细菌学检验.doc

第一章细菌学(bacteriology)是微生物学的重要组成部分，也是分子生物学和生物工程学的不可分割的重要内容。细菌具有体积小、繁殖快、代谢类型多样、易变异、易人工分离培养等特点，它代表了生命存在的最简单模型；易于用形态染色、生化反应、血清学试验、动物接种等方法鉴定，微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称.形体微小，结构简单，通常要用光学显微镜和电子显微镜才能看清楚的生物，统称为微生物。生物安全从业人员处理生物危害材料时的措施，以避免感染自己、他人或环境。生物安全性(biological safety)是指用生物学技术(biotechnology)从事研究、开发、生产到实际应用等全过程中所涉及到的安全问题。实验室生物安全防护(biosafety protection for laboratories)是指实验室工作人员所处理的实验对象含有致病的微生物及其毒素时，通过在实验室设计建造、使用个体防护设施、严格遵从标准化的工作及操作程序和规程等方面采取综合措施，确保实验室工作人员不受实验对象侵染，确保周围环境的生物安全。 在细菌学实验室中，实验操作人员应严格遵循三条通用原则1.积极防止操作者在污染的环境中接触生物危害物；2.主动封闭生物危害材料产生之源，防止从操作部位向周围环境释放；3.尽量减少生物危害材料向周围环境意外释放所造成的后果。生物安全实验室生物安全实验室实质是指:通过规范的实验室设计建造、实验设备的配置、个人防护装备的使用（硬件）严格遵从标准化的操作程序和管理规程等（软件）。确保操作生物危险因子的工作人员不受实验对象的伤害，确保周围环境不受其污染,确保实验因子保持原有本性所采取综合措施的实验室。 生物安全实验室三项技术措施样品隔离技术（机械、气幕），防止传染因子进入环境接触人体定向流技术（三级负压系统），防止传染因子扩散消毒灭菌技术（物理、化学），灭活传染因子生物安全防护三原则（三要素）实验室生物安全防护的内容包括：1.安全设备、个体防护装置和措施（一级防护）2.实验室的特殊设计和建设要求（二级防护）3.严格的管理制度和标准化的操作程序和规程等方面采取综合措施来达到：确保实验室工作人员不受实验对象侵染，确保周围环境不受其污染的目的 。一级屏障（primary barrier）是操作者和被操作对象之间的隔离，也称一级隔离二级屏障(secondary barrier) 生物安全实验室和外部环境的隔离，也称二级隔离 微生物危害评估(hazard assessment for microbes) :对实验微生物和毒素可能给人或环境带来的危害进行评估 生物安全柜(biosafety cabinet)是处理危险性微生物时所使用的箱形空气净化安全装置 一般细菌等微生物实验室常用基本设备包括：培养箱（普通培养箱、真菌培养箱和厌氧培养箱）、恒温水浴箱、恒温干燥箱、冰箱，高压蒸汽灭菌器，生物安全柜，显微镜（暗视野显微镜、荧光显微镜和显微摄影装置），离心机，电动匀浆器，薄膜过滤装置以及无菌室使用的主要仪器设备等 生物安全实验室配置要求级别 配备基本要求一级 按一般生物实验室基本配备二级 按一般生物实验室基本配备，加上生物安全操作柜三级 除上设备外，专设有缓冲区、负压实验室区、高压灭菌装置、排气净化系统四级 专设缓冲区、淋浴室、负压实验区、 高压灭菌装置、排气净化系统、污水处理系统微生物危害等级GB 19489-2004实验室 生物安全通用要求 分级依据微生物的致病性；传播方式和宿主范围；具有的有效预防措施；具有的有效治疗措施危险等级I （低个体危害，低群体危害） ：不会导致健康工作者和动物致病的细菌、真菌、病毒和寄生虫等生物因子 。危险等级 (中等个体危害，有限群体危害) ：能引起人或动物发病，但一般情况下对健康工作者、群体、家畜或环境不会引起严重危害的病原体。实验室感染不导致严重疾病，具备有效治疗和预防措施，并且传播风险有限 。危险等级 III （高个体危害，低群体危害）：能引起人类或动物严重疾病，或造成严重经济损失，但通常不能因偶然接触而在个体间传播，或能使用抗生素、抗寄生虫药治疗的病原体。 危险等级 (高个体危害，高群体危害)：能引起人类或动物非常严重的疾病，一般不能治愈，容易直接或间接或因偶然接触在人与人，或动物与人，或人与动物，或动物与动物间传播的病原体。微生物危害等级(国务院条例) 病原微生物实验室生物安全管理条例 分级依据病原微生物的传染性、感染后对个体或者群体的危害程度将病原微生物分为四类一类是指能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物，以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物二类是指能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物 三类是指能够引起人类或者动物疾病，但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害，传播风险有限，实验室感染后很少引起严重疾病，并且具备有效治疗和预防措施的微生物四类是指在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物细菌等微生物实验室守则（一）为确保实验室整洁、个人及他人安全，以及实验顺利进行，书包和各类非必要的物品一律不得带入实验室内。（二）在进行每一实验之前，应预习实习指导并清楚实验的目的、内容，所依据的原理、采用的方法和基本要求。（三）实验进行过程中，应尽量避免在实验室内走动，不得高声谈话，保持室内安静。防止造成大量尘埃、气溶胶而导致污染。（四）各种仪器设备的使用必须严格按照说明书或已定出的操作步骤及要求进行。各种废弃物品应按要求放入指定位置有标识的容器内。（五）实验操作要轻柔、细心谨慎，并认真细致观察，如实作好实验记录。（六）实验中发生和出现操作失误、实验材料泄漏等事故应立即向指导教师报告，并在老师指导下采用合适的方法作及时消毒和去污染处理。（七）实验中凡用过的菌、毒种以及有菌的各种器皿，必须先经高压灭菌后才能洗涤。用过的玻片上的活菌、吸管等用具上的活菌应先浸泡于500010000mg/L有效氯的含氯消毒液中（充分淹没，排除气泡）3060min（或其它有效的消毒剂中处理）后进行清洗。芽孢污染者应延长浸泡时间至120min以上。（八）在进行高压蒸汽灭菌时，必须严格遵守操作规程，注意观察压力、温度变化和维持时间，灭菌进行的全过程中负责消毒者不准离开消毒室。（九）须进行培养的试验材料和物品必须标明名称、编号、组别、姓名及处理方法，置于老师指定的位置进行培养。（十）必须爱护国家财产、厉行节约、严禁浪费；注意节约使用水、电、药品及试剂；易损物品要小心轻放，精密仪器更要特别爱护和细心使用和维护。不慎损坏了仪器设备应及时向指导老师报告，执行报损登记或按规定进行赔偿。（十一）每次实验结果，应以科学的态度，求实的精神认真按记录填写、分析和整理实验报告，及时交指导老师评阅。（十二）实验完毕，应将仪器放回原处，将实验台面收拾整齐，并作消毒处理。离开实验室前应注意按要求脱去衣、帽、口罩等并认真洗手消毒，关好门、窗、灯、火、电源、煤气等，然后离开细菌检验中的注意事项（一）培养基制备时应注意，培养基不应有沉淀，若有则应过滤；制备后的培养基必须及时灭菌以避免细菌繁殖；培养基的装量应不超过容器的1/3，最多不得超过2/3，以免溢出；制好的培养基应存于冷暗处，但不得放置过久，在锥形瓶中者最多不得超过1月，以免水分丢失和染菌；已溶化的培养基应一次用完，开启后不宜再用或反复加热溶化，溶化时不应在电炉上直接加热，以免营养成分破坏，最好以微波炉溶化。（二）在供试品检验的全过程中，必须符合无菌操作要求 。使用灭菌用具时注意不可接触可能污染的任何物品，灭菌吸管不能用口吹吸。（三）在无菌室操作使用酒精灯时，切勿在火焰正上方操作，以免将供试品内细菌杀死。（四）在生物安全工作台上操作时，应避免双手来回出入工作台，在无菌室操作时也应避免操作者来回出入无菌室。（五）不溶于水的供试品必须助溶后再用于试验，以免造成试验误差。供试品稀释时，应注意每一稀释度换一支吸管，且原吸管不得吹洗，以免造成误差。（六）在使用灭菌吸管时，管尖不要接触可能污染的任何容器、用具或物品（瓶口、试管口等）。（七）在用接种针或环接种供试物于平皿或试管时，挑取样本前和接种后均须按要求灼烧，灼烧的长度应足够，并应防止爆溅。接种及划线动作要准确，接种针或环的未灭菌的杆或柄不得触及试管和平皿。（八）在进行血清学试验时，应先进行预试，以了解诊断血清的效价或是否出现典型的凝集模式。在制片时应注意不能让样本溅溢或污染其它物品，用后的玻片等应置消毒液中浸泡消毒或高压灭菌处理后方可清洗或丢弃。（九）在进行10倍递增稀释时，吸管插入稀释液内不得低于2.5，反复冲洗约10次；吸液高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管贴于容器内壁取1ml；靠近液面（但勿接触液面），缓慢地吹出全部供试液至第二个容器中（注意，第一级稀释液所用吸管切勿接触第二级稀释液），将吸管放入盛消毒液的容器内。（十）经验证明，两极稀释和两个平板多不能如实反映染菌量，误差较大；应采用三三制，即稀释三级，每一稀释度用三个平行平板。（十一）取供试液加注于平皿时，供试液须充分混匀，若取上清液或沉淀必然影响结果。但应注意混匀时液体溅溢形成气溶胶。（十二）在将培养基倾注于平皿时，培养基应在溶解后冷至451使用，高于45易造成细菌受损或死亡，低于者易凝固，影响混匀，使用前用水浴保温较好。倾注好琼脂与样品混匀时动作既要轻快又要防止溅溢到平皿盖边或盖上，以免影响结果。（十三）从供试品稀释、加注平皿、倾注培养基的整个操作过程应在1h内完成，以免时间过长而导致细菌繁殖或死亡。（十四）凡供试品品种不同，按规定应分别作阳性对照试验，同一品种不同厂家和批号均应做阳性对照。阳性菌对照未生长者，检验无效。（十五）若进行无菌检验时，其培养期应在规定的时间内观察（一般7d），必须逐日观察，了解培养过程中的变化，不可在培养期结束时才观察结果；若有疑问时，须延长培养时间；对供试品引起培养基混浊者，若无菌生长，应在培养7 d后，取原混浊培养物转种，再培养23d并染色、镜检证明有无菌生长；若供试品含有抑菌物质或因灭菌不彻底等情况可在5d、7d以后生长。实验室质量控制1.仪器设备 用于检验的仪器应定期校准2. 培养基 试剂的质量 使用标准菌株对培养基进行质控3.消毒灭菌效果 采用生物法或化学法监控灭菌效果4.加强记录和核查 建立良好的实验记录、核查制度5.报告质量 对于检样应分层次报告，初步报告和确诊报告。第二章一、临床标本的采集与处理 一般原则1早期采集： 2无菌采集： 3根据目的菌的特性用不同的方法采集： 4采集适量标本：5安全采集：标本的处理： 环境敏感细菌保温并立即送检；其他标本应2h内送检一)血及骨髓样本的采集1采样时间 发病早期、急性期或症状典型时 2采样部位及频率 增加采样的频率和改变由一个部位为多个部位采样，可以提高培养的阳性率 3样本采集的量: 血培养的阳性率与血样本的量直接相关。一般成人血量为每瓶10ml，婴儿为12ml，儿童为35ml 4样本的送检: 立即送到细菌实验室，若不能立即送检时，应将已接种的培养瓶置于温室，切勿置冰箱存放 5注意事项: 无菌操作, 同时需氧和厌氧培养 二)尿液样本的采集1采样时间 一般应采集晨起第一次尿液送检；原则上应在使用抗菌药物前采样。2采样方法 一般采集中段尿10ml左右 3注意事项(1)严防杂菌污染，严格无菌操作。(2)采集到尿样本后应尽快送检，尿液中不得加防腐剂或消毒剂。染色标本检查的基本程序涂片干燥固定染色复染法基本程序初染媒染脱色复染革兰染色法（Gram染色）阳性菌紫色 阴性菌红色结晶紫 初染卢戈碘液 媒染95乙醇 脱色稀释复红 复染1分钟30S1min1分钟革兰染色法 主要是利用G+菌与G-菌细胞壁成分和结构不同而使其着色性不同。G-菌细胞壁中含有较多的类脂质，而肽聚糖含量较少。当乙醇脱色时，脂类溶解增加了细胞通透性，使结晶紫-碘复合物在水洗时易于脱去，导致菌细胞脱色，再经复红复染便染上红色，而G+菌细胞壁中肽聚糖含量多且交联度大，而类脂质含量较少，经乙醇脱色后肽聚糖层孔径变小。通透性降低，细胞仍保留结晶紫颜色，经复红复染其红色被拖盖。使菌体仍呈紫色。抗酸染色法 有些细菌，如结核杆菌、麻风杆菌等分枝杆菌，一般不易着色，一旦染上色后又不易被盐酸酒精脱色，称为抗酸菌。应用这样原理进行染色的方法称为抗酸染色法。一般细菌以及样本中的其它物质都被脱色，抗酸菌则不能，故仍为红色。在蓝色背景上呈红色的细菌即为抗酸菌。 分枝杆菌的抗酸性主要是由于细菌有大量的类脂。石炭酸复红在类脂中的溶解度高于酸酒精，所以不能被酸酒精脱色，其他细菌脂类含量少，所以缺乏抗酸性。培养基(culture medium )是指人工配制的供细菌生长繁殖需要的各种营养物质配制而成的基质。 按用途分类(1)基础培养基：仅含有多数细菌生长繁殖所需要的最基本的营养成分。(2)营养培养基：在基础培养基中添加葡萄糖、血液、血清、酵母浸膏等，以满足对营养要求较高细菌生长繁殖。(3)增菌培养基：多为液体培养基，主要目的是为了增加样本中目的菌的数量，以提高目的菌检出率所用的培养基，因此该类培养基内一般均含有抑制剂，且是具有选择性抑制作用的抑制剂。(4)选择性培养基：用来培养特定的微生物，在培养基中加有除营养成分以外的抑制物质，利于目的菌的检出和识别。(5)鉴别培养基：利用各种细菌分解糖类和蛋白质的能力及其代谢产物的不同，在此类培养基中加有某些特定的作用底物，如糖、醇等，观察细菌在其中生长后对底物的作用，用于检查各种细菌的生化反应，以鉴别和鉴定细菌。( 6 )专用培养基：有的细菌在培养中需要一些特殊的物质（如血液、血清、酵母浸膏、生长因子等）供其生长繁殖，对于这类细菌应用专门的培养基进行培养。按物理性状分类 根据培养基的物理性状，可以将培养基分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基三种。液体培养基主要用于增菌，作生化试验等。半固体培养基琼脂用量为0.5%1%，主要用于观察细菌的动力、分类鉴定、保存菌种以及噬菌体效价滴定等用。而主要用于分离培养的则是固体培养基，固体培养基又分为平板、斜面、高层及高层斜面，琼脂用量为1.5%2%。按成分分类 （1）合成培养基：合成培养基是用多种已知化学组分营养物质配制的培养基。在研究细菌的营养要求、代谢、分类鉴定、生物量测定、菌种选育、遗传分析以及药物对细菌的作用等，宜用合成培养基。根据不同用途，合成培养基可分为简单的含碳源的盐溶液，也可以含有多种有机物质。（2）天然培养基：天然培养基指培养基由含有的化学成分不完全清楚，或化学成分不恒定的天然物质所组成，如蛋白胨、牛肉膏、血液、鸡蛋、马铃薯等。但这些物质成本较低，在细菌学研究中，一般常用这种培养基。培养基灭菌基础培养基：121高压蒸汽灭菌15分钟含糖培养基：113 灭菌15分钟鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌3天3次不耐高温的液体成分：滤过除菌培养基制备的一般程序：调配 溶化 矫正pH 过滤澄清 分装 灭菌 检定 保存细菌接种方法（一）平板划线接种法1曲线接种法 2分区划线接种法 3棋盘格划线接种法 4平板涂布接种法 （二）斜面接种法1划线接种法 2穿刺划线接种法 （三）半固体培养基接种法 垂直刺入培养基中心接近底部，然后将接种针沿原路抽出 （四）液体培养基接种法 用灭菌接种环在菌种管取菌后，伸入培养基管中，在接近液面的管壁上方轻轻磕打，并沾取少量培养基调和，再将试管直立，此接种点就淹没在培养基下。菌落：细菌经一段时间培养后，在固体培养基表面所形成的，肉眼可见的物体（群落）称为菌落。菌苔：在培养基表面，多个菌落融合成一片叫菌苔。菌落的各种特征包括大小、形状、突起、边缘、颜色、表面、透明度和粘度等。 细菌的菌落分为三型：光滑型菌落（S型菌落）、粗糙型菌落（R型菌落）和黏液型菌落（M型菌落） 细菌在鉴定培养基上的特征（1）在血平板上的溶血特征溶血：又叫草绿色溶血，菌落周围血培养基变为绿色环状；红细胞外形完整无缺。 溶血：又称完全溶血，红细胞的溶解在菌落周围形成一个完全清晰透明的环 。溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化；红细胞没有溶解或无缺损。 双环：在菌落周围完全溶解的晕圈外有一个部分溶血的第二圆圈。如产气荚膜梭菌。 （2）气味：通过某些细菌在平皿培养基上代谢活动产生的气味，结合液体培养基上的性状，有助于细菌的鉴定。如铜绿假单胞菌（生姜气味）、变形杆菌（巧克力烧焦气味）、厌氧梭菌（腐败的恶臭味）、放线菌（泥土味）等 （3）色素 脂溶性色素：使菌落本身出现颜色改变。如金黄色葡萄球菌的金黄色色素 水溶性色素：使菌落周围的培养基出现颜色变化。如铜绿假单胞菌的铜绿色色素 浑浊生长：大多数细菌 沉淀生长：少数链状排列的细菌如链球菌、炭疽芽胞杆菌 菌膜生长（表面生长）：专性需氧菌如枯草芽胞杆菌、结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌 半固体培养基用于观察细菌的动力 有鞭毛的细菌除了在穿刺接种的穿刺线上生长外，在穿刺线的两侧均可见羽毛状或云雾状浑浊生长，为动力阳性 无鞭毛的细菌只沿穿刺线呈明显的线状生长，为动力试验阴性 糖类代谢试验该试验检查细菌对加在基础培养基中的特殊的糖发酵(降解)后产酸或产酸产气的能力。 甲基红(MR)试验1原理 某些细菌分解葡萄糖的过程中产生丙酮酸，丙酮酸进一步被代谢成为乳酸，乙酸，甲酸等。使培养基的pH下降至4.5以下，加入甲基红指示剂出现红色为阳性；有些细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其它物质，最终的酸类较少，培养基pH较高，加入甲基红指示剂呈黄色为阴性反应。因此该试验是检查细菌发酵葡萄糖产生并保持稳定的酸性终末产物和克服体系缓冲作用的能力，某些细菌比其他细菌能够产生更多的酸。2方法(1)培养基：葡萄糖蛋白胨水(MR/VP培养基)。(2)试剂：甲基红指示剂。(3)操作：待检菌1824h纯培养物接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，37培养23d，每2ml培养液加2滴甲基红指示剂，立即观察。3结果 MR阳性：培养物有足够的酸，能使培养基表面甲基红试剂仍保持明显的红色(pH4.4)；MR阴性：培养基表面呈黄色(pH6.0)；延迟反应：橙色，应继续孵育到4天，并重复试验。伏普试验(V-P试验)原理 V-P(Voges-Proskauer)试验是检查葡萄糖代谢产生的中性最终产物乙酰甲基甲醇。葡萄糖代谢生成丙酮酸，丙酮酸是糖酵解的关键性中间产物。从丙酮酸开始就有多种可供细菌遵循的途径。产生乙酰甲基甲醇就是细菌分解葡萄糖途径之一。一些细菌(如产气肠杆菌、阴沟肠杆菌等)在分解葡萄糖代谢过程中产生的丙酮酸可进一步脱羧后生成乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中分子氧所氧化，生成二乙酰（丁二酮），与培养基内蛋白胨的精氨酸所含的胍基发生反应，生成红色化合物，即为V-P试验阳性。 方法（Barritt法）(1)试剂：甲液：60g/L -萘酚酒精镕液；乙液：400g/L KOH溶液。(2)操作：首先将被检菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，经37培养4d。再按每2ml培养液中加入甲液lml、乙液0.4ml，充分摇动试管，观察结果。结果 如立即或于数分钟内出现红色反应者为阳性；若为阴性应将试管置37中4h后再进行观察。-半乳糖苷酶试验主要在检测是否含有b-galactosidase利用b-galactosidase活性与否可以来決定微生物是否可以发酵乳糖，而b-galactosidase的活性则可利用o-nitrophynyl,b-D-galactopyranoside (ONPG)来测定，如果有b-galactosidase存在的微生物则会使无色ONPG水解成黃色的o-nitrophynyl(ONP)，因此水溶液会变成黃色。通过使用有机化合物邻位-硝基苯-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)证明有无-半乳糖苷酶活性，可预测细菌发酵乳糖的能力。若有半乳糖苷酶阳性的细菌存在，无色的ONPG试剂被水解，释放出黄色化合物邻位-硝基苯酚(ONP)。阳性-半乳糖苷酶试验就是基于对邻位-硝基苯酚的检测。2方法(1)培养基：l0g/L乳糖肉汤琼脂。(2)试剂：0.01mol/L磷酸盐缓冲液；邻硝基酚-D-半乳糖苷（ONPG）液。(3)操作：首先将被检菌接种到10g/L乳糖肉汤琼脂上，经37培养过夜，以无菌方法取一接种环菌置于0.25ml的生理盐水中做成菌悬液，然后加ONPG液0.25ml，置于37温箱或水浴箱中，分别在20min和3h后观察结果。3结果 如有-半乳糖苷酶，一般在2030min即呈现黄色者为阳性；如无此酶则24h不变色。七叶苷水解试验1原理 某些细菌(如粪链球菌)可水解七叶苷，生成葡萄糖和七叶素(为一种珊瑚状的白色结晶)。七叶素可与培养基中的柠檬酸铁试剂的二价铁离子起反应生成黑色的化合物沉淀，使培养基变黑。2方法(1)培养基：七叶苷培养基。(2)操作：以无菌方法将试验菌接种到七叶苷琼脂斜面培养基上，经371824h培养，观察结果。3结果 培养基变黑色者为试验阳性。若将粪链球菌接种到七叶苷液体培养基中，经3746h培养，培养基即可石蕊牛乳试验1原理 牛乳中含有大量的乳糖和酪蛋白，营养丰富，一般细菌均可在其中生长。一种细菌在石蕊牛奶中可表现一种或几种代谢待性，每种代谢特性对一个特定细菌来说都是特异的。这样，就有助于细菌的鉴定：乳糖发酵，石蕊还原，凝固蛋白，蛋白陈化(消化)，气体产生。有的细菌如产气荚膜梭菌，对牛乳具有强烈发酵反应，产酸、产气、凝固、胨化几乎同时发生。所产生的气体，可将培养基表层的凡士林冲至管口，牛乳可全被胨化变清，这种被称为“汹涌发酵”是为该菌所特有。有的细菌不发酵乳糖，而分解含氮物质，生成氨及胺，使培养基变碱性，石蕊指示剂变蓝紫色。2方法(1)培养基：石蕊牛乳培养基。(2)操作：首先将培养基表面的一层凡士林在酒精灯上熔化，然后以无菌手续取被检菌接种到石蕊牛乳培养基中。接种后将培养基直立，置37温箱培养，观察结果。3结果 产酸：若发酵糖产酸，使石蕊指示剂变为粉红色。产气：若发酵乳糖同时产气者，可冲开覆盖在培养基上的凡士林。凝固：若发酵乳糖产酸甚多，可使酪蛋白凝固。胨化：若将凝固的酪蛋白，继续水解成蛋白胨，此时牛乳培养基的上段则变清。产碱：若不发酵乳糖，分解含氮物质，生成氨及胺，使培养基变碱性，石蕊指示剂变蓝紫色。靛基质(吲哚)试验1原理 细菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚，吲哚可与试剂中的二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚，为红色化合物 2方法(1)培养基：蛋白胨水。(2)试剂：Kovac试剂；欧氏试剂。(3)操作：纯培养物接种蛋白胨水培养基，35培养2448h，沿管壁徐徐加入Kovac氏试剂或欧氏试剂0.5ml，分为两层，观察。3结果 两层液体交界处出现红色为阳性，无色为阴性。硫化氢试验原理 某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸生成H2S，H2S可与加入培养基中的铅或铁离子生成黑色硫化物。2方法与结果(1)琼脂穿刺法：培养基：三糖铁培养基、含硫酸亚铁(或醋酸铅)的半固体培养基。操作：将试验细菌以接种针沿管壁穿刺接种到含醋酸铅或硫酸亚铁培养基中，经3724h培养后，观察结果。结果：培养基变黑色为阳性。当产生硫化氢量少时，为了便于观察结果，在穿刺接种培养时，一定要沿培养基管壁进行。(2)醋酸铅试纸法：培养基：含胱氨酸的半固体培养基、浸有醋酸铅的滤纸条。操作：待检菌穿刺接种培养基，悬挂醋酸铅纸条，37培养2448h。结果：试纸呈黑色为阳性。该法较敏感。尿素酶试验1原理 有些细菌(如某些变形杆菌)具有尿素分解酶，能分解尿素形成大量的氨，使培养基pH上升，而变成碱性，使含有酚红指示剂的培养基变成红色。2方法(1)培养基：尿素琼脂。(2)操作：将待检菌接种于尿素培养基，37培养1824h，观察结果，如为阴性应继续观察4d。3结果 培养基变红为阳性，不变为阴性。 明胶液化试验1原理 某些细菌产生明胶酶可使明胶分解，失去凝固力，使其由半固体转化为液体状态。2方法(1)培养基：明胶培养基。(2)操作：将待检菌穿刺接种于明胶培养基，同时设置对照管(未接种细菌)，20培养57d，观察。在孵育期间，每24h取出试管(包括含细菌的试验管相对照管)放冰箱(或冰浴)内约2h，检查明胶是否已被消化(液化)，每天一次，直到7d，除非发生液化。有许多菌种要证实明胶液化需要延长孵育时间。3结果 半固体培养基不再凝固为阳性。 苯丙氨酸脱氨酶试验1原理 某些细菌产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸和游离氨，加入FeCl3试剂与苯丙酮酸螯合后出现绿色产物，随后绿色可褪去。 延长时间后，所生成的绿色会较快褪色。苯丙酮酸如与柠檬酸铁相遇则产生棕黑色。(1)培养基：苯丙氨酸培养基。(2)试剂：100g/L FeCl3溶液。(3)操作：被检菌浓厚接种于苯丙氨酸琼脂斜面上，37培养1824h，滴加100g/L FeCl3试剂数滴于斜面上，自上流下观察。3结果 须在5min内作出判断，出现绿色为阳性。氨基酸脱羧酶试验1原理 细菌产生的脱羧酶可使氨基酸脱掉羧基，生成胺和CO2，胺可使培养基pH值升高，用指示剂显示这个变化。(1)赖氨酸：赖氨酸经过赖氨酸脱羧酶作用生成尸胺和CO2。(2)鸟氨酸：鸟氨酸经鸟氨酸脱羧酶的脱羧作用，产生腐胺和CO2。(3)精氨酸：L-精氨酸经精氨酸脱羧酶的作用，可产生精胺和CO2。 2方法(1)培养基：氨基酸脱羧酶培养基。(2)操作：待检菌接种于氨基酸培养基及对照培养基，35培养14d。延长时间则常有假阳性出现，假阳性系由蛋白胨中其他种氨基酸分解而造成，故必须同时接种对照管。3结果 检测培养基由黄色变紫色为阳性，黄色为阴性，对照（无氨基酸）为黄色。精氨酸双水解试验1原理 细菌分解精氨酸产碱不限于精氨酸脱羧酶。精氨酸双水解酶可使精氨酸经过两次水解，产生鸟氨酸、两分子氨和一分子CO2 2方法(1)培养基：含精氨酸的氨基酸脱羧酶试验培养基及对照培养基。(2)操作：自斜面培养物接种，作肠杆菌科的鉴定时可覆盖灭菌的液体石蜡，作假单胞菌属的鉴定时则不能覆盖液体石蜡。于37培养。3结果 指示剂颜色转为碱性时为阳性。即溴甲酚紫转为紫色，酚红转为红色。但由培养基pH的改变不能证明是由精氨酸脱羧酶或由精氨酸双水解酶，欲鉴别应作气相色谱分析。肉渣消化试验1原理 肉渣消化试验是测定细菌对蛋白质的另一种分解能力。某些梭菌在生长过程中可将肉渣消化。例如肉毒梭菌有很强的消化能力，庖肉培养基可被消化而呈黑色，有助于和其他梭菌的鉴别。2方法(1)培养基：庖肉培养基。(2)操作：试验菌按常规法接种于庖肉培养基，用蜡笔于培养基的肉渣上缘画一横线作为标记。于37培养数日。3结果 观察管内肉渣的高度有无变化，即可判定肉渣是否已被部分消化。柠檬酸盐利用试验1原理 有些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一的碳源，能在除柠檬酸盐外不含其它碳源的培养基上生长，分解柠檬酸盐，生成碳酸钠，使培养基变成碱性。2方法(1)培养基：柠檬酸盐培养基。(2)操作：被检菌接种于柠檬酸盐琼脂平板上，35培养14d，观察。3结果 培养基由淡绿色变为深兰色为阳性，不变色为阴性。丙二酸盐利用试验1原理 某些细菌利用丙二酸盐作为唯一碳源时，丙二酸钠可被分解生成碳酸钠，使培养基变碱性。2方法(1)培养基：丙二酸钠培养基。(2)操作：被检菌接种于丙二酸盐培养基，于35培养2448h后观察结果。3结果 ：培养基由绿色变为蓝色为阳性，颜色无变化为阴性。氧化酶试验(Kovacs试验)1原理 氧化酶（又称细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，能使还原型的细胞色素C氧化成氧化型的细胞色素C，氧化型细胞色素C又使对苯二胺氧化，生成红色的醌类化合物。2方法(1)试剂：10g/L盐酸四甲基对苯二胺水溶液，或10g/L盐酸二甲基对苯二胺水溶液。(2)操作：取滤纸片沾取待测菌落少许，加试剂一滴，观察颜色变化。也可用滴管吸取试剂，直接将一滴滴在待测菌菌落上，观察颜色变化。3结果：阳性者立即呈现粉红色或红色，颜色逐渐变深至深紫色。过氧化氢酶试验(触酶试验)1原理 过氧化氢酶又称触酶，可使细菌代谢过程中的过氧化氢分解为水和氧。2方法(1)试剂：新鲜配制的3%过氧化氢水溶液。(2)操作：挑取1环固体培养基上的待测菌菌落，放于洁净玻片上或试管内，滴加3%过氧化氢数滴，观察结果。实验时必须用1824h新鲜培养物。陈旧培养物可能使触酶失活，出现假阴性结果。此外，不宜挑取血琼脂上的菌落，因红细胞内含有触酶，会导致假阳性结果。3结果 30s内有大量气泡产生者为阳性，无气泡产生者为阴性。硝酸盐还原试验1原理 某些革兰氏阴性杆菌在代谢过程中，能将培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐与醋酸作用，生成亚硝酸，亚硝酸与试剂中的对氨基苯磺酸反应生成重氮苯磺酸，再与-萘胺结合，生成红色的N-萘胺偶氮苯磺酸。2方法(1)培养基：硝酸盐培养基。(2)试剂：甲液：对氨基苯磺酸0.8g，5mol/L醋酸100ml；乙液：-萘胺0.5g，5mol/醋酸100ml。(3)操作：待测菌株接种到硝酸盐培养基中，35 1824h培养后，加入01ml甲，乙液等量混合液于试管内，观察结果。3结果 出现红色为阳性，无颜色变化为阴性。过氧化物酶试验1原理 过氧化物酶的作用是将过氧化氢中氧转移给可被氧化的物质。试验时，若以联苯胺作为被氧化的物质，试验细菌如有过氧化物酶存在时，加入过氧化氢可使苯胺氧化成为蓝色。2方法(1)试剂：盐酸联苯胺溶液；3%过氧化氢溶液。(2)操作：将盐酸联苯胺溶液与过氧化氢溶液等量混合后，滴加于菌落上，立即观察结果。3结果 阳性者于2min内呈现蓝色。脱氢酶试验1原理 细菌的脱氢酶可使相应的作用物脱去氢，但此作用需要一个可还原的化合物作为受氢体。若用美蓝作为受氢体的话，细菌如有脱氢酶存在，可使美蓝还原成美白(无色)。但是，美白易被空气中氧气所氧化，故此试验应在隔绝空气下进行。 如果用TTC(无色)作为受氢体，在有脱氢酶存在的情况下，TTC可以接受氢而成为红色的Formazan。后者不再被氧气所氧化，所以试验不必在密闭的条件下进行。2方法(1)试剂：1:30000美蓝水溶液；pH7.4磷酸盐缓冲液；0.lmol/L的作用物水溶液。(2)操作：取试验菌肉汤培养物10ml，离心后以缓冲液洗2次，再加缓冲液5ml，制成菌液。取试管3支，每管加美蓝水溶液0.5ml，于第1管和第3管各加菌液lml，第2管加缓冲液lml，置37水浴中15min。第1管和第2管各加作用物2ml，第3管加缓冲液2ml。各管加无菌液体石蜡0.5ml，使覆盖于液面上。置37水浴中，每5min观察一次，记录美蓝变白时间，共观察2h。3结果 若第1管变白即为相应作用物的脱氢酶阳性，不变色为阴性。第2管与第3管为对照管，应不变色。脂酶试验1原理 某些细菌产生卵磷脂酶，即-毒素，在有钙离子存在时，能迅速分解卵磷脂，生成混浊沉淀状的甘油酯和水溶性的磷酸胆碱。2方法(1)培养基：卵黄琼脂培养基。(2)操作：将待检菌划线接种于卵黄琼脂平皿上，于35培养36h。3结果 产生卵磷脂酶的细菌，培养3h后，在菌落周围形成乳白色混浊环，6h后扩散至56mm。磷酸酶试验1原理 磷酸酶是一种单磷酸酯的水解酶，可使单磷酸酯水解，其反应可根据反应基质的不同而异，如用磷酸酚酞为基质，经磷酸酶水解后可释放出酚酞，在硷性环境中可呈红色。 2方法(1)培养基：于1000ml溶化的适宜琼脂培养基并冷至45时，加入过滤除菌的1%磷酸酚酞溶液lml，摇匀后倾注平板。(2)操作：取被检菌的纯培养物接种上述平板，于35培养1824h，于平板盖内加1滴浓氨水，熏蒸片刻。3结果 如有酚酞释出，菌落即变为粉红色。DNA酶试验1原理 DNA酶可将脱氧核糖核酸（DNA）长链水解成由几个单核苷酸组成的寡核苷酸链。长链DNA可被酸沉淀，水解后产生的寡核苷酸则可溶于酸，在DNA琼脂平皿上加入盐酸后，在菌落周围形成透明环。2方法(1)培养基：DNA 酶试验培养基。(2)操作：点状接种待检菌于DNA琼脂平皿上，35培养1824h，用1mol/L盐酸倾注平皿，观察结果。3结果 菌落周围产生透明环为阳性，无透明环为阴性血浆凝固酶试验原理 金黄色葡萄球菌可产生凝固酶，使血浆中的纤维蛋白原转变为纤维蛋白，附着于细菌的表面，产生凝固。凝固酶可分为两种，一种是与细胞壁结合的凝固酶，可用玻片法测定；另一种是菌体生成后释放于培养基中的游离凝固酶，可用试管法测出。2方法(1)玻片法：在玻片上分别滴加新鲜人或兔血浆及生理盐水各一滴，挑取待检菌的菌落，分别与血浆和生理盐水混合，立即观察结果，如血浆中有明显颗粒出现，而生理盐水中无自凝现象为阳性。(2)试管法：小试管3支内各加入1:4稀释的新鲜人或兔血浆0.5ml，其中一支加待检菌1824h肉汤培养物0.5ml，另一支加阳性菌株1824h肉汤培养物0.5ml，再一支加肉汤培养基0.5ml为阴性对照，轻振混匀。3支试管放37水浴中34h，观察结果。3结果 待检菌株管和阳性菌株管出现凝固，阴性对照管不出现凝固，为阳性。血清学试验（serological test）是根据相应的抗原和抗体在适宜条件下，能在体外发生特异性结合的原理，用已知的抗体或抗原来检测未知抗原或抗体。用含有已知特异性抗体的免疫血清与从样本中分离培养出的未知纯种细菌进行血清学试验，以确定致病菌的种或型，这种血清学试验称为血清学鉴定（serological identity），常用方法是玻片凝集试验，并可用免疫荧光，协同凝集，对流免疫电泳，酶免疫、间接血凝、乳胶凝集等试验快速、灵敏的检测样本中致病菌的特异性抗原。外毒素（exotoxin）外毒素来源于革兰阳性菌与部分革兰阴性菌，从活菌中分泌出来，少数由菌崩解后释出，化学成分主要是蛋白质，608030min可被破坏，抗原性很强，可刺激机体产生抗毒素，对组织器官有选择性毒害作用内毒素是革兰阴性菌细胞壁中的脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）组分，只有当细菌死亡破裂或用人工方法裂解菌体后才释放。16024h才被破坏。半定量测定(凝胶法) 凝胶法是各国药典细菌内毒素检查的首选方法。它是根据鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，终点判断采用翻转180的目测法。生物计数法(一)半定量计数法(二)倾注平板法 适合于饮用水、牛乳或尿液及其它样本中细菌的测定。将样本作10倍梯度稀释，然后与营养琼脂混合，经孵育后计数菌落。(三)旋管计数法 将稀释好的样本接种于装有熔化培养基的试管(或小瓶)内，然后作水平转动使培养基凝固，经孵育后计数菌落。计数时，沿培养管的长轴平行划一线，旋转试管，在低倍镜下进行计数。(四)滴液计数法 此法基于用可调微量加样器将一小滴（每滴0.02ml）样本置于琼脂平皿中，经孵育后，在接种面积内计数其菌落数。计数时，应选择液滴显示单颗菌落的平皿，且每液滴区少于40个菌落(1020个菌落最理想)的平皿，用放大镜计数其菌落数。(五)琼脂表面计数法 这是一种不很精确，但很有用的估数法，常用于尿液检查或食品加工厂流水线常规抽样检查。用标准环或微量加样器取样本0.1ml或适量，置于装有适宜培养基并经充分干燥的平皿中央，用短接种环或L玻棒遍涂于培养基表面，经孵育后进行菌落计数。(六)膜滤过滤计数法 含菌液体经滤膜过滤后，细菌将滞留在滤膜上，让含菌滤膜吸收培养基后，进行孵育，计数滤膜上的菌落，从而得出原始菌悬液所含菌数。(七)微菌落快速计数法(八)最可能数(most probable number，MPN)的估计 这是在统计学概率特定的适当范围内测定群体中微生物细胞数的估计量。最大几率数是通过观察、计算每个稀释度肉汤培养液中出现细菌生长的试管数或出现产生已知代谢产物如乳糖发酵产生气体的试管数。根据生长(或形成产物)的试管指数查相关表所获得近似数值和所在的稀释度表示微生物的最大可能数量。 L-型细菌(L forms bacterium)是一种细菌通过变异而产生的细胞壁缺陷型。失去细胞壁的细菌必须在高渗溶液中方能存活，并失去原有形态而变成圆球形或多形性。目前越来越多的资料证明L-型亦有致病作用。 一般L-型细菌常规检查法培养基使用Kagan固体L型细菌培养基。如培养结果为阴性，可取培养阴性的增菌液。在厌氧状态下继续接种于L型平板培养。2观察结果 L-型细菌在固体培养基上形成的菌落在低倍显微镜下观察可见到有3种类型。(1)油煎蛋样菌落（即典型L型细菌菌落）：菌落较小、中心致密、陷入琼脂、周边较薄，由透明粗颗粒组成，低倍显微镜观察整个菌落呈“油煎蛋”状。(2)颗粒型菌落：整个菌落由透明的粗颗粒组成，无致密核心，此型易回复成正常细菌型。(3)丝状型菌落：菌落中心致密与油煎蛋样菌落相似，但周边由长丝组成，菌落不易从培养基上刮下，制片时也不易分散乳化。L-型细菌的鉴定法一般L-型细菌的回复，可将L-平板上的L型菌落转种于等渗肉汤中，只要L-型菌落中有少量细菌型存在，即可回复生长为细菌型，有时平板置室温多日，也可自行回复。见有细菌型菌落后，可按照一般鉴定法进行鉴定。但较稳定的L型细菌不易回复，则可通过免疫学和分子生物学方法进行鉴定。第三章细菌DNA的提取（一）细菌的培养（二）细菌的破壁（三）DNA提取 (四) DNA浓度测定及保存酸杂交技术（technique of nucleic acid hybridization）是现代分子生物学的重要方法之一，是用特定标记的已知核酸序列与待测核酸进行特异性的杂交结合，形成杂交体，并利用相应的显示技术来检测目标核酸的存在及其位置的分子生物学方法。该技术不但在现代生命科学的基础研究中应用广泛，解决了许多重大的分子生物学问题，而且在现代临床及食品卫生检验等应用领域中也越来越发挥着重要的作用。变性：DNA变性是指双螺旋的DNA分子双链解开形成单链的过程。由于双螺旋的稳定是靠碱基堆砌力及氢键来维持，所以DNA变性是不伴有共价键的断裂 引起DNA变性的因素有：加热、化学因素（有机溶剂、酸、碱、尿素）和机械力 复性：DNA变性后，当温度缓慢下降时，解开的双链可以重新締合形成双螺旋的过程，称之为DNA的复性 把同源关系较近的，不同生物个体来源的变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。或是指同一生物个体非同一分子来源但具有互补序列（或某一区段互补）的两条多核苷酸链，通过碱基配对形成稳定的双链分子的过程。核酸探针（Probe): 一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列，是可以对待检测核酸进行定性、定量和定位的工具。探针的分类：据制备方法及核酸性质不同，可分为：1、基因组DNA探针2、cDNA探针3、RNA探针4、寡核苷酸探针探针的标记方法（1）缺口平移法（2）随机引物标记法（3）末端标记法（4）PCR标记法（5）cDNA探针的制备（6）生物素光照标记法核酸杂交类型1.按靶序列与探针序列的杂交反应介质分为固相杂交和液相杂交 2按探针和靶序列反应分为直接杂交和夹心杂交 3按探针-靶分子杂交类型分为DNADNA杂交、DNARNA杂交、RNA-RNA杂交和PDA-DNA杂交。PDA为肽核酸(peptide nucleic acid)核酸杂交方法1.Southern印迹杂交（Southern Blot）用DNA探针与待检的DNA分子杂交，用于DNA的鉴定 2.Nothern印迹杂交法（Nothern blot） Nothern印迹则是用DNA探针与待检的RNA分子杂交，用于检测RNA样品 3.点杂交法（Dot hybridization）将提取的DNA或临床标本直接点加到支持膜上，用热变性法或化学法固定膜上的DNA，在合适的条件下加入标记的探针分子进行杂交。点杂交的优点是简便，同时可检测大量的标本，因而可用于临床标本的快速检测。 4.原位杂交法（in situ hybridization）是用标记的探针分子直接与组织切片中或细胞涂片中的待检分子进行杂交，不必提取相品中的核酸，因而可对待检分子进行定位分析。这在组织化学和细胞化学中具有重要的意义，可用来确定染色体中特定基因的位置及感染的病原微生物的核酸整合位置等，这为感染性疾病及遗传性疾病的病因学及病理学研究提供了有效的手段。6.三明治杂交法（Sandwich hybridization） 三明治杂交法亦称夹心杂交法，是用两个DNA序列不互补的核苷酸片段对标本进行检测，这两个片段的DNA序列与被检测的DNA序列互补。一个未标记的片段先吸支持膜上，用于捕捉标本中的靶序列，另一个片段作为标记探针用于检测靶序列。夹心杂交法的特点是特异性好，主要用于生长困难或鉴定困难的微生物检测，尤其是对污染了其他微生物的标本检测效果更好。基因芯片(gene chip)也叫DNA芯片、DNA微阵列(DNA microarray)、寡核