液的细菌生理生化性质。 接种至 培养皿进行 扩大培养 A1 A2 A3 A4 A5 培养瓶 B1 B2 B3 B4 B5 C1 C2 C3 C4 C5 。 。 ， 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 从土壤中分离所得到的细菌的生理生化特性和现象如下表7所示：表7 土壤细菌生理生化特性及现象 试验序号 试验名称 培养基 培养时间 温度 试剂 检验方法 不同编号培养皿现象 A1 A2 A3 A4 A5 1 氧化酶 牛人膏 1%盐酸 .试验 蛋白胨 1824h 室温 二甲对 显红色为 培养基 苯二氨 阳性、 水溶液、1min内 -萘酚、 显色视 乙醇 阴性 B1 B2 B3 B4 B5 2 接触酶 营养琼脂 1824h 室温 3%H2O2 有气泡 试验 培养基 产生为 阳性 C1 C2 C3 C4 C5 3 糖（醇） 牛肉膏 溴麝香草 培养液 发酵试验 蛋白胨 室温 酚蓝水溶 变黄则 培养基 液 产酸 D1 D2 D3 D4 D5 4 碳源利用 无机氮 14d 室温 含碳试验 培养基 菌生长明 显快者为 阳性，反 之阴性 E1 E2 E3 E4 E5 5 氮源利用 有机碳 含氮试验 基础陪 14d 室温 菌生长明 养基 显快者为 阳性，反 之阴性 F1 F2 F3 F4 F56 葡萄糖 低有机 氧化发酵 氮培养 1824h 30 开管时变 试验 基 黄为氧化 产酸，开 闭管均变 黄发酵 产酸 G1 G2 G3 G4 G57 乙酰甲基 基础陪 6d 室温 5%-萘 呈红色为 试验 养基 酚、 阳性,黄 40% 色为阴 NaOH 性续表 土壤细菌生理生化特性及现象 试验序号 试验名称 培养基 培养时间 温度 试剂 检验方法 不同编号培养皿现象 H1 H2 H3 H4 H5 8 甲基红 基础 5%-萘 .试验 培养基 4d 37 酚、 呈红色为 40% 阳性、黄 NaOH 色为阴性 溶液 菌落周围 I1 I2 I3 I4 I5 9 淀粉水解 营养琼脂 27d 室温 有无透明 试验 培养基 圈或有紫 红色 J1 J2 J3 J4 J5 10 纤维素分 胨水基础 有透明圈 解试验 培养基 515d 室温 为阳性 K1 K2 K3 K4 K5 11 明胶液化 明胶培 1824h 20 酸性升 菌苔周围 试验 养基 汞溶液 出现清晰 透明圈 L1 L2 L3 L4 L5 12 硝酸盐还 牛肉膏蛋 3过氧 加格利斯 原试验 白胨培养 5d 室温 化氢 试剂呈红 基 色、橙色 M1 M2 M3 M4 M5 牛肉膏蛋 5d 室温 奈氏试剂 出现黄 13 产氨试验 白胨培养 色或褐色 基 沉淀 N1 N2 N3 N4 N514 硫化氢产 牛肉膏蛋 14d 室温 铅盐 黑色硫化 生试验 白胨培养 铅沉淀 基 续表 土壤细菌生理生化特性及现象 试验序号 试验名称 培养基 培养时间 温度 试剂 检验方法 不同编号培养皿现象 O1 O2 O3 O4 O5 15 吲哚产生 胰胨水溶 对二甲基 .试验 蛋白胨 27d 室温 氨基苯 红色的玫 培养基 甲醛 瑰吲哚 P1 P2 P3 P4 P5 16 石蕊牛奶 牛奶石蕊 30d 室温 石蕊 根据石蕊 一 陪养基 颜色变化 判断 Q1 Q2 Q3 Q4 Q5 17 尿素水解 琼脂培养 酚红指 红色圈为 试验 基 4d 室温 示剂 阳性 R1 R2 R3 R4 R5 18 2d 室温 本尼迪克 3-酮基乳 酵母膏乳 特试剂 菌落周围 糖产生试 糖培养基 有黄褐色 验 沉淀为 阳性 S1 S2 S3 S4 S5 19 柠檬酸盐 基础培养 酚红指 指示剂由 试验 基 35d 室温 示剂 淡红色变 为玫瑰色 T1 T2 T3 T4 T5 20 氰化钾试 基础培养 12d 37 20% 验 基 KOH、 是否能生 硫酸亚铁 长 U1 U2 U3 U4 U521 络氨酸 营养琼脂 714d 室温 是否水解 水解试验 陪养基 络氨酸 续表 土壤细菌生理生化特性及现象试验序号 试验名称 培养基 培养时间 温度 试剂 检验方法 不同编号培养皿现象 V1 V2 V3 V4 V5 丙二酸盐 丙二酸盐 22 试验 培养基 12d 室温 溴百里 培养基生 酚蓝 变蓝为阳 性 W1 W2 W3 W4 W5 23 马尿酸盐 马尿酸肉 28d 室温 50 有针状晶 水解试验 汤液 H2SO4 体出现为 阳性 X1 X2 X3 X4 X5 24 苯丙氨酸 营养琼脂 24h 室温 三氯化 呈绿色 脱氨酶测 培养基 铁 为阳性 定 Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 25 色氨酸脱 色氨酸脱 24h 室温 三氯化 呈红褐 氨酶测定 氨酶培养 铁 色为阳 基 性 鉴 定 结 果3.2 放线菌的生理生化分析 从培养细菌的试管中挑取长势良好的菌株至250ml 三角培养瓶培养皿进行扩大培养，一段时间后将所得的菌株接种至不同配方、不同编号的培养皿中，每个培养皿重复5次，待培养起满后观察菌落在不同培养皿上现象，以判断土悬液的放线菌菌生理生化性质。从土悬液中筛选的放线菌的生理生化特性如下表8所示： 表8 土壤放线菌生理生化特性及现象 试验序号 试验名称 培养基 培养时间 温度 试剂 检验方法 不同编号培养皿现象 a1 a2 a3 a4 a5 1 明胶液化 明胶 30d 28 观察明胶 .试验 培养基 是否分解 b1 b2 b3 b4 b5 2 牛奶凝固 碳酸钙 30d 28 凝固后有 与胨化 液体出现 c1 c2 c3 c4 c5 3 淀粉水解 淀粉培养 透明圈的 试验 基 20d 28 碘液 大小 d1 d2 d3 d4 d5 纤维素水 30d 28 滤纸上生 4 解 长情况和 滤纸分解 情况 e1 e2 e3 e4 e5 5 硫化氢的 含硫培养 是否有菌 产生试验 基 714d 28 落生成 f1 f2 f3 f4 f5 6 不同碳源 基础培养 7d 室温 是否有菌 试验 基 落生成 g1 g2 g3 g4 g5 黄豆饼粉 7 抗菌谱测 浸汁琼脂 67d 28 抑菌圈的 试 培养基 产生表明 有抗生素 结果鉴定 4 土壤中功能微生物的测定 将各稀释度的土悬液进行补贴方法的测定，以鉴定土壤中含有功能细菌的种类，试验结果如下表9所示：表9 土壤中功能微生物的测定 功能微生物类群培养基培养温度培养时间试剂稀释度分离方法 检验法 试验现象1、氨化 细菌蛋白胨氨化培养基283d、5d分别都观察奈氏试剂10-910-6稀释法根据培养基的浑浊度、菌膜、沉淀、气味、颜色等变化判断氨化细菌的有无2、硝化细菌改良的斯蒂芬森培养基2814d格利斯试剂，二苯胺10-610-3稀释法吸取5滴培养液于白瓷板上，加利斯试剂，呈红色3、反硝化细菌反硝化细菌培养基2814d格利斯试剂，二苯胺10-710-3稀释法如有反硝化细菌，培养液变浊，甚至有