苹果果实腐烂病菌征求意见稿-6.26.doc

SN/T 200发 布中 华 人 民 共 和 国国家质量监督检验检疫总局200-实施200-发布苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌检疫鉴定方法Detection and identification ofSphaeropsis pyriputrescens（送审稿）SN/T 200SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准ICS备案号1SN/T 200前 言本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局，青岛农业大学，北京金纳信生物科技有限公司。本标准主要起草人：邓丛良，李宝华，张凯，吕玉峰，梁新苗，汪万春，赵焕生，高文娜，。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。II苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了植物检疫中苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于进境水果中苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌的检疫鉴定。2 有害生物信息苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌（Sphaeropsis pyriputrescens）属真菌界（Fungi），半知菌亚门（Deuteromycotina），腔菌纲（Coelomycetes），球壳孢目（Sphaeriales）。主要分布于美国，寄主为苹果和梨，该病菌主要通过带病菌的果实远距离传播。3 仪器设备、试剂及用具3.1 仪器、设备、用具超净工作台、生物培养箱、电子天平、微量移液器、实时荧光PCR仪、高速冷冻离心机、高压灭菌锅、冰箱、解剖刀片、白磁盘保湿盒、研钵、吸头、eppendorf管、PCR管、生物显微镜，酒精灯、三角瓶（500mL）、镊子、载玻片、盖玻片。3.2 试剂和培养基检验所需的药品均为分析纯。检验中用到的培养基有PDA培养基其配制方法见附录A。3.3 标准菌株Sphaeropsis pyriputrescens Xiao and J.D.Rogers4方法原理4.1 组织保湿法将疑似携带球壳孢腐烂病菌的果实放于保湿箱中，28培养箱内在自然光或者弱光下培养，一周后观察有无分生孢子器形成。4.2 分离培养法取可疑的病果用70%的乙醇喷雾消毒，超净工作台上自然干燥。用解剖刀将病果发病部位的表皮部分去掉，在病健交界处切下小块果肉，在PDA培养基内（2022）培养3-14天，观查菌落生长情况。4.3 子实体诱发实验为了方便识别病菌，PDA培养基在20下用黑暗和荧光交替培养12h来诱导孢子或者子实体的形成。4.4 致病性测定于取采收前2-4周，择取近期没有接触过杀菌剂的苹果或者梨果实进行致病性实验。果实用0.5% NaOCl的表面消毒5 min，无菌水漂洗3次，置无菌条件下干燥。将Sphaeropsis pyriputrescens在PDA培养基上交替培养（12 h光照/12 h黑暗）3周，诱导产生分生孢子，用分生孢子悬浮接种果实。孢子悬浮液用纯净水配制，浓度调节为每ml1 104个孢子，用直径为4mm的针头，扎入果实内4mm，造成的伤口，然后用吸液管滴入20 L分生孢子悬浮液接种。将接种果实用果实网套包裹，放于纸箱中用纤维板开，放于0下保存，6-8周呈现腐烂症状。为了验证对梨果实的蒂部和萼端致病性，用灭菌解剖刀在果实的蒂部平切，造成伤口，用灭过菌的纱布（2 2 cm）蘸下菌悬液，包裹蒂部和萼端接种。以蘸有蒸馏水的纱布包裹的梨果实为对照。为了促进病菌侵染，将接种水果放在铝盘上，再将盘子置于有水的密闭容器中（2022）过夜。然后去掉接种纱布，将果实放于纸箱上，按上述方法存放， 2-3个月后呈现腐烂症状。4.5 实时荧光PCR检测45.1 DNA提取CTAB法：参照分子克隆实验指南（第三版）；或参照公司真菌DNA提取试剂盒，见附录A。45.2 实时荧光PCR检测对提取的DNA，用设计的特异性引物和探针进行实时荧光PCR检测。实时荧光PCR反应体系和条件见附录C。4.6 原理苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌造成的果实症状、病原菌形态、培养性状和基因组序列是该病菌检疫鉴定方法的依据。5 检测5.1 症状特征果实蒂部和萼部腐烂是果实球壳孢腐烂病主要症状。病组织或者变硬或者柔软，表面褐色的。随着病情的发展，部分病斑表面形成黑色的分生孢子器，分生孢子器分布于病组织的表面或者半埋生于组织内。病组织表皮褐色或深褐色，病部果肉褐色，随时间延长病部颜色加深。在高湿的条件下，整个果实表面布满菌丝体和分生孢子器。病果切开后散发 类似“绷带”一样的气味。5.2 病菌培养特征球壳孢腐烂病菌在PDA平板上培养，生长初期为浓密、无色的菌丝， 20C下黑暗培养7-14天后，菌丝逐渐变为黄色，菌落中有黄色素沉积是识别该菌的主要特征。20C条件下，在PDA培养基上，通过12h光照/12h黑暗的交替培养，3周后可产生大量分生孢子器。5.3 分生孢子形态特征球壳孢腐烂病菌菌的分生孢子褐色，单孢，一端膨大，末端扁平，分生孢子大小14-17 X 8-10 m。5.4 致病性结果接种果实应呈现典型的球壳孢腐烂病症状，经病原菌再分离获得的纯菌株应具有与原菌株保持一致的病原特征，对照不出现球壳孢腐烂病症状。5.5 实时荧光PCR检测进行实时荧光PCR检测后，看有无Ct值。6 结果判定待测样品的Ct值小于或等于35时，如果症状或者病原菌培养性状与第5章节鉴定特征吻合的，则判定检出苹果果实腐烂病菌；待测样品的Ct值小于35时，如果症状或者病原菌培养性状和致病性测定与第5章鉴定特征吻合的，则判定检出苹果果实腐烂病菌在常规的生物学方法检测中，若发现症状、病原特征及致病性测定与第5章描述特征相吻合，则判定检出球壳孢腐烂病菌。7 样品和菌株保存7.1 样品保存检出样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出苹果果实腐烂病菌的样品应保存于4C冰箱，以备复核，保存期满后经灭菌后方可处理。7.2 菌株保存从检测样品中分离到鉴定为苹果果实腐烂病菌的菌株，应妥善保存。将菌株接种于PDA培养基斜面上，20C培养46天，然后4C冰箱保存。或液体培养至对数生长期，然后加入20灭菌甘油，-80C长期保存。7.3结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。PCR检测需有电泳结果图片，实时荧光PCR需要有实验结果图片。8 参考性文献1 Xiao CL, RogersJD. 2004.ApostharvestfruitrotindAnjou pears caused by Sphaeropsis pyriputrescens sp. nov. Plant Dis 88:114118.2 Rogers JD, Boal RJ. 2004. First report of a new postharvest fruit rot on apple caused by Sphaeropsis pyriputrescens. Plant Dis 88:223.3 Swart WJ, Wingfield MJ, Palmer MA, Blanchette RA. 1991. Variation among South African isolates of Sphaeropsis sapinea. Phytopathology 81:489493.4 Meheriuk M. 1993. CA storage conditions for apples, pears, and nashi. In: Proceedings from the Sixth International Controlled Atmosphere Research Conference, Cornell University, Ithaca, New York, June 1517, 1993. p819841.5 Snowdon AL. 1992. Post-harvest diseases and disorders of fruits and vegetables. Vol. 1. General instruction and fruits. CRC Press Inc., Boca Raton. 302 .附录A （规范性附录）试剂及培养基配方A.1 试剂A.1.1 CTAB缓冲液：2% CTAB2% PVP1.4 mol/L NaCl100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）25 mmol/L EDTA（pH8.0）0.2%巯基乙醇A.1.2 TE缓冲液（pH8.0）：10 mmol/L Tris-HCl（pH7.6）1 mmol/L EDTA（pH8.0）A.2 PDA培养基：马铃薯（去皮） 200 g 葡萄糖 20 g琼脂粉 15 g 蒸馏水 1000 ml附录B （规范性附录） 真菌DNA提取方法B.1真菌DNA的提取采用DNA提取试剂盒，具体步骤如下：B.1.1 取100 mg菌丝，用液氮研磨至粉末状；B.1.2加入650 L的Solution A和0.9 L的RNase A1，温和研磨30 s；B.1.3收集650 L研磨好的匀浆液至离心管中，65保温5 min；B.1.4加入400 L的Solution B，振荡混合；B.1.5加入1 mL的4预冷的Solution C，充分混合后，12 000 r/min离心2 min；B.1.6弃去上层有机相，再加入1 mL的4预冷的Solution C，充分混匀后，12 000 r/min离心2 min；B.1.7弃去有机相，然后将水相溶液（无色下层）转移至置于Collection Tube上的Filter Cup中，12 000 rpm离心1 min；B.1.8弃去Filter Cup，在滤液中加入400 L的DB Buffer，混合均匀；B.1.9将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上，将上述操作8混合溶液转移至Spin Column中，12 000 rpm离心1 min，弃滤液；B.1.10将500 L的Rinse A加入至Spin Column中，12 000 r/min离心30 s，弃滤液；B.1.11将700 L的Rinse B加入至Spin Column中，12 000 r/min离心30 s，弃滤液；B.1.12重复步骤B.1.11；B.1.13将Spin Column安置于新的1.5 mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入50200 L的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1 min；B.1.14 12 000 r/min离心1 min洗脱DNA。B.2真菌DNA的提取采用CTAB方法，具体步骤如下：B.2.1 称取0.2 g 菌丝，在液氮中研磨成粉末；B.2.2 转入1 ml 65预热的抽提缓冲液（CTAB）中，颠倒混匀，65温育5 min，中间混匀两次；B.2.3 加入等体积氯仿苯酚（1/1）混匀，12000 r/min离心15 min，取上清，等体积氯仿苯酚（1/1）再抽提一次；B.2.4 上清加入1/10体积3 M醋酸钠溶液轻轻混匀，再加入2倍体积冷冻100%乙醇在-20沉淀30 min，12000 r/min离心10 min；B.2.5 沉淀用70%乙醇洗两遍，置37温箱干燥后，用TE溶解，1.0琼脂糖电泳检测，-20保存。 附录C （规范性附录） 实时荧光PCR检测方法C.1 实时荧光RT-PCR引物及探针（ITS序列保守区）名称序列位置FP5- CCCACCCTCTGTCTACAGTACCTC -3-312-25RP5- GAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAG -3147-169Probe5-FAM- ACTCAGACGACACTGATGATATGGGTTT -TAMRA-3103-130C.2 实时荧光PCR反应体系名称储存液浓度终浓度加样量2Mix2112.5 L正向引物10 mol/