MLVA分型技术和实验操作步骤.ppt

1 多位点可变数目串联重复序列 MLVA 分型技术和操作步骤 李伟中国CDC传染病所传染病预防控制国家重点实验室PulseNetChina第一期培训2010 06 19 2 病原菌分子分型的目的 长期研究病原菌的遗传进化病原菌适应来自宿主的高选择性压力因点突变 重组 包括基因转移 等遗传变异短期研究了解病原菌的适应性感染溯源 3 分子分型方法 序列或分类资料为基础的等位基因 多位点序列分析 multilocussequencetyping MLST 多位点可变数目串联重复序列分析 Multiple LocusVariable numbertandem repeatAnalysis MLVA 图像分析 脉冲场凝胶电泳 PFGE 随机扩增多态性DNA分析 randomamplifiedpolymorphicDNA RAPD 扩增片断长度多态性分析 amplifiedfragmentlengthpolymorphism AFLP 核糖体分型 ribotyping 等 4 MLST 结果无偏性unambiguousresults有相应的数据库支持internationaldatabases区分度低 Lowdiscriminationpower高花费 highcost sequencing不适合常规检测和暴发调查 unsuitableforroutinesurveillanceandepidemiologicalstudies 5 VNTR VNTR 可变数目出那里重复序列 VariableNumberofTandemRepeats AACTTTACGTTC AAATTAACGTTC AAATTAACGTTC AAATTTACCTTG 侧翼序列 重复单元 6 18bp 3 AACCTAAACAGACCATGGCGCTGGGCTGCTGGAGCGAGCAGGAGCTGGTGGGCGAGCAGGAGCTGGTGGGCGAGCAGGAGCTGGTGGGCGAGCAGGGA VNTR产生的原因 聚合酶的滑链复制 7 StrainCDC1551 5x15bp StrainH37Rv 4x15bp strainCDC1551 230bp strainH37Rv 215bp PCRprimers CTCCCACACCCAGGACACCGGCCTACCCAACATTCC TRF软件 TandemRepeatsFindersoftware minisatellites u psud fr VNTR位点的确定 测序分析 8 VNTR和等位基因 atgggtaatccgtcgACGCACGCACGCgccaatcgatacgat Primer F 上游序列 VNTR重复 下游序列 重复拷贝数 扩增大小 上下游序列 重复单元的大小 Primer R 取整 就近取整或去除小数取整 9 串联重复序列可变重复数目的判定 10 MLVA方法 多位点可变数目串联重复序列分析可变数目串联重复 VNTR MLVA方法 即VNTR的数组例如 MLVA1型735266210233136ST1 MLVA1型别菌株血清型TR1TR2TR3TR4TR5TR6TR7TR8TR9MLST其他特征 MLVA1410461531 719123026ST81 11 分析软件 BioNumerics 命名MLVA型 MT1 MT85评价各位点的分辨力 Nei sindex 1 allelefrequency 2评价MLVA方法的分辨力 Simpson sindex 1 nj nj 1 N N 1 聚类分析构建最小生成树 12 MLVA实验操作 一 模板制备 DNA提取模板或水煮模板二 PCR扩增多重PCR反应三 扩增条带大小判断 一 毛细管电泳 1 引物标记2 多种不同的荧光染料标记上游引物 FAM HEX和TAMRA 3 ABI3730系统进行分析 用内标 ABI自带 二 普通电泳分析 三 测序分析 13 MLVA实验步骤 PCR 2个PCR体系 多重PCR体系 模板制备 DNA提取模板水煮模板 14 扩增条带大小判断 一 毛细管电泳 1 引物标记2 多种不同的荧光染料标记上游引物 FAM HEX和TAMRA 3 ABI3730系统进行分析 用内标 ABI自带 二 普通电泳分析 三 测序分析 15 用500liz内标标定扩增片段大小用genemap软件分析毛细管电泳图 用毛细管电泳来判断片段大小 16 MLVA聚类分析 Bionumerics软件 version4 64 效用均等的分类资料的分析方法 UPGMA unweightedpairgroupmethodusingarithmeticaverages 等分权重分类图 最小生成树的形式展现多态性指数 Simpson sindex 17 MLVA方法的应用 Neisseriameningitidis 23 Streptococcuspneumoniae 20 Streptococcusuberis 12 SalmonellaEnteritidis 10 Salmonellaenterica 5 35 Listeriamonocytogenes 28 29 39 Legionellapneumophila 33 Clostridiumperfringens 37 Leptospirainterrogan 38 38 EscherichiacoliO157 H7 30 46 Clostridiumdifficile 43 Burkholderiapseudomallei 42 Pseudomonasaeruginosa 32 Shigellaspp 13 et al 18 分型方法评价标准 区分度 discriminatorypower 数字化数据库适合实验室间比对 comparebetweenlaboratories 重复性 Reproducible 流行病学相关性 epidemiologicalconcordance 方便快速 convenienceandrapidity 稳定性 stability 容易解释 easytointerpret 花费技术难度 19 MLVA方法的好处 上述的优点具有弹性flexibility 不需要参考菌株作为参照 20 第二部分 发展一种新的MLVA方法 21 基于序列的比较初筛 多态性VNTR位点的PCR鉴定和筛选 核酸测序确定重复模式 区分效能评价 系统测试筛选多态性VNTR 得分大于70 拷贝数大于3 同源性大于75 选择出114位点 现实的模板扩筛选33血清型和21个猪链球菌2型36个电泳行为不同 确认重复序列和重复单元数14个确定指标 9个指标的MLVA策略 22 TRF软件 TandemRepeatsFindersoftware minisatellites u psud fr 串联重复的鉴定 匹配赋2分不匹配 3分碱基缺失 5分最小报告分值50分以猪链球菌为例 鉴定了750 749 790 784测序菌株基因组串联重复位点的比较 23 串联重复的鉴定 24 串联重复的鉴定 25 串联重复的鉴定 26 27 insertedasmallsegment 28 29 多种重复模式 TR2 30 第三部分 MLVA方法在猪链球菌分型中的应用 31 猪链球菌暴发疫情 2005年 四川人感染猪链球菌暴发疫情215人感染 39人死亡波及四川36个县的202个村庄重庆 贵州 广东 江西也发现病例江苏1998暴发疫情25感染 14死亡 Yu H H Jing Z Chen etal 2006 HumanStreptococcussuisoutbreak 四川 China Emerg Infect Dis 12 914 920 32 中国猪链球菌PFGE型别 SmaI酶切 ST7型分为单一的PFGE 01型2005 2006年和2007年中国ST7菌株 PFGE 01型 Ye etal 2006 Emerg Infect Dis 33 猪链球菌MLVA指标和特征 上游引物标记 FAM HEX TAMRA 多重PCRsM1和M2用毛细管电泳M3用普通电泳法 TR1 8低或中等变异度指标TR9高变异度指标 value0 96 34 指标的等位基因型 35 166株猪链球菌血清2型的MLVA分型 36 37 38 2005年江西猪链疫情的分析 冷库的搬运工 JX1冷库猪肉 Jxs1 Jxs2 Jxs3共同的型别MLVA31 江西病猪来源于江苏1998年的三株江苏菌株和2005年的江苏菌株也为MLVA31型 39 输入性人感染猪链球菌分析 2009年4月 泰国籍 我们实验室鉴定 分离菌株 W2886 血清2型 ST1型 40 ClusterI ClusterII 猪链球菌血清二型种群关系 41 中国流行株型别特征 流行株 B组MLST 7PFGE SmaI01在中国 ST1型属于散发菌株 MRP SLY EF M