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DNA改性方法：CpG岛(CpG island)，CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，而在基因组的某些区段，CpG保持或高于正常概率，这些区段被称作CpG岛，在哺乳动物基因组中的12kb的DNA片段，它富含非甲基化的CpG双倍体。在哺乳动物中CpG以两种形式存在：一种是分散于DNA序列中；另一种呈现高度聚集状态，人们称之为CpG岛（CpG island）。在正常组织里，70%90%散在的CpG是被甲基修饰的，而CpG岛则是非甲基化的。正常情况下，人类基因组“垃圾”序列的CpG二核苷酸相对稀少，并且总是处于甲基化状态，与之相反，人类基因组中大小为100-1000bp左右，富含CpG二核苷酸的CpG岛则总是处于未甲基化状态，并且CpG岛常位于转录调控区附近，与56%的人类基因组编码基因相关，因此基因转录区CpG岛的甲基化状态的研究就显得十分重要。人类基因组序列草图分析结果表明，人类基因组CpG岛约为28890个，大部分染色体每1Mb就有5-15个CpG岛，平均值为每Mb含10.5个CpG岛，CpG岛的数目与基因密度有良好的对应关系。CpG岛经常出现在真核生物的管家基因的调控区，在其它地方出现时会由于CpG中的C易被甲基化而形成5-甲基胞嘧啶，脱氨基后形成胸腺嘧啶，由于T本身就会存在于DNA中，因此不易被修复，所以被淘汰。故CpG在基因组中是以岛的形式分布的。CpG表示核苷酸对，其中G在DNA链中紧随C后。CpG对很少出现在人类基因中。然而，在许多基因的启动子（promotor）或“起始”区域周围，甲基化经常被抑制。这些区域包含浓度相对较高的CpG对，与此段区域对应的染色体区段一起被称作CpG岛，其长度通常在几百到几千核苷酸的长度内变化。许多基因，尤其是管家基因的启动子区，基因的末端通常存在一些富含双核苷酸“CG”的区域，称为“CpG岛”（CpG island）。研究碱基G和C在整个基因组内的含量和分布有十分重要的意义。例如在人类基因组内，GC的含量大约为40%；这些GC并不是平均分布在基因组内，在某些DNA片段上其含量可高达60%以上，而在另一些区域则只有33%左右。这种GC含量的差别，在基因表达的调控和基因突变上都可能扮演着重要的角色。例如，在人类基因组内，存在有近3万个CpG岛；在大多数染色体上，平均每100万碱基含有515个CpG岛，其中有1.8万多个CpG岛的GC含量为60%70%。通常，这些CpG岛不仅是基因的一种标志，而且还参与基因表达的调控和影响染色质的结构。例如， 除定位于失活X染色体上的基因和印迹基因外，正常细胞的CpG岛由于被保护而处于非甲基化状态。全基因组低甲基化，维持甲基化模式酶的调节失控和正常非甲基化CpG岛的高甲基化是人类肿瘤中普遍存在的现象.。以往的研究证明启动子区的高甲基化导致抑癌基因失活是人类肿瘤所具有的共同特征之一，而且这种高甲基化是导致抑癌基因失活的又一个机制。另外，原核生物细菌DNA含有高频率的CpG双核苷，约为1/16，细菌DNA和某些含非甲基化CpG双核苷的多聚核甘酸能够刺激鼠和人淋巴细胞。高等脊椎动物出现CpG双核苷频率为1/50，且多为甲基化，真核细胞和甲基化的多聚核甘酸则不能刺激鼠和人淋巴细胞。CpG结构与细菌DNA同源性要高于脊椎动物细胞。CpG DNA可直接刺激B细胞、巨噬细胞和DCs细胞分泌细胞因子。特别是TH1样细胞因子如IL-12和 IL-18；细胞表达协同刺激因子分子，显示增强抗原递呈作用。CpG DNA可诱导强烈的TH1样应答提示这些分子可作为疫苗的佐剂，抵抗各种目标，包括感染性物质，肿瘤抗原，过敏原等。基因的表现，受染色体上的染色质结构与异染色质（基因无表现或低表现）区域里的胞嘧啶甲基化所影响。举例而言，当胞嘧啶受到甲基化时，会转变成5-甲基胞嘧啶，此作用对于X染色体的去活化、铭印和保护脱氧核糖核酸分子不被内切酶所切断（存在例外）而言相当重要52。甲基化的程度在不同生物之间有所差异，如秀丽隐杆线虫便缺乏胞嘧啶甲基化，而在脊椎动物体内则较常出现，大约有1%的脱氧核糖核酸为5-甲基胞嘧啶53。5-甲基胞嘧啶容易因自然发生的脱氨作用而变成胸腺嘧啶，也因此使甲基化的胞嘧啶成为突变热点54，这也解释了为什么胞嘧啶和鸟嘌呤会集中出现在CpG岛里，因为那里的甲基化作用被压制，没有甲基化的胞嘧啶所产生的突变产物并非胸腺嘧啶，而是尿嘧啶。因为尿嘧啶会相对容易地被更正过来，所以CpG岛内胞嘧啶不易形成突变而会被保留下来。其他的碱基修饰还包括细菌的腺嘌呤甲基化，以及使动质体（一种生物）的尿嘧啶转变成“J-碱基”的糖基化等。snRNA (smallnuclearRNA，小核RNA）。它是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体（spilceosome）的主要成分。发现有五种snRNA，其长度在哺乳动物中约为100-215个核苷酸。snRNA一直存在于细胞核中，与40种左右的核内蛋白质共同组成RNA剪接体，在RNA转录后加工中起重要作用。某些snRNPs和剪接作用密切相关，它们分别与供体和受体剪接位点以及分支顺序相互补。其中位于核仁内的snRNA称为核小体RNA（small uncleolar RNA），参与rRNA前体的加工及核糖体亚基的组装。tmRNA 是存在于细菌的一类稳定的小RNA，tmRNA的功能有(1)：将“滞留”在mRNA上的核糖体解脱下来.(2):将一段信号肽加在有缺陷的蛋白质C末端,使其有效的水解。cRNA探针是以cDNA为模板在体外转录而成的探针，可方便地通过已克隆于特定质粒载体的DNA产生。这些质粒通常在紧邻多克隆位点的位置含有一个噬菌体启动子。应用相关的RNA聚合酶和4种核糖核苷(rNTPs)(其中至少一种带有标记物)进行体外转录反应，依赖DNA的RNA聚合酶以克隆的cDNA为模板，以含有标记物的三磷酸核糖核苷为原料，从启动子下游开始在体外转录产生RNA。通过改变外源cDNA在质粒中的插入方向或选用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的转录方向(即以cDNA的哪条链为模板转录RNA)，从而可以得到与mRNA同序列的同义RNA探针(senseprobe)或与mRNA互补的反义RNA探针(antlsense probe)，后者即互补RNA(cRNA)探针。通常用同义RNA探针作cRNA探针的阴性对照。cDNA为具有与某mRNA(信使RNA)链呈互补的碱基序列的单链DNA即complementary DNA之缩写，或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的DNA双链。与RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的存在下，由依赖RNA的DNA聚合。 转位子 transposon 系在原核生物的染色体或质粒中存在的转移因子之一，因运输标记基因而得此名。 根据其由来或标记基因的种类而分为Tn1，Tn2，Tn3，已发现许多具有以决定耐药性基因作为标记基因。其结构上的特征为，其两端具有插入排列顺序或其一部分，此插入排列有同方向的，也有逆方向的。例如，运输耐卡那霉素基因Tn5。其两端具有为1460碱基对（bp）反方向的插入排列顺序（图）。而运输耐氯霉素基因Tng，在两端则有同方向的插入排列顺序（ISI）。转位子转移后，在接近其两个末端的外侧，有一定长度的短的碱基排列顺序（多为5或9bp）的重复，这是转移反应的特征。基因家族（gene family），是来源于同一个祖先，由一个基因通过基因重复而产生两个或更多的拷贝而构成的一组基因，它们在结构和功能上具有明显的相似性，编码相似的蛋白质产物， 同一家族基因可以紧密排列在一起，形成一个基因簇，但多数时候，它们是分散在同一染色体的不同位置，或者存在于不同的染色体上的，各自具有不同的表达调控模式。基因簇（gene cluster）指基因家族中的各成员紧密成簇排列成大串的重复单位，位于染色体的特殊区域。基因组，Genome，一个细胞或者生物体所携带的一套完整的单倍体序列，包括全套基因和间隔序列。可是基因组测序的结果发现基因编码序列只占整个基因组序列的很小一部分。因此，基因组应该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。说的更确切些，核基因组是单倍体细胞核内的全部 DNA分子；线粒体基因组则是一个线粒体所包含的全部DNA分子；叶绿体基因组则是一个叶绿体所包含的全部DNA分子。在遗传学中，Ka/Ks或者dN/dS表示的是异意替换（Ka）和同意替换（Ks）之间的比例。这个比例可以判断是否有选择压力作用于这个蛋白质编码基因。异意替换导致氨基酸的改变，而同意替换由于密码子虽然改变，但是仍旧对应的是同一氨基酸，所以是“同意”。 不导致氨基酸改变的核苷酸变异我们称为同义突变，反之则称为非同义突变。一般认为，同义突变不受自然选择，而非同义突变则受到自然选择作用。在进化分析中，了解同义突变和非同义突变发生的速率是很有意义的。常用的参数有以下几种：同义突变频率(Ks)、非同义突变频率(Ka)、非同义突变率与同义突变率的比值(Ka/Ks)。如果Ka/Ks1，则认为有正选择效应。如果Ka/Ks=1，则认为存在中性选择。如果Ka/Ks1，则认为有纯化选择作用。表观遗传就是不基于DNA差异的遗传。即细胞分裂过程中，DNA 序列不变的前提下，全基因组的基因表达调控所决定的表型遗传。表观遗传学就是研究不涉及DNA序列改变的基因表达和调控的可遗传变化的，或者说是研究从基因演绎为表型的过程和机制的一门新兴的遗传学分支。基因印记是指在配子或合子的发生期间，来自亲本的等位基因或染色体在发育过程中产生专一性的加工修饰，导致后代体细胞中两个亲本来源的等位基因有不同的表达方式，又称遗传印记或配子印记。它是一种伴有基因组改变的非孟德尔遗传形式，可遗传给子代细胞，但并不包括DNA序列的改变。 microRNA（miRNA）是一种机体内源性表达的单链小分子RNA，位于基因组非编码区，本身不具有开放阅读框（open reading frame，ORF），具有高度保守性，时序性和组织特异性。miRNA广泛存在于各种真核细胞中，不编码任何蛋白质，长度仅为2024nt。成熟的miRNA 5端有一个磷酸基团，3端为羟基，由具有发夹状结构的约7090nt的单链RNA前体经过Dicer酶加工后形成。成熟的miRNA形成RNA诱导的基因沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）作用于靶点mRNA，通过对mRNA剪切或抑制其翻译过程而调控基因的表达。目前人们还不明确miRNA及其靶mRNA之间的作用机制。 最近有研究指出，miRNA在细胞生长、发育、分化、死亡等生物过程中起着重要的作用，同时，miRNA参与了血细胞生成、胰岛素分泌、神经系统构成和人类癌细胞生长等不同的过程，因此，非常有必要开发有效的实验工具来测定miRNA。目前检测miRNA的方法主要有Northern印迹分析，微点阵（microarray）分析和实时定量PCR（quantitative Real-Time PCR）。下面将对这三种方法做简单的介绍及比较。1、Northern印迹分析（Northern Analysis） Northern印迹是基于杂交检测RNA的常用方法，它是最早用于miRNA分析的几种方法之一。这种方法简单易行，大部分实验室都可以进行操作，不需要额外的资金投入与设备更新。不足之处：1）Northern分析的过程涉及大量人工操作，并且每次仅有一条miRNA探针与一个RNA印迹杂交，因此，它适用于不适用于大规模的筛选实验。尽管如此，在简单探究miRNA功能机理的实验中，Northern印迹分析还是能够满足研究需要的。2）Northern印迹分析的动态范围只能达到两个数量级，这就引发了一个严重的问题，进行实验的细胞内的miRNA分子的数量要达到比较大的范围，例如，能够检测40,000个miRNA分子每细胞的印迹条件实际上却不能准确检测10个miRNA分子每细胞。另外，由于Northern印迹以杂交为原理，它通常不能有效区分具有细微序列差异的miRNA。例如，同一个家族中的miRNA let-7c与let-7a和let-7b之间仅有一个碱基的差异，导致Northern印迹分析无法清晰区分它们。此外，Northern印迹实验的重复性较弱。3）Northern印迹耗时，耗量。进行一次miRNA检测需要3个工作日，不仅减慢了实验进程，也增加了杂交膜上信号扩散的风险。此外，Northern印迹大概需要5到10微克的总RNA量上样量才能成功检测出miRNA，增加了检测干细胞或人类初期肿瘤细胞这些稀少的样品的难度，甚至无法顺利开展实验。2、微点阵（Microarray）分析 微点阵分析也是基于杂交的原理来检测miRNA，它通过测定特定过程中miRNA的表达水平，来分析了解miRNA的表达调控机制以及由miRNA调控的基因的表达。微点阵采用高密度的荧光标记探针与RNA样本杂交，通过荧光扫描获得表达图谱，借助相应软件进行miRNA的表达分析。由于在设计探针时可以包含所有可用miRNA序列，因此微点阵可以作到高通量的miRNA分析。不足之处：1）微点阵仍然需要足够的RNA初始样本，大约为每个微点阵5微克。2）由于微点阵以杂交为基础，因此同Northern印迹一样无法清楚的区分序列差异很小的miRNA。另外，微点阵也很难区分具有相同序列的前体miRNA和成熟的活性miRNA。3、定量实时PCR（Quantitative Real-time PCR） 定量实时PCR技术通过扩增技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。起始目标核酸的拷贝数越高，就越快观察到荧光强度的显著增加。定量实时PCR中TaqMan (Roche Molecular Systems Inc., Basel, Switzerland)特异性分析依赖于两个PCR引物和一个序列特异的TaqMan探针的联合作用。这些荧光标记的探针利用Taq DNA聚合酶的5核酸酶的活性，极大的提高了实时PCR的检测，从而使得对PCR后期加工中探针的降解分析的评估成为可能。尽管定量实时PCR相比Northern分析和微点阵需要较少的样本，并且显著的提高了动态范围和敏感度，但是这种技术在检测miRNA时还是遇到了挑战。由于成熟miRNA长度较短，难以设计成熟miRNA的有效的特异引物和探针，于是很多研究者对较长的前体miRNA分子进行定量实时PCR检测，利用前体miRNA的水平作为成熟的活性miRNA的替代标记。然而细胞内存在的前体miRNA的水平不能有效的指示相应的成熟miRNA水平，因此这种方法无法达到预想中的效果。前已有新的定量实时PCR的方法被用来解决检测miRNA中遇到的这些问题。这种新方法利用一种茎环（stem-loop）状引物进行miRNA的反转录，然后再进行定量实时PCR。这个茎环状结构对成熟的miRNA 3 端具有特异性，能够将非常短的成熟miRNA分子扩展并且增加一个通用的3 引物位点进行实时PCR。这种茎环状结构也被认为可以形成一种空间的阻碍以防止对前体miRNA进行PCR引导。然后就可以利用实时PCR进行高特异性的定量检测miRNA的表达水平。这种实时PCR的优点是：1）可以在起始样本量很小的情况下进行（RNA总量在1到10ng之间）。2）动态范围达到了7个数量级，因此可以检测大量或者少量的miRNA。3）这种方法可以区分只有一个碱基差别的miRNA。4）和传统的定量实时PCR检测相比，在实验室中生产这些新的茎环状结构是很快并且很简单的。Real-time PCR方法克服了由于miRNA分子太短（22 nt）带来的定量最大难题而引入靶向特异性的反转录引物，该RT引物可以与成熟miRNA结合，形成反转录引物/成熟miRNA复合物，并在miRNA的5末端延伸。这样就得到一个较长的反转录扩增因子，为进一步做实时定量PCR提供了符合要求的摸板。RT引物有两种类型：1. Oligod（T）特异的RT引物（QIAGEN产品为主）由特异序列+（T）20左右+兼并碱基V或VN组成。（所有miRNA可以公用一个Oligod（T）的RT引物，但是RNA在反转录前需要进行末端Poly（A）加尾）2. 茎环状结构的RT引物（ABI产品为主）由可以自身呈环茎状的特异序列+6到8个miRNA3端反向互补碱基组成。（一条miRNA序列特异对应一个茎环状结构的RT引物）三、引物探针设计由于反转录后得到的cDNA 为（miRNA+RT引物）复合片段。上游引物可以在miRNA自身序列上找，如果GC含量太低，可以在上游引物5端加入GCGCC等的保护碱基；下游引物在RT引物的反向互补序列中找；也就是说：上游引物是每个miRNA所特有的，下游引物为通用引物就可以了。荧光定量PCR检测方法有SYBR Green染料法和TaqMan探针法。前者需要调整引物浓度以及引物扩增效率，把引物二聚体调整到越小越好；探针法则需要设计荧光探针，这其中由于MGB探针需要碱基数量少和特异性好的特点而被推荐。探针设计位置有3个：完全与miRNA序列相同、在miRNA与RT引物的交叉点、完全在RT引物上；这其中又有正向和反向互补两种情况。至于探针要设计在那个位置，根据自己试验情况而定，本人以为效果都差不多。四、试验操作流程1. RNA提取在以上两种RT引物中，Ologod（T）特异引物所需要的RNA尽量是用特殊试剂盒提取的小RNA，而茎环状结构RT引物需要RNA正常提取就好。另外由于所需样本不同RNA提取方法也不完全相同，普通组织样本和细胞可以研磨用Trizol+氯仿抽提；血液和植物样本需要前期处理后再用Trizol+氯仿或用专门的Kit抽提。 2. 反转录确认用Oligod（T）特异RT引物时，RNA需要进行3Poly（A）加尾处理。反转录的酶没有特殊要求，操作请按照各自反转录酶的说明书进行就好。这里特别注意的是：反转录过程中用到的RT引物（常规的是随机引物、Oligod（T）和特异引物）是前面提到的Ologod（T）特异引物和茎环状结构RT引物，它们分别属于Oligod（T）和特异引物范畴，在反转录中不需要另外添加其他RT引物。在确定反转录温度中请特别注意您使用的是哪一种RT引物，而设定相应的反转录温度。 3. 荧光定量PCR优化PCR体系（引物浓度、Mg浓度、dNTP浓度、退火温度等），正常操作。遗传学对基因表达的调控及其机制 生物遗传信息表达正确与否，既受控于DNA 序列，又受制于表观遗传学信息。表观遗传学主要通过DNA 修饰、蛋白质修饰与非编码RNA 调控3 个层面上调控基因表达。1 DNA 甲基化（DNA methylation）甲基化是指生物分子在特定的酶系统催化下加上甲基（-CH3）的生物化学反应，是普遍存在原核生物和真核生物中的DNA 修饰作用。甲基化没有改变基因序列，但对基因表达起调控作用。在哺乳动物DNA 分子中，甲基化一般发生在胞嘧啶（C）碱基上。在DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferases,DNMTs）催化下，甲基从S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethione）转移至胞嘧啶5 位上，形成5- 甲基胞嘧啶（m 5C）。在发生甲基化的胞嘧啶后通常紧跟着一个鸟嘌呤（G）碱基。因此，通常称胞嘧啶- 磷酸- 鸟嘌呤或CpG 的甲基化。在基因组中富含CpG 位点的区域称为CpG 岛（CpG islands），人基因组序列约有29,000 CpG岛，约60%的人基因与CpG 岛关联。CpG 岛通常与基因表达的启动序列区域（promoter regions）相关，CpG是否甲基化在基因表达中起重要作用。一般说来，DNA 甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则可诱导基因的重新活化和表达。脊椎动物基因的甲基化状态有三种：（1）高度甲基化状态, 如女性两条X 染色体中的一条处于失活状态；（2）持续的低甲基化状态, 如细胞存活所需的一直处于活性转录状态的管家基因；（3）去甲基化状态, 如生物发育的某一阶段或细胞分化的某种状态下，原先处于甲基化状态的基因，也可以被诱导去除甲基化，而出现转录活性。健康人基因组中，CpG岛中的CpG位点通常是处于非甲基化状态，而在CpG岛外的CpG 位点则通常是甲基化的。这种甲基化的形式在细胞分裂的过程中能够稳定的保留。当肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG 序列非甲基化程度增加，而CpG 岛中的CpG 则呈高度甲基化状态，以致于染色体螺旋程度增加及抑癌基因表达的丢失。DNA 甲基化不仅影响细胞基因的表达，而且这种影响还可随细胞分裂而遗传并持续下去。哺乳动物一生中DNA甲基化水平经历2次显著变化，第一次发生在受精卵最初几次卵裂中，去甲基化酶清除了DNA 分子上几乎所有从亲代遗传来的甲基化标志；第二次发生在胚胎植入子宫时，一种新的甲基化遍布整个基因组，甲基化酶使DNA 重新建立一个新的甲基化模式。细胞内新的甲基化模式一旦建成，即可通过甲基化以“甲基化维持”的形式将新的DNA 甲基化传递给所有子细胞DNA分子。2 组蛋白修饰（histone modification）组蛋白是一类小分子碱性蛋白质，作为真核生物染色体的基本结构蛋白质。组蛋白的共价修饰包括赖氨酸残基乙酰化、丝氨酸残基和苏氨酸残基的磷酸化、谷氨酸残基的ADP-核糖基化、赖氨酸残基的泛素化与类泛素化（sumolyation）、赖氨酸残基和精氨酸残基的甲基化等。赖氨酸残基的-氨基可形成一甲基化、二甲基化或三甲基化物，精氨酸残基可形成一甲基化或二甲基化物。这些修饰成为组蛋白印记（histone imprints），现在也称为“组蛋白密码”（histone code）。组蛋白密码可被一系列特定的蛋白质所识别，并将其转译成一种特定的染色质状态，以实现对特定基因表达的调节，扩大了遗传密码的信息储存量。3 染色质重塑（chromatin remodeling）真核生物染色质是一切遗传学过程的物质基础，染色质构型局部和整体的动态改变，是基因功能调控的关键因素。染色质的基本结构单位是核小体（nucleosome），每个核小体是由5种组蛋白和DNA 链200bp 组成，其核心颗粒是由H2A、H2B、H3 和H4 四种组蛋白各两个分子的八聚体和绕1.8 圈的147bp组成。当DNA 绕到两圈时，约用