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烟草蛋白含量测定实验方案原理：碱性条件下，蛋白(肽键)与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu+.BCA与Cu+形成稳定的紫蓝色复合物。BCA分子式：BCA蛋白质检测流程：一：试验试剂试剂A: 1% BCA二钠（2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠）；2% Na2CO3; 0.16%酒石酸钠；0.4% NaOH; 0.95% NaHCO3. PH=11.25. （4。C保存） 试剂B: 4%CuSO4.（4。C保存） BCA工作液：100ml试剂A+2ml试剂B.（现配现用，体积比为50：150：2 ，加大Cu2+可以加快反应速度）蛋白标准液：1mg/mL BSA用生理盐水(0.9%NaCl)溶解。（4。C保存）BCA二钠，牛血清白蛋白（BSA）（-20。C保存）二：试验2.1 标准曲线：（0-1mg/ml）母液浓度（BSA 1mg/ml）编号123456蛋白浓度（mg/ml）00.20.40.60.81.0取母液体积（ul）020406080100补加生理盐水（ul） 100806040200BCA液（ml）33333337水浴30min，冷却OD562横坐标为吸光度值，纵坐标为蛋白量2.2 样品测定1. 称量0.25g左右烟草，充分研磨,过滤（尽量不要破坏蛋白结构的肽键，不要引入使蛋白变性的因素), 用蒸馏水定容至50mL。2. 取100uL稀释液于试管，3ml BCA工作液,充分震荡30S; 停止震荡，在37。C水浴样品30min,冷却;3. 测定562nm的吸光度值；4. 通过标准曲线求出待测样品蛋白含量。烟叶蛋白含量计算公式：=c标准曲线查得的蛋白浓度（mg/ml）；m烟叶样品的质量（g）; 50烟叶样品定容至50ml；W样品的水分校正系数；蛋白百分含量（%）。注意问题：一、无颜色反应原因：样品中有铜螯合剂；解决：1.透析，脱盐或稀释样品；2.增加工作液铜离子浓度（50：2）；3.去除干扰物质二、 空白吸收好，但是标准品和样品颜色反应浅原因：1.强酸或强碱改变了工作液PH值；解决：透析，脱盐或稀释样品三、样品颜色比较深原因：1.蛋白浓度太高；解决：稀释样品2.样品中有脂或脂蛋白；解决：加2SDS。四、所有反应颜色深原因：1.缓冲液有还原剂；解决：透析或稀释样品。2.缓冲液有巯基。解决：去除干扰物质。五
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