黄花苜蓿发明 附件.doc

说 明 书 黄花苜蓿组培快速繁殖方法技术领域：本发明涉及野生牧草繁殖方法，具体指黄花苜蓿组培快速繁殖方法。背景技术：黄花苜蓿(Medicago falcata L.)是一种分布广泛的野生豆科牧草，与紫花苜蓿相比，黄花苜蓿具有耐寒、抗病虫害、抗逆性强等特点。在我国干旱、寒冷地区推广种植黄花苜蓿能发挥重要的生态、经济价值。但是，由于黄花苜蓿是野生种，自身也有一些缺点，如：黄花苜蓿花期不一致，这导致种子成熟不一致、收获产量低，硬实率高达83%、发芽率较低。这都影响了黄花苜蓿的扩大种植。因此，提高黄花苜蓿种子产量及繁殖系数有着重要的理论价值及现实意义。目前，国内外对黄花苜蓿的研究主要集中在栽培引种驯化、遗传多样性及抗性基因等方面，其中涉及种子发芽及繁殖体系的相关研究报导较少。发明内容：本发明要解决的技术问题是提供一种黄花苜蓿组培快速繁殖方法,这种方法具有繁殖速度快、成本低、培育周期短的特点。本发明要解决的技术问题由如下方案来实现：黄花苜蓿组培快速繁殖方法，包括种子的灭菌，无菌苗的获得，愈伤组织的诱导及分化，植株的再生，炼苗移栽。具体方法如下：一、种子的灭菌及无菌苗的获得：取黄花苜蓿种子在流水条件下冲洗2030min，用浓度为70%的乙醇浸泡2040s，浓度为0.1% HgCl2消毒412 min，置于MS和1/2MS固体培养基中发芽，获得无菌苗； 二、愈伤组织的诱导：取上述无菌苗的子叶和下胚轴，子叶切割成4 mm4mm、下胚轴切割成4mm，接入愈伤组织诱导培养基中，愈伤组织诱导培养基为MS+浓度为0.52mg/L 2,4-D+浓度为01.5mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.7%琼脂，pH值均调至5.895.92，经高温120高压灭菌20min，在1925室内散射光条件下培养，即获得愈伤组织；三、分化培养及植株的再生：将上述愈伤组织转接到分化培养基上，分化培养基为MS+浓度为0.151.5mg/L KT+浓度为0.10.2mg/L NAA+0.7%琼脂，初次分化时加蔗糖3%、继代时加蔗糖2%， pH值均调至5.895.92，经高温120高压灭菌20min，在1925室内散射光并开白炽灯条件下培养，培养约50d，即可再生出部分完整的分化苗；四、炼苗及移栽：炼苗移栽前，去掉封口膜，将完整的分化苗进行炼苗12d，将炼好的苗从瓶中取出，洗净根部培养基后，将小苗移植到经消毒处理的基质中，基质配比为壤土：花卉土：蛭石=1：1：1，覆上遮阴网，保湿保温，经10 d后，去掉遮阴网，幼苗便可成活。 本发明与现有技术相比所具有的优点：1、黄花苜蓿种子硬实率较高，前处理采用砂纸打磨，破除硬实，发芽率可提高64.9%。2、黄花苜蓿种子在打磨，流水下冲洗20min，散射光未开白炽灯室内培养条件下，用0.1%的升汞消毒8min后，其发芽率最高，可达79.6%。3、利用组织培养技术在短期内可获得黄花苜蓿大量愈伤组织和再生苗，分化率高达80%。附图说明图1为黄花苜蓿组培快速繁殖方法流程图。具体实施方法一、种子的灭菌及无菌苗的生产选取大小一致，光滑饱满的黄花苜蓿种子(打磨和未打磨)用比重清选法进行清选，下沉的种子作为试验样品。将种子在流水下分别冲洗2030min，移入超净工作台，70%的酒精浸泡2040s，用0.1%的升汞消毒不同时间梯度后（412min），无菌水冲洗45遍，接种于MS和1/2MS固体培养基中，培养温度为1925，培养条件为室内散射光并开白炽灯下培养、室内散射光未开白炽灯培养和培养箱光暗交替培养(光：暗=16：8)，发芽8d左右，观察种子无菌苗萌发及生长状况。二、愈伤组织的诱导取上述发芽8d左右的无菌苗的子叶和下胚轴，子叶切割成44mm、下胚轴切割成4mm左右，接入经高压灭菌的愈伤组织诱导培养基上，愈伤组织诱导培养基成分如下：基本培养基MS，蔗糖3%，琼脂0.7%，激素种类及用量见表1。pH值均调至5.895.92，在1925室内散射光条件下培养，约4d左右开始形成愈伤，3周后进行数据统计。表1 黄花苜蓿愈伤组织诱导培养基激素种类与用量激素种类激素浓度(mg/L)A1A2A3A4A5A6A7A8A9A10A11A122,4-D 6-BA 0.500.50.50.510.51.51010.51111.52020.52121.5三、愈伤组织分化及植株再生将上述诱导出的胚性愈伤组织转接到分化培养基中，分化培养基成分如下：基本培养基MS，初次分化时蔗糖3%，继代时蔗糖2%，琼脂0.7%，激素种类及用量见表2。pH值均调至5.895.92，经高温120高压灭菌20 min，在1925室内散射光并开白炽灯条件下培养，每隔20d继代1次。培养50d后，即可再生出分化苗，并且40%以上分化苗都会有根系产生。将未形成根系的分化苗放入生根培养基中，20d后长出幼根。表2 黄花苜蓿愈伤组织分化培养基激素种类与用量激素种类激素浓度(mg/L)B1B2B3B4B5B6B7B8 NAA KT0.10.150.10.50.110.11.50.20.150.20.50.210.21.5四、炼苗及移栽1)炼苗：移栽前，去掉封口膜，加入无菌水，炼苗12d；2)移栽：将炼好的苗从瓶中取出，洗净根部培养基，注意不要伤了苗和根，将小苗移植到经消毒处理的基质中，基质配比为壤土：花卉土：蛭石=1：1：1，移栽时用镊子将无菌苗根部及茎基部12个节置于基质中，浇水(注意：浇水量需适中，过多的水会使其根部腐烂，无法形成正常植株)，使根部与土壤密切接触，覆上遮阴网，保湿保温，防止幼苗萎蔫，使其尽快缓苗。经10 d后，幼苗长出新叶，标志幼苗成活，揭去遮阴网。7权 利 要 求 书1、黄花苜蓿组培快速繁殖方法，包括种子的灭菌，无菌苗的产生，愈伤组织的诱导及分化，植株的再生，炼苗移栽，其特征是：一、种子的灭菌及无菌苗的获得：取黄花苜蓿种子在流水条件下冲洗2030min，用浓度为70%的乙醇浸泡2040s，浓度为0.1% HgCl2消毒412 min，置于MS和1/2MS固体培养基中发芽，获得无菌苗； 二、愈伤组织的诱导：取上述无菌苗的子叶和下胚轴，子叶切割成4 mm4mm、下胚轴切割成4mm，接入愈伤组织诱导培养基中，愈伤组织诱导培养基为MS+浓度为0.52mg/L 2,4-D+浓度为01.5mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.7%琼脂，pH值均调至5.895.92，经高温120高压灭菌20min，在1925室内散射光条件下培养，即获得愈伤组织；三、分化培养及植株的再生：将上述愈伤组织转接到分化培养基上，分化培养基为MS+浓度为0.151.5mg/L KT+浓度为0.10.2mg/L NAA+0.7%琼脂，初次分化时加蔗糖3%、继代时加蔗糖2%， pH值均调至5.895.92，经高温120高压灭菌20min，在1925室内散射光并开白炽灯条件下培养，培养约50d，即可再生出部分完整的分化苗；四、炼苗及移栽：炼苗移栽前，去掉封口膜，将完整的分化苗进行炼苗12d，将炼好的苗从瓶中取出，洗净根部培养基后，将小苗移植到经消毒处理的基质中，基质配比为壤土：花卉土：蛭石=1：1：1，覆上遮阴网，保湿保温，经10 d后，去掉遮阴网，幼苗便可成活。 说 明 书 摘 要本发明公开了一种黄花苜蓿组培快速繁殖方法，包括种子的处理、无菌苗的获得、愈伤诱导、增殖、分化、再生植株的获得及炼苗移栽等技术。本试验以黄花苜蓿无菌苗的子叶和下胚轴为外植体，接种到不同激素配比的愈伤组织诱导培养基中诱导愈伤形成，然后接种到分化培养基中分化成苗。将完整的分化苗进行炼苗，将炼好的苗从瓶中取出，洗净根部培养基后，将小苗移植到经消毒处理的基质中，覆上遮阴网，保湿保温，经10 d后，去掉遮阴网，幼苗便可成活。本方法能得到较