RP-HPLC测定金针菇中芦丁、槲皮素和丁香酸的含量.pdf

2009 Vol 30 No 18食品科学 分析检测230 RP HPLC 法测定金针菇中芦丁 槲皮素和 丁香酸的含量 陈智毅 廖森泰 刘学铭 吴娱明 邹宇晓 施 英 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 广东省农产品加工公共实验室 广东 广州 510610 摘 要 采用高效液相色谱法测定金针菇中的多酚类成分 使用Agilent ZORBAX SB C18分析柱 4 6mm 250mm 5 m 流动相为乙腈 A 0 4 乙酸 B 其中 0 40min 为5 A 95 B 40 45min 为25 A 75 B 45 50min 为 35 A 65 B 之后运行 5min 流速 1 0ml min VWD 检测器 检测波长 280nm 柱温 30 本研究在鲜 金针菇中检出芦丁和槲皮素 在干金针菇中检出槲皮素和丁香酸 关键词 金针菇 芦丁 槲皮素 丁香酸 反相高效液相色谱法 RP HPLC Determination of Rutin Quercetin and Syringic Acid in Flammulina velutipe Fruitbody CHEN Zhi yi LIAO Sen tai LIU Xue ming WU Yu ming ZOU Yu xiao SHI Ying Guangdong Open Access Laboratory of Agricultural Product Processing Institute of Sericulture and Farm Produce Processing Research Guangdong Academy of Agricultural Sciences Guangzhou 510610 China Abstract A HPLC method was established to determine polyphenolic compounds in Flammulina velutipe fruitbody The chromatographic separation was achieved on an Agilent Zorbax SB C18 4 6 mm 250 mm 5 m analytical column using a mobile phase consisting of a mixture of A acetonitrile and B 0 4 acetic acid 0 40 min 5 A and 95 B 40 45 min 25 A and 75 B 45 50 min 35 A and 65 B at a flow rate of 1 0 ml min and 30 column temperature and the analytes were detected using a VWD detector at 280 nm wavelength Rutin and quercetin both were found in fresh Flammulina velutipe fruitbody while quercetin together with syringic acid was detected in dried samples Key words Flammulina velutipe rutin quercetin syringic acid RP HPLC 中图分类号 TS207 3 文献标识码 A 文章编号 1002 6630 2009 18 0230 03 收稿日期 2008 10 31 基金项目 广东省科技攻关项目 2008A020100024 作者简介 陈智毅 1963 男 副研究员 硕士 研究方向为农产品加工 E mail fezychen 金针菇 Flammulina velutipe 以其菌盖滑嫩 柄 脆 营养丰富 味美适口而著称于世 是工业化生产 的食用菌 但有关金针菇成分的研究迄今只是在蛋白 质 氨基酸 矿物质 维生素和多糖等 1 6 未见金 针菇多酚类成分的研究报道 本实验拟在金针菇中分析 测定芦丁 槲皮素和丁香酸 1材料与方法 1 1材料 试剂与仪器 白金针菇子实体样品均由东莞市星河生物科技有限 公司提供 5 个样品 1 5 源自 5 个金针菇菌种 这些 菌种是以广东省微生物研究所菌种保藏中心的金针菇菌 种 编号 GIM5 181 为出发菌株 经提纯复壮后具有菌 丝健壮 生长快等特性的生产菌种 丁香酸 Sigma 公司 芦丁 槲皮素 中国药品生 物制品检定所 甲醇 色谱纯 Fisher 公司 甲醇 分析 纯 纯净水 屈臣氏公司 LC1200 VWD 检测器 ZORBAX SB C18分析柱 4 6mm 250mm 5 m Agilent公司 EYELA N 1001 旋转蒸发仪 东京理化公司 1 2方法 1 2 1对照品溶液的制备 精密称取减压干燥至恒质量的丁香酸 芦丁 槲 皮素对照品各 10mg 用甲醇溶解后定容于 10ml 容量瓶 中 用 0 45 m 微孔滤膜过滤 即得 1 2 2供试样品的制备 231 分析检测食品科学2009 Vol 30 No 18 新鲜金针菇或干金针菇干燥粉碎后过 20 目筛 称 取 10g 加入约 50ml 甲醇 新鲜金针菇匀浆 超声处理 60min 滤渣再用甲醇洗涤 2 次 合并滤液 旋转蒸发 仪浓缩 加入甲醇定容 50ml 容量瓶中 摇匀 0 45 m 滤膜过滤 即得 1 2 3色谱条件 色谱柱 ZORBAX SB C18分析柱 流动相梯度洗 脱 其中 0 40min 为 5 A 95 B 40 45min 为 25 A 75 B 45 50min 为 35 A 65 B 之后运行 5min 流速 1 0ml min VWD 检测器 检测波长 280nm 柱 温 30 2结果与分析 2 1检出限测定 多酚组分线性回归方程相关系数线性范围 ng 没食子酸Y 2469 3127X 7 89604080 99986 2 02 20200 丁香酸Y 2775 55989X 11 1767960 99997 2 76 21600 芦丁Y 802 110021X 7 91283350 99995 9 19 20600 槲皮素Y 1183 35814X 1 14853850 99998 5 75 20200 表1 4种多酚类化合物的线性回归方程及线性范围 Table 1 Linear regression equations and linear ranges of the HPLC method for determining 4 polyphenolic compounds 用单标分别进样后确定大致保留时间以及响应值 稀释配成不同浓度的混合标准系列 进样10 l进行HPLC 测定 图 1 以标准溶液浓度为横轴 相应的峰面积为 纵轴 绘制标准曲线 以信噪比 3 的值为检出限 上限为本实验的最大用量 线性回归方程和线性范围见 表 1 多酚化合物混合标样的线性相关系数在 0 99986 0 99995 之间 线性关系良好 2 2精密度实验 精确抽取对照品溶液 5 l 重复进样 3 次 得没食 子酸 丁香酸 芦丁 槲皮素的峰面积 RSD 分别为 0 12 0 05 0 04 0 23 2 3回收率实验 按样品处理方法平行处理 在提取液中分别加入标 准样品做空白回收实验 没食子酸 丁香酸 芦丁 槲皮素平均回收率分别为 98 56 99 32 99 87 和 97 23 RSD 分别为 0 74 0 15 0 08 0 97 n 3 2 4供试样品测定 按 1 2 节的方法测定供试样品溶液的多酚含量 6 种 金针菇中多酚的含量见表 2 图 2 3 是鲜金针菇 1 和 干金针菇多酚类成分的 HPLC 色谱图 注 低于检出限而未检出 多酚组分 金针菇 1 金针菇 2 金针菇 3 金针菇 4 金针菇 5 干金针菇 丁香酸 0 320 芦丁1 5325 2004 7894 4813 560 槲皮素0 3300 0990 01510 0840 0921 188 表2 金针菇多酚类成分的含量 mg 100g Table 2 Contents of syringic acid rutin and quercetin in fresh and dried Flammulina velutipe fruitbodies mg 100g 1 没食子酸 2 丁香酸 3 芦丁 4 槲皮素 图1 酚类化合物标准品的HPLC色谱图 Fig 1 HPLC chromatogram of mixed standard polyphenolic compounds 16 14 12 10 8 6 4 2 0 1 mAU 时间 min 51015202530354045 2 3 4 1 没食子酸 2 丁香酸 3 芦丁 4 槲皮素 图 2 金针菇1 多酚类化合物的HPLC色谱图 Fig 2 HPLC chromatogram of polyphenolic compounds in fresh Flammulina velutipe fruitbody No 1 7 6 5 4 3 2 1 0 1 mAU 时间 min 51015202530354045 2 3 4 5 250 19 690 29 073 49 614 1 没食子酸 2 丁香酸 3 表儿茶素 4 芦丁 5 白藜芦醇 6 槲皮素 图3 干金针菇多酚类化合物的HPLC色谱图 Fig 3 HPLC chromatogram of polyphenolic compounds in dries Flammulina velutipe fruitbody 5 4 3 2 1 0 1 mAU 时间 min 51015202530354045 2 3 4 5 6 5 070 20 253 20 930 29 812 45 252 47 070 本实验检出新鲜金针菇中含有芦丁和槲皮素 芦丁 含量以金针菇 2 含量最多 金针菇 1 含量最少 且相 差 3 39 倍 槲皮素在鲜金针菇中以金针菇 1 最多 金 针菇 3 最少 且相差 21 85 倍 而没食子酸 丁香酸 没达到检出限 此外 在保留时间 10min 左右有一个基 2009 Vol 30 No 18食品科学 分析检测232 线分离较好的成分未能鉴定 在干金针菇中检出两种多酚成分 丁香酸和槲皮 素 但没食子酸 表儿茶素 白藜芦醇未达到检出限 3讨 论 本实验采用 10 种多酚化合物标准品 没食子酸 绿 原酸 儿茶素 丁香酸 表儿茶素 阿魏酸 芦丁 安息香酸 白藜芦醇 槲皮素 研究了新鲜金针菇和 干金针菇的多酚类化学成分的组成和含量 其中在检出 限内 鲜金针菇中检出两种多酚类成分 芦丁和槲皮 素 而在干金针菇中检出两种多酚类化学成分 槲皮 素和丁香酸 新鲜金针菇与干金针菇在芦丁 槲皮素 上的差异 可能是因为在金针菇干制过程中 芦丁降 解酶在有水存在的条件下致使芦丁中的糖苷键断裂 使 芦丁转化为槲皮素 从而导致芦丁含量下降 槲皮素 含量升高 据报道芦丁具有降低毛细血管通透性 抗炎 抗 病毒 镇痛 抗氧化及抑制醛糖还原酶等多方面药理 活性 7 槲皮素具有抗炎 抗氧化 清除氧自由基 抗黏附 抗血栓 抗病毒 抗肿瘤 降血糖 降血 脂 降低血压以及免疫调节作用 8 9 丁香酸具有抗内 毒素作用 而抗内毒素作用是中药清热解毒作用的药理 基础 10 由于在金针菇中发现芦丁 槲皮素 丁香酸 等具有极高药用价值的成分 因而有必要对金针菇的药 食作用进行重新评估 本实验采用的 5 个样本是出自于同一个金针菇出发 菌种的分离复壮菌株 芦丁和槲皮素的含量在菌株间表 现较大的差异 说明金针菇在功效成分的菌种选育方面 大有可为 参考文献 1 陈智毅 廖森泰 刘学铭 等 白金针菇子实体的单双糖组成及其含 量分析 J 食用菌学报 2008 15 2 57 60 2 于荣利 秦旭升 宋凤菊 金针菇研究概况 J 食用菌学报 2004 11 4 63 68 3 袁仲 金针菇的保健功能与加工利用 J 农产品加工 学刊 2005 6 7 125 128 4 孙宇峰 沙长青 于德水 等 金针菇功能性蛋白的研究进展 J 微 生物学杂志 2006 26 4 50 54 5 秦小明 余娟 宁恩创 等 金针菇子实体多糖成分的初步研究 J 食用菌学报 2005 12 2 27 31 6 铁梅 李闯 费金岩 等 体积排阻色谱与电感耦合等离子体质谱联 用技术在富硒金针菇硒多糖形态分析中的应用研究 J 分析科学学 报 2007 23 5 497 501 7 韩英华 秦元璋 芦丁研究现状 J 山东中医杂志 2003 22 22 635 637 8 REITERER G TOBOREK M HENNIG B Quercetin protects against linole