工业微生物育种实验.doc

土壤中产-淀粉酶菌株的筛选与紫外诱变摘要：本实验利用平板涂布法，从土壤中分离并筛选产-淀粉酶相对较高的菌株，通过碘-淀粉法对菌株进行鉴定，并对筛选的菌株进行紫外诱变，从土壤中分离得到了产淀粉酶相对较高的解淀粉菌株。关键词：-淀粉酶；紫外线前言: 淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多，特点各异，可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域。在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值，如添加a一高温淀粉酶可提高啤酒质量，中温蒸煮条件下添加适当耐高温一淀粉酶可提高糖化率及酒精出酒率，降低甲醇含量，提高酒精质量，同时可提高设备利用率等。淀粉酶在面包焙烤过程中分解淀粉产生的可溶性糖被酵母转化成酒精和CO2气体，不仅能增加面包体积，同时还有改善面包表皮色泽、提高面包软度、延长保质期的作用，对面包冷却和冷冻也有重要作用。由于微生物数量多，繁殖快，工业生产主要采用微生物发酵法大量生产该制剂。本实验通过平板涂布法从土壤中分离并筛选产-淀粉酶相对较高的菌株，通过利用碘-淀粉法对菌株进行鉴定，并对筛选的菌株进行紫外诱变。从土壤中分离得到了产淀粉酶相对较高的解淀粉菌株。一 材料与方法1.1土壤来源取自常熟理工学院笃行楼后面。1.2 仪器 恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、电磁力搅拌器（含转子）、低速离心机、移液管、玻璃棒、试管等。1.3 培养基牛肉膏蛋白胨液体培养基g1000mL)：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g，pH调至7.2，121灭菌20 min 。分离培养基(g1000mL)：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g， 琼脂粉20g，pH调至7.2，121灭菌20 min，待冷却到50时倒平板。1.4 实验方法1.4.1 产淀粉酶产生菌的筛选与鉴定取2g土样溶于18mL无菌水中，稀释至10-4，分别取10-2、10-3、10-4稀释液0.1mL涂布于分离培养基中，于37恒温箱中培养48小时。在平板上菌落周围滴加碘液，测量水解圈大小（H）和菌落大小（C），挑选H/C最大的菌，接种到液体培养基中，37恒温箱中培养24小时。1.4.2 紫外诱变取对数生长期的发酵液稀释106倍，吸取0.1mL稀释菌液涂布于牛肉膏蛋白冻固体培养基，倒置于37oC恒温箱中培养48小时。将培养至对数生长期的发酵液倾于无菌培养皿，置电磁力搅拌器上于超净工作台紫外灯下（距离30cm）分别照射5min、10min。将诱变菌株在红光下稀释100倍、1000倍，分别取0.1mL涂布于分离培养基，倒置于37oC恒温箱中培养48小时。在长出菌落的周围滴加碘液，观察并测定水解圈大小（H）和菌落大小（C），并计算H/C比。二、结果与分析2.1 出发菌株的筛选结果测定诱变前的平板菌落直径和变色圈直径，初筛出 5株HC值较大的菌株（结果见表 1），选出 1 株酶活性最强的菌株作为诱变出发菌株。表1 5株较优良出发菌株的HC值编号12345菌落（C）0.60.50.60.40.7水解圈（H）1.21.11.31.51.3HC2.002.202.173.75186根据表1的测定结果，菌株 4 的 HC 值最大, 选出该菌株作为优良出发菌株。2.2 紫外诱变致死率结果测定紫外诱变前后的细菌培养后的平板菌落数，计算出细菌致死率（结果见表2）。表 2 紫外照射后细菌的死亡率（%）照射时间稀释度平板菌落细胞浓度存活率死亡率minN1(个/ml)N1/N0（%）1-N1/N0510-51251.2510847.252.81010-5959.510735.864.2根据表2的测定结果，随着紫外照射时间的延长，细菌致死率升高。2.3优良突变菌株的筛选结果测定诱变前后的平板菌落直径和变色圈直径，再从菌落中筛出 5株HC 值最大的菌株（结果见表3）表3 诱变前后5株较优良出发菌株的HC值编号12345平均诱变前C0.40.50.40.40.50.44H1.41.61.51.51.61.52HC3.503.203.753.753.203.45诱变后5 minC0.30.30.20.30.20.26H1.00.90.70.81.00.88HC3.333.003.502.675.003.38诱变后10 min C0.20.10.20.10.20.16H1.00.71.20.61.3.96HC5.007.006.006.006.506.00根据表3的测定结果，诱变前菌株3和菌株4的HC值最大；诱变后5min，菌株5的HC值最大；诱变后10min，菌株2的HC值最大。且各时间段最大HC值为诱变后10min 诱变后5min 诱变前 。三、结果讨论对土壤枯草芽孢杆菌淀粉酶菌株进行紫外线诱变处理，得到 1 株较出发菌株酶活力高的优良变株（诱变后10 min，菌株2 ），该优良变株的HC值为7，分别较出发菌株、诱变后5min菌株5高出 86.7% 、40%，说明其为所需高产且酶活力高的目的菌株。由表2、表3结果可知，随着紫外照射时间的延长，细菌致死率升高，但细菌的突变效果越好。所以实验可适当延长紫外照射时间，增加突变效果。四、参考文献1. 张树政，酶制剂工业M北京：北京科学技术出版社，19982张玲香天然彩棉织物酶处理工艺J印染，2005，3. 岳春，初峰，侯振建液态法生产食一醋工艺研究J食品工业科技，2005，26(3)：113一1154.吴定，邹耀洪，王云，等固定化酶生产低