蝾螈从重命名.pdf

黑龙江畜牧兽医 科技版 2 0 1 2 年 l 2 月 上 3 9 鼠 一 纽胞 艟脸和囊睡制备嵌台俸 较 王鹏博 李相运 胡春超 徐继强 潘晓靖 河北农业大学 动物科技学院 河北 保定 0 7 1 0 0 0 中图分类号 8 6 5 1 3 文献标识码 B 文章编号 1 0 0 4 7 0 3 4 2 0 1 2 1 2 0 0 3 9 0 3 嵌合体是指由2 个或 2 个以上具有全能性或多 能性的细胞系发育而成的复合体 随着发育生物学 理论和胚胎干细胞技术的发展 将 胚胎干细胞导人 小鼠植入前胚胎制备嵌合体逐渐成为研究细胞分化 机制 的有效工具 经基 因修饰胚胎干细胞来源的 可遗传的嵌合个体 也成为基因功能研究的重要实 验动物模型 为基 因功能的研究开拓了一条重要途 径 利用四倍体胚胎补偿技术 即以四倍体囊胚为 宿主获得嵌合体 可获得几乎完全由胚胎干细胞发 育而成的嵌合个体 该技术大大缩短了纯和基因修 饰小鼠的生产周期 将体细胞核移植 胚胎干细胞建 系与四倍体囊胚补偿技术结合也成功获得了克隆动 物 I 3 j 这一技术体系可以通过建立体细胞核移植 胚胎干细胞系达到优良性状或濒危动物遗传资源保 种的 目的 另外 可对体细胞核移植胚胎干细胞进行 基因打靶或转基因操作 获得特异基因修饰的克隆 动物 根据宿主囊胚细胞染色体特性 可将嵌合体分 为2 n 2 n 二倍体宿主囊胚 二倍体胚胎干细胞 嵌合 体和4 n 2 n 四倍体宿主囊胚 二倍体胚胎干细胞 嵌 合体 试验主要针对 2 n 2 n 嵌合体进行研究 下文简 称为嵌合体 J 制备嵌合体的常用方法主要有显 微注射法和胚胎聚合法 显微注射法 是用显微操作 针将胚胎干细胞注入胚胎中制备嵌合体的方法 胚 胎聚合法是指以培养皿底凹槽 用尖头针具压制 作 为聚合容器 将去除透明带的4 一细胞期胚胎 8 一 细 胞期胚胎或桑葚胚与胚胎干细胞植人后使其聚合在 一 起生长 从而将胚胎干细胞导入宿主胚胎 的方 法 j 由于胚胎聚合法耗时较长 而且对培养条件 要求较高 因此试验采用显微操作法制备嵌合体 影 响嵌合体制备的因素很 多 包括胚胎 干细胞 的数 目 质量 遗传背景以及试验操作等 试验主要对 8 一 细胞期胚胎和囊胚制备嵌合体进行研究 比较其差 收稿日期 2 0 1 2 0 4 2 5 修回日期 2 0 1 2 0 5 0 4 作者简介 王鹏博 1 9 8 7一 男 硕士研究生 s h a n g l a n k i ma n 1 2 6 t o m 通信作者 李相运 1 9 6 8一 男 教授 博士 l i x i a n g y u n 3 5 y a h o o c o m C l 1 异 现报道如下 1 材料 1 1 主要仪器及试剂 C O 2 培养箱 型号为 M C O一 1 5 A C S A N Y O公 司生产 体视显微 镜 型号为 S MZ 6 4 5 N I K O N公 司 生产 显 微 操 作 系 统 一照 相 系统 型 号 为 U C M A D 3 O L Y MP U S 公 司生产 P i e z o i mp a c t d ri v e s y s t e m 型号 为 P MM 一1 5 0 F U P ri m e T e c h公 司生产 C C D成像 系统 型 号为 M I C R O P U B L I S H E R 3 3 c o o l e d R T V Q I M A G I N G公司生产 细胞培养皿 N U N C 全套小鼠手术器械等 均由河北农业大学 动物科技学院提供 小鼠胚胎 干细胞培养基 D ME M 1 5 胎牛 血 清 1 mm o l L B巯基 乙醇 l m mo VL L一谷氨酰胺 5 0 I U m L 青霉素 5 0 m m L链霉素 l 0 0 0 I U m L白 血病抑制因子 L I F 1 非必 需氨基酸 N E A A 均 购自I n v i tr o g e n 公司 体外操作液 M 2溶液 购 自S i g m a 公司 胚胎培养液 K S O M A A溶液 购自M il l i p o r e 公司 组织 D N A提取试剂盒 T I A N a m p G e n o m i c D N A K i t 购 白天根生化科技 北京 有限公司 2 T a q Ma s t e r Mi x 含染料 购 自T a K a R a公司 琼脂糖 购 自 北京鼎国生物技术有限公 司 1 2 试验动物及饲养条件 试验所用 C D 1小 鼠购 自北京实验动物 中心 输 精管结扎公鼠和假孕受体母鼠均采用 C D 1 小鼠 所 有小 鼠均 采 用 1 2 h光 照 1 2 h黑 暗 循 环 光 照 6 0 0 1 8 0 0 普 通清洁 级 鼠房 温 度为 2 2 2 5 湿度为4 0 一 7 0 可以自由采食 饮水 所有 公鼠均采用单笼饲养 母鼠集中饲养 饲喂普通小鼠 繁殖饲料 由北京科奥协力公司提供 2方法 2 1 小鼠超数排卵和 2一细胞期胚胎的获取 选取处在间情期 5 7周龄 的母 鼠 于 l 4 o 0腹 腔注射 7 5 I u孕 马血清促性腺激素 P M S G 4 8 h后 腹腔注射 7 5 I u人绒毛膜促性腺激素 h C G 然后 以 1 1 的比例与公鼠合笼 次 日 清晨检查阴道栓 见 栓记为0 5天 依此类推 见栓第 2 5天 9 0 0采用 脱颈法处死母鼠 打开腹腔 暴露子宫 将卵巢和输卵 管一并剪下 置于无菌培养皿 中 将注射器从输卵管 H e i l o n g j i a n g A n i m a l S c i e n c e a n d Ve t e r i n a r y Me d i c i n e N o 1 2 201 2 伞部插入输 卵管 冲洗输卵管并收集 8一细胞期 胚 胎 见栓第3 5天 1 5 0 0 以同样方法冲洗子宫 收集 囊胚 在超数排卵小鼠见栓当天挑选 2月龄以上 自 然发情母 鼠与结扎公 鼠按 2 1的比例合笼 次 日清 晨检查阴道栓 选择见栓的母 鼠用于胚胎移植 2 2 胚胎干细胞 的培养 试验所用胚胎干细胞为 J M8 是 由 C B L 6 n小 鼠分离得到的一类基 因敲除的胚胎干细胞 系 其培 养方法为解冻 J M 8细胞 在经丝裂霉素 c处理的小 鼠胎儿成纤维细胞饲养层上培养 2 3 d 当细胞汇集 到 7 0 一 8 0 且集 落 明显 时 用 0 0 5 胰 蛋 白 酶 0 o 4 乙二胺四乙酸 E D T A 消化并吹打 重新 接种在新鲜的饲养层上 并通过上述方法依次进行传 代培养 2 3 显微注射 J M 8细胞 在注射前2 h 更换干细胞培养基 选取生长良好 的J M 8细胞集落 采用酶消化法 0 0 5 胰蛋白酶 0 0 4 E D T A 作用2 3 m i n 用干细胞培养基中和酶 使其停止消化 然后将细胞集落 吹打成单个 细胞 制 备成细胞悬液 将胚胎干细胞和胚胎放入注射滴中 固定针吸取胚胎 注射针 吸取 J M 8细胞 利 用 p i e z o 将透明带打开 1 个小孔 然后将注射针插入囊胚腔 中 注入细胞 每个囊胚注射 1 5 2 0 个干细胞 囊胚 注射完成后继续2 h至恢复囊胚腔后进行子宫移植 8 一 细胞期胚胎注射完成后培养 2 4 h 形成囊胚后进 行子宫移植 2 4 胚胎移植及剖腹产 选取和结扎公 鼠交配见栓 2 5 d的母 鼠 采用单 侧子宫胚胎移植 每次移植 1 5 2 0枚胚胎 在移植 后 的第 1 7 1 8 d观察小鼠出生及嵌合情况 2 5 嵌合度的检测 用组织 D N A提取试剂盒提取成年嵌合体小鼠的 脑 心脏 膀胱 肺脏 肝脏 胃 肾脏 睾丸 或卵巢 胰腺 肠 肌肉 脾脏的组织 D N A 并通过琼脂糖凝胶 电泳检测 D N A的提取情况 然后选取 1 个微卫星位 点 D 5 Mi t 1 3 8进行 P C R扩增 通过琼脂糖凝胶 电泳观 察组织的嵌合情况 3 结果与分析 3 1 显微注射 J M8细胞至 8一细胞期胚胎 结果见 表 1 表 1 显微注射J M 8 细胞至 8 一 细胞期胚胎 由表 1可知 小 鼠出生率为 1 7 7 得 到 1 7只 嵌合体小鼠 占出生小鼠的2 5 0 1 7 6 8 3 2 显微注射 J M 8细胞至囊胚 结果见表 2 表 2 显微注射 J M 8 细胞至囊胚 由表 2可知 小鼠出生率 为 2 2 5 得 到 2 O只 嵌合体小鼠 占出生小鼠的3 1 2 2 0 6 4 与 8一 细胞期胚胎注射得到的小鼠出生情况相比 囊胚的出 生率和嵌合比例均较高 嵌合度较高的小鼠见 1 8 0 页彩图 1 3 3 嵌合体的微卫星分析 结果见图2 图3 图 2 8 一 细胞期胚胎注射嵌合体电泳结果 图 3 囊胚注射嵌合体电泳结果 试验分别检测了嵌合体小鼠的脑 心脏 膀胱 肺脏 肝脏 胃 肾脏 睾丸 或卵巢 胰腺 肠 肌肉 脾脏 通过微卫星分析发现 8一 细胞期注射得到的嵌 合体小鼠嵌合度要高于囊胚注射的 而且其组织内的 干细胞 D N A含量也比囊胚注射的高 4 讨论 通过比较胚胎移植小鼠的出生率和嵌合体比例 以及对嵌合度进行分析来对比 8 一细胞期和囊胚通 过显微注射制备嵌合体的效率 研究表明 囊胚注射 小鼠的出生率和嵌合体小鼠比例均高于 8一细胞期 注射的小鼠 但通过微卫星分析发现 8一 细胞期注 射得到的嵌合体小鼠的嵌合度要高于囊胚注射的嵌 合度 对嵌合体的研究至今已有 8 0多年的历史 1 9 4 2 年 N i c h o l a s 和 H a l l 就曾试 图用不同品系的大鼠将 其早期分裂球进行聚合制作嵌合体 结果只得到 1 个死胎 未 能证 明其为嵌 合体 之后 T a r k o w s k i 黑龙江畜牧兽医 科技版 将具有不同毛色和葡萄糖磷酸异构酶 G P I 迁移率 的 2种小 鼠胚胎在卵裂 的不同时期 如 8一细胞期 1 6 一 细胞期 甚至是桑葚胚进行聚集 成功地制作 了世界上第 1只嵌合体小鼠 通过毛色和同工酶的 测定 证明这些嵌合体的各种组织中均有来 自2种 胚胎的细胞 之后嵌合体技术受到国内外哺乳动物 发育生物学工作者们的极大重视 l l 一 嵌合体技术具有非常广阔的应用前景 对于研究 染色体畸变 基因突变有非常重要的作用 而且其在 转基因动物生产 胚胎种间移植 繁育纯系动物等方 面都有十分广阔的应用前景 但 目前需要研究和解 决的问题有高效培育嵌合体的方法 特别是通过种 间或各种细胞的组合获得嵌合体 培育各组织 器官 的特异性部分嵌合体个体 消除种问的胚胎着床后发 育与受体间的免疫排斥性 研究更适合的标记 试验 对 8 一 细胞期和囊胚制备嵌合体进行比较 找出更有 利于筛选制备嵌合体的方法 对嵌合体的针对性研究 也有一定的指导意义 参考文献 1 白照岱 沈和 胚胎干细胞嵌合体小 鼠的制备及其影响因素 J 生殖医学杂志 2 0 0 7 1 6 6 4 4 4 4 4 7 2 H O C H E D L I N G E R K J A E N I S C H R M o n o c l o n al m i c e g e n e r a t e d b y n u c l e a r t r a n s f e r f r o mm a t u r e Band T d o n o r c e l l s J N a t u r e 2 0 0 2 4 1 5 6 8 7 5 1 0 3 5 1 0 3 8 3 E G G A N K B A L D WI N K T A C K E T T M e t a1 Mi c e c l o n e d f r o m o lf a c t o r y s e n s o r y n e u r o n s J N a t u r e 2 0 0 4 4 2 8 6 9 7 8 4 4 4 9 4 3 HO O P E R M H AR D Y K H A ND Y S I D E A e t a 1 H P R T d e ft e ie n t L e s c h N y h a n m o u s e e mb ryo s d e ri v e d f r o m g e r m l i n e c o l o n i z a t i o n b y c u l t u r e d c e l l s J N a t u r e 1 9 8 7 3 2 6 6 1 1 0 2 9 2 2 9 5 5 J A E N I S C H R T r a n s g e n i c a n i m a l s J S c i e n c e 1 9 8 8 2 4 0 4 8 5 8 1 4 6 8 1 4 7 4 6 N A G Y A G E R T S E N S T E I N M V I N T ER S T E N K e l a 1 Ma n i p u 1 a t i n g t h e m o u s e e m b ry o a l a b o r a t o ry m a n u a l M N e w Y o r k Co l d S p rin g Ha r b o r L a b o r a t o ry P r e s s 2 0 03 7 WA NG Z Q K I E F E R F U R B A N E K P e t a1 G e n e r a t i o n o f c o m p l e t e l y e mb ryo n i c s t e m c e l l d e ri v e d mu ant mi c e u s i n g t e t r a p l o i d b l a s t o c y s t i n j e c t i o n J M e c h D e v 1 9 9 7 6 2 2 1 3 7 1 4 5 8 M A R K E R T C L P E q q E R S R M M a n u f a c t u r e d h e x a p a r e n t al m i c e s h o w t h a t a d u l t S a r e d e ri v e d f r o m t h r e e e mb y ron i c c e l l s J s c i e n c e 1 9 7 8 2 0 2 4 3 6 3 5 6 5 8 9 L I X Y u Y WE I W e t a 1 S i m p l e a n d e ff i c i e n t p r o d u c t i o n o f mi c e d e ri v e d f r o m e mb ryo n i c s t e m c e l l s a g g r e g a t e d wi t h t e t r a p l o i d e m b ry o s J M o l R e p r o d D e v 2 0 0 5 7 1 2 1 5 4 1 5 8 1 0 E GG AN K RO D E A J E N T S C H I e t a1 M a l e a n d f e m a l e mi c e d e ri v e d f r o m t h e s a n l e e mb o n i c s t e m c e l l c l o n e b y t e t r a p l o i d c m b ryo c o mp l e m e n t a t i o n J N a t B i o t e c h n o l 2 0 0 2 2 0 5 4 5 5 45 9 1 1 E G G A N K A K U T S U H L O R I N G J e t a1 H y b ri d v i g o r f e t a l O v e r g r o wt h a n d v i a b i l it y o f mi c e d e ri v e d