用正交法测定几种因素对蔗糖酶活性的影响.doc

专业： 姓名： 学号： 日期： 地点： 装 订 线实验报告课程名称：生物化学实验（甲） 指导老师： 成绩：_同组学生姓名： 一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 用正交法测定几种因素对蔗糖酶活性的影响1、 实验目的和要求：1. 初步掌握正交试验设计法的使用；2. 运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度和pH值这四种因素对酶活力的影响。2、 实验内容和原理：酶的催化作用是在一定条件下进行的，它受多种因素的影响，如酶浓度、底物浓度、温度、 pH值、抑制剂和激活剂等都能影响酶催化的反应速度。通常在其他因素恒定的条件下，通过某一因素在一系列变化条件下的酶活性测定求得该因素的影响，这是单因素的试验方法。对于多因素的试验可以通过正交试验设计法来完成。正交法是借助于正交表，简化的表格计算，正确分析结果，找到实验的最佳条件，分清因素的主次，这样就可以通过比较少的实验次数达到好的实验效果。本实验运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度、pH值这四个因素对酶活性的影响，并求得在什么样的底物浓度、酶浓度、温度和pH值时酶的活性最大。正交表 Ln（ tq）L 正交表的代号n 处理数（试验次数）t 水平数q 因素数合适的正交表，是指要考察的因素的自由度总和，应该不大于所选正交表的总自由度。本实验中： 试验次数 n = q( t1 )+1= 4（31）+19总自由度 V总= n-1各列自由度 V列 = K（该列水平数）1本实验选用四个因素，每个因素选三个水平，四个因素各占一列，那么四个因素的自由度分别为：V1 = 31 = 2， V2 = 31 = 2， V3 = 31 = 2， V4 = 31 = 2。四个因素的自由度总和 = V1 + V2 + V3 + V4 = 8因为各因素自由度总和是8，它没有超过L9（34）的总自由度= 91 = 8。所以选择正交表L9（34）是适合的。正交表都应具有以下两个特性：（1）在每一列中，各水平出现的次数相等。即在任何一列中，数字1和数字2和数字3都出现三次（几个水平就均出现几次）。（2）任何两列中，横行组成的数对出现次数相等，均出现一次以上这些特点保证了用正交表安排的试验计划是均衡搭配的，因此分析数据比较方便，可进行综合比较，结果比较可靠。3、 实验材料与试剂：1、实验材料 蔗糖酶溶液（样品1:10稀释）2、实验试剂 5%蔗糖（A.R.）溶液（W/V）； 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH3.6、4.6、5.6； 3,5二硝基水杨酸试剂。4、 实验器材与仪器：1. 试管及试管架；2. 吸量管；3. 恒温水浴箱 （37、50、65、100 ）；4可见光分光光度计。5、 操作方法和实验步骤：1、实验设计（1）确定试验因素和水平 本实验取四个因素，即底物浓度S、酶浓度E、温度、pH值。每个因素选三个水平，实验因素和选用水平如表1。 表1 因素、水平表水平 因素【S】（ml）【E】（ml）温度（）pH10.51.0503.620.20.6375.630.80.2654.6（2） 选择合适的正交表（3） 在所选的正交表上进行表头设计 表2 表头设计实验号 水平 因素1【S】2【E】3温度4pH1111121222313334212352231623127313283213933212、 试验安排 表3 实验安排表试剂试验号2491683575%蔗糖溶液（ml）0.50.20.80.50.20.80.50.20.80.2mol/L乙酸缓冲液 （ml）pH5.61.0pH4.61.0pH3.61.0pH5.61.0pH4.61.0pH3.61.0pH5.61.0pH4.61.0pH3.61.0蒸馏水 （ml）0.90.81.00.51.60.61.31.20.237预温5min50预温5min65预温5min蔗糖酶溶液 （ml）0.61.00.21.00.20.60.20.61.0温度 （）37反应10min50反应10min65反应10minDNS （ml）111111111沸水浴5min蒸馏水 （ml）555555555A520nm 另取试管一支作非酶对照：加5%蔗糖溶液0.5ml，缓冲液1.9ml。先加DNS 1ml摇匀室温放置5分钟后再加入蔗糖酶溶液0.6ml摇匀室温放置10分钟，1005min，再加入蒸馏水5ml，混匀后在520nm处测光密度值。6、 实验数据记录和处理： 实验号水平 因素1【S】ml2【E】ml3温度（）4pH值实验结果A520nm11 0.51 1.01 501 3.6 21 0.52 0.62 372 5.6 31 0.53 0.23 653 4.6 42 0.21 1.02 373 4.6 52 0.22 0.63 651 3.6 62 0.23 0.21 502 5.6 73 0.81 1.03 652 5.6 83 0.82 0.61 503 4.6 93 0.83 0.22 371 3.6 I（一水平实验结果总和）II（二水平实验结果总和）III（三水平实验结果总和）I/3 II/3III/3极差分析表格中的数据可知：各因素对酶活力影响程度的大小为 且蔗糖酶反应的最佳条件为：7、 实验结果与分析：8、 讨论、心得：1、 为了使得反应液的OD值在一个比较合适的范围内，可以先做一组预实验，预实验的各个因素都应该是理论上的最佳条件，测得的OD值最好在1.6左右，假如OD值过高或者过低，则调