H22肝癌细胞与正常小鼠肝细胞胰岛素受体表达的对比.pdf

第14卷 第2期 2001年5月 同 位 素 Journal of Isotopes Vol 14 No 2 M ay 2001 H22肝癌细胞与正常小鼠肝细胞 胰岛素受体表达的对比 欧晓红 匡安仁 梁正路 王朝俊 四川大学华西医院 四川 成都 610041 摘要 本实验采用氯胺T法进行了胰岛素的125I标记 通过体外受体饱和结合实验及竞争结合实验 观察了H22肝癌细胞与正常小鼠肝细胞胰岛素受体的结合特性 并进行Scatchard分析 计算出两 种细胞的最大结合容量 Bmax 与平衡解离常数 Kd H22肝癌细胞胰岛素受体Bmax为每个细胞5 61 1 10 amol Kd为1 81 0 56 nmol L 正常小鼠肝细胞胰岛素受体Bmax为每个细胞3 22 0 81 amol Kd为2 10 0 91 nmol L H22肝癌细胞胰岛素受体Bmax显著高于正常肝细胞 P 0 05 关键词 胰岛素 受体结合分析 H22肝癌细胞 中图分类号 R81711 Q 69114 文献标识码 A 文章编号 100027512 2001 0220076205 受体与配体的结合具有特异性 选择性 高亲和力和明显生物效应等特点 以配体作为放 射性核素或抗肿瘤药物的载体 通过相应受体介导 将放射性核素或药物靶向导入病变细胞 内 增加病灶局部的药物浓度 达到提高疗效 减少毒副作用的目的 是近年来研究的热点之 一 研究表明 多种肿瘤细胞膜上的胰岛素受体密度及其与胰岛素的亲和力增加 如肝癌 乳腺 癌 白血病等 1 3 关于 H22肝癌细胞和正常小鼠肝细胞胰岛素受体的对比研究尚未见报道 多种生化研究及电镜观察表明 胰岛素与其受体结合后 细胞膜表面受体聚集成簇 进而 胰岛素2受体复合物内陷入细胞 在内吞小体中的低pH条件下 胰岛素与受体分离 部分胰岛 素可通过某种途径进入细胞核 与核基质或异染色质结合 从而调节细胞基因的表达 因此 利 用胰岛素作为靶向治疗药物的载体 可通过受体介导作用将药物导入细胞及细胞核内 4 5 本 研究拟通过体外受体结合实验对H22肝癌细胞与正常小鼠肝细胞的胰岛素受体密度和亲和 力进行分析比较 以探索胰岛素作为肿瘤受体介导靶向治疗药物载体的可行性 1 实验材料 111 主要试剂 猪胰岛素 AR 徐州生化制药厂产品 N a125 I 无还原剂 无载体 放化纯度 99 中国核 动力设计院第一研究所提供 丙烯酰胺 AR M erk公司产品 氯胺T 偏重亚硫酸钠 AR 上海 收稿日期 2000211214 修回日期 2001202223 基金项目 国家自然科学基金资助项目 39770229 作者简介 欧晓红 1974 女 汉族 四川省广安市人 硕士 临床核医学专业 1994 2006 China Academic Journal Electronic Publishing House All rights reserved 试剂四厂产品 牛2 球蛋白 Sigma公司产品 PET 聚乙二醇 相对分子量6 000 日本进口 天津天泰精细化学品公司分装 牛血清白蛋白 Boehr公司产品 112 主要仪器 AA2250型1 10000电子天平 美国Denver仪器公司产品 DYY2 型长柱高压电泳槽及 切片器 北京六一仪器厂产品 TS21型脱色摇床 江苏海宁其林医用仪器厂产品 FH403A2自 动定标器 探测效率70 北京核仪器厂产品 低温高速离心机 Beckman公司产品 2 实验方法 211 A14 125I 胰岛素的制备及纯化 6 采用氯胺T法对胰岛素进行125I标记 采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化标记物 用含1 牛血清白蛋白的碳酸氢胺溶液浸泡洗脱标记物 采用硅胶G薄层层析法测定标记物的放化纯度 采用自身置换法测定比活度 采用过量 受体结合实验法鉴定受体结合活性 定期测量放射化学纯度观察标记物稳定性 212 细胞悬液的制备 7 鼠源性H22肝癌细胞悬液的制备 取H22肝癌细胞 2 5 106接种于昆明种小鼠腹腔 10天后腹水形成 无菌条件下从腹腔抽取含瘤细胞腹水 室温下1 000 r m in离心5m in 吸弃 上清液 细胞用生理盐水洗涤后离心 重复两次 最后沉淀肿瘤细胞 用适量分析缓冲液 pH 7 5 50 mmol L的T ris HCl溶液 下同 悬液 取微量细胞悬液用0 1 台盼蓝进行染色 活 细胞计数后 用分析缓冲液稀释悬浮使细胞浓度为2 107 mL 正常小鼠肝细胞悬液的制备 正常昆明种小鼠 断头处死后立即剖腹取肝脏 冰水洗去表 面血细胞 将肝脏研磨后去除纤维结缔组织 用生理盐水洗涤离心两次 其余操作同肿瘤细胞 213 胰岛素受体体外结合分析 2 3 1 时间与温度对受体2配体结合的影响 取3组塑料试管 每组包括总结合管 TB 及相 应的非特异结合管 N SB 总结合管中加入H22细胞106 50 L A 142 125 I2胰岛素50 L 0 7 kBq 非特异结合管中加入H22细胞106 50 L A 142 125 I2胰岛素50 L 0 7 kBq 未 标记胰岛素5 2 nmol 20 L 用分析缓冲液调各组总结合管及非特异管终反应体积至250 L 分别于4 15 37 条件下温育振荡不同时间 反应终止时 每管加入2 5 mL 4 预冷的 分析缓冲液稀释混匀 4 3 500 r m in离心10 m in 吸弃上清液 测定沉淀的放射性计数率 m in 1 特异性结合 SB 总结合管 TB 非特异管结合 N SB 特异性结合率 特异性结 合 A 142 125 I2胰岛素加入量 以时间为横坐标 特异性结合率为纵坐标得到受体2配体的时间结 合曲线 2 3 2 饱和结合实验 取两组试管分别用H22细胞和正常小鼠肝细胞做饱和结合实验 每 组包括总结合管及相应的非特异结合管 TB管内依次加入细胞1 106 A 142 125 I2胰岛素0 1 10 kBq N SB管在加入细胞1 106 A 142 125 I2胰岛素0 1 10 kBq后 另加入未标记胰岛素 5 2 nmol 每组总结合管及非特异管均用分析缓冲液调终反应体积至250 L 4 振荡温育8 h 分离时每管加入4 预冷的分析缓冲液2 5mL稀释混匀 4 3 500 r m in离心10m in 吸弃上清液 测定沉淀的放射性计数率 m in 1 每点做双管 以125I2胰岛素加入量为横坐标 SB为纵坐标作出 125 I2胰岛素与肿瘤细胞及正常肝细胞的饱和结合曲线 通过Scacthard分析 计算出H22细胞及正常小鼠肝细胞胰岛素受体与125I2胰岛素的最大结合容量 Bmax 及解离常 数 Kd 按以上相同条件重复6次实验 计算结果以x s 表示 并用t检验进行统计处理 比 较两种细胞胰岛素受体的Bmax及Kd有无显著性差异 2 3 3 竞争结合实验 取两组试管分别用H22细胞和正常小鼠肝细胞做竞争结合实验 每 77 第2期 欧晓红等 H22肝癌细胞与正常小鼠肝细胞胰岛素受体表达的对比 1994 2006 China Academic Journal Electronic Publishing House All rights reserved 组包括总结合管及相应的非特异结合管 在每一试管中依次加入细胞106 A 142 125 I2胰岛素50 L 0 7 kBq 非标记胰岛素0 10 6 mol N SB管另加入未标记胰岛素5 2 nmol 每管用分 析缓冲液调终反应体积至250 L 其余操作同上 每点做双管 以非标记胰岛素浓度的对数为 横坐标 特异性结合率为纵坐标 作出两种细胞的胰岛素与A 142 125 I2胰岛素竞争结合曲线 3 实验结果 311 A14 125I 胰岛素的质量鉴定 聚丙烯酰胺凝胶电泳将标记混合物分为四条带 Rf分别为 0 72 0 76 0 79 0 82 根据 文献 9 四条带依次为未标记胰岛素 A 192胰岛素 A 142胰岛素 双碘胰岛素 纯化后A 142单 碘胰岛素的放化纯度为98 5 1 2 比活度为6 91 0 21 TBq g 标记物放化纯度在室 温放置60 d以后仍然 95 受体结合率为30 312 细胞悬液中的活细胞计数 H22细胞及正常小鼠肝细胞经0 1 台盼蓝染色 证实活细胞数 98 313 胰岛素受体体外结合分析结果 3 3 1 时间与温度对配体2受体结合的影响 结果示于图1 2 由图1 2可知 温度对A 142 125 I2胰岛素与H22细胞的结合具有显著的影响 37 下反应 30m in时特异性结合率为0 10 以后逐步下降 15 时 反应均60m in达到平衡 特异性结合率为0 24 4 时 反应8 h可达 到平衡 特异性结合率约为0 30 因此 选用4 反应8 h作为研究条件 图1 37 15 时时间对125I 胰岛素 与H22肝癌细胞结合率的影响 1 15 2 37 图2 4 时时间对125I 胰岛素 与H22肝癌细胞结合率的影响 3 3 2 饱和结合实验 结果示于图3 由图3可知 细胞数量一定时 A 142 125 I2胰岛素与肿瘤 细胞及正常肝细胞的特异性结合在一定范围内均随着标记配体量的增加而上升 且上升趋势 逐渐变缓 表明A 142 125 I2胰岛素与H22细胞及正常小鼠肝细胞的结合具有可饱和性 以B F 为纵坐标 B为横坐标进行Scatchard作图 结果示于图4 由Scatchard分析得到H22细胞及 正常小鼠肝细胞胰岛素结合位点的Kd及Bmax 结果列于表1 由表1可知 H22细胞表面胰岛 素受体的Kd为1 81 0 56 nmol L Bmax为每个细胞5 61 1 10 amol 正常小鼠肝细胞胰岛 素结合位点的Kd为2 10 0 91 nmol L Bmax为每个细胞3 22 0 81 amol 经t检验表明两 87同 位 素 第14卷 1994 2006 China Academic Journal Electronic Publishing House All rights reserved 种细胞胰岛素受体与A 142 125 I2胰岛素亲和力无显著性差异 Bmax有显著差异 t 4 285 5 P 0 05 n 6 表1 H22肝癌细胞与正常小鼠肝细胞Kd及Bmax比较 x s n 6 细 胞Kd nmol L 1Bmax amol H22肝癌细胞 1 81 0 565 61 1 10 正常小鼠肝细胞2 10 0 913 22 0 81 1 注 1 两种细胞的Bmax比较 P 110mesh 500mg an2 hydrousN a2HPO4in No 0 capsule is 270 L 0 05mol L N aOH solution In order to prevent the volatility of radioiodide 1 V c should be included in adsorbent The disintegrated ti me of capsule is 5m in The radiochem icalpurity and nuclear purity of N a 131 I therapeutic capsule are over 95 and 99 respectively w ithin 30 days after preparation A t the same ti me the radioactivity of 20 capsules is in the range of 96 5 103 5 The ani mal experi ments show that there is not extraordinary toxicity w ith N a 131 I therapeutic capsule and no differ2 ence betw een N a 131 I therapeutic capsule and N a 131 I solution in rabbits thyroid uptake w ithin 24 h Key words N a 131 I therapeutic capsule adsorption ani mal experi ment From page 80 12 TaouisM DerouetM Caffin JP et al Increased Insulin ReceptorN umber and Insulin Responsiveness in a Chicken Hepatoma CellL ine J J Endocrinol 1994 140 1 119 1241 13 匡安仁 周绿漪 梁正路 等 1 放射性碘标胰岛素在荷肝癌H22小鼠体内的趋瘤特性研究 J 中华核 医学杂志 1999 19 3 179 1801 Comparation of the Expression of Insulin Receptor to H22 Hepatoma CellsW ith Normal L iver Cells of M ice OU Xiao2hong KUAN G A n2ren L I AN G Zheng2lu WAN G Chao2jun D epartm ent of N uclearM ed icine W est China U niversity H osp ital S ichuan U niversity Chengdu610041 China Abstract Insulin is labeled w ith 125 I by Ch2T method Receptor binding assay of 125 I2insulin to H22 hepa