免疫球蛋白件PPT课件.ppt

1 免疫球蛋白 2 抗体 antibody Ab B细胞在Ag刺激下 产生能与相应Ag发生特异性结合的免疫球蛋白 免疫球蛋白 Immunoglobulin Ig 具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白 Ab和Ig具有不同之处Ab是Ig 但Ig不一定是Ab免疫球蛋白可分为分泌型 secretedIg SIg 和膜型 membraneIg mIg Ab介导的免疫称为体液免疫 抗体和免疫球蛋白 3 EmilvonBehring 1845 1917 1901 antitoxinsantibody 是介导体液免疫的重要效应分子 是B细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的球蛋白 4 5 一 免疫球蛋白的基本结构 四条肽链结构Ig的基本结构是四条肽链的对称结构2H 2L Ig单体 6 一 免疫球蛋白的基本结构 重链 免疫球蛋白重链分子量约为50 75kDa 由450 550个氨基酸残基组成 并结合有不同糖基 因此免疫球蛋白属糖蛋白 H链 IgMIgGIgAIgDIgE 7 不同类的免疫球蛋白 其链内和链间二硫键的数目和位置 连接寡糖的数量 结构域的数目及铰链区的长度等均不完全相同 8 一 免疫球蛋白的基本结构 轻链 免疫球蛋白轻链分子量约为25kDa 由214个氨基酸残基组成 根据轻链结构和抗原性的不同分为 kappa 链和 lambda 链 免疫球蛋白因此分为两型 type 即 型和 型 各类免疫球蛋白轻链均有 型和 型 两型轻链的功能无差异 正常人血清免疫球蛋白的 型 型约为2 1 在小鼠则为20 1 9 一 免疫球蛋白的基本结构 可变区和恒定区可变区 VariableRegion V区 位于Ig分子N端 占轻链1 2和重链1 4或1 5 不同抗体其IgV区氨基酸组成和排列有较大差异 并决定抗体与抗原结合的特异性 10 11 一 免疫球蛋白的基本结构 可变区和恒定区高变区 hypervariableregion HVR 或称互补性决定区 complementarity determiningregion CDR VH和VL可变区内各有3个区域的氨基酸组成和排列顺序变化特别大 共同组成一个与抗原决定基互补的表面 即抗原结合部位 用HVR1 3或CDR1 3表示 独特型决定簇 与特异性抗原结合的部位 骨架区 Frameworkregion FR 12 13 一 免疫球蛋白的基本结构 可变区和恒定区恒定区 ConstantRegion C区 位于Ig分子的C端 占轻链1 2和重链3 4 IgA IgD 或4 5 IgM IgE 在同一种属中 同一类重链和同一类轻链C区氨基酸的组成或排列比较恒定 介导Ig多种生物学功能 重链和轻链的C区分别称为CH和CL 不同型免疫球蛋白的CL长度基本一致 但不同类免疫球蛋白的CH长度不尽相同 可从CH1 CH3或CH1 CH4 14 15 16 一 免疫球蛋白的基本结构 铰链区CH1和CH2之间 由30个氨基酸组成的富含脯氨酸的结构称为铰链区 功能 1 利于IgCDR与Ag决定簇吻合 2 与Ag结合后 T 转变为 Y 型 补体结合点暴露 17 二 免疫球蛋白的功能区 结构域 Ig的多肽链分子中约110个氨基酸可折叠成由链内二硫键连接的具有特定功能的球形结构 称为免疫球蛋白的功能区或结构域 domain 18 VL和VH 抗原结合部位 CL和CH1 同种异型的遗传标记所在处 CH2和CH3 IgG的CH2和IgM的CH3 补体C1q结合点 母体的IgG借助CH2通过胎盘进入胎儿体内 CH3 CH4 与细胞Fc受体结合的部位IgG的CH3可结合细胞表面的FcR IgE的CH2和CH3可与肥大细胞和嗜碱性粒细胞的IgEFc受体结合 19 20 三 免疫球蛋白的其他成分 J链 由浆细胞合成 富含Cys的多肽链 连接Ig单体形成多聚体 如IgA二聚体和IgM五聚体的形成 分泌片 SP 由粘膜上皮细胞产生的含糖肽链 为分泌型IgA的辅助成分 可以非共价形式结合到IgA二聚体上 并一起分泌到粘膜表面 作用机理 保护铰链区的酶解 介导二聚体的跨膜转运 21 22 SIgA参与黏膜局部免疫 23 24 四 免疫球蛋白的酶解片段 木瓜蛋白酶2Fab结合Ag1Fc可结晶 保留Ag性及相应功能区的功能胃蛋白酶1F Ab 2结合Ag 双价pFc 无活性碎片意义 免疫球蛋白酶解片段的研究不仅对阐明免疫球蛋白的结构和生物活性十分重要 而且对生物制品的应用也有重要意义 如白喉抗毒素 破伤风抗毒素经胃蛋白酶酶解后精制提纯的制品 因去掉Fc段而减少超敏反应的发生 25 26 四 免疫球蛋白的抗原性或异质性 免疫球蛋白异质性表现为 不同抗原表位刺激所产生的抗体分子 其结合抗原的特异性不同 同一抗原表位刺激所产生的抗体分子 其结合抗原的特异性相同 但恒定区不同 抗体可变区的异质性抗体恒定区的异质性 类 亚类 型 亚型外源因素引起的异质性 Ig的多样性内源因素引起的异质性 Ig的血清型同种型 同种异型 独特型 27 免疫球蛋白的抗原性 同种型 isotype 是同一种属所有个体的免疫球蛋白分子所共有的抗原特异性 同种异型 allotype 是同一种属的不同个体间的免疫球蛋白分子所具有的不同的抗原特异性 独特型 同一个体内的免疫球蛋白分子可变区的抗原特异性各不相同 其超变区各自具备独特的抗原表位结构 称为抗体的独特型 idiotype Id 28 29 四 免疫球蛋白的抗原性 抗独特型抗体 独特型可刺激异种 同种异体以及自体产生的抗体为抗独特型抗体 Anti idiotypeantibody AId 意义 独特型 抗独特型网络机体免疫调节的主要方式之一 30 五 各类Ig的特点 31 单体结构 含量高 占血清Ig总量的75 80 其中IgG1含量最多 半衰期约最长 20 23天 再次免疫应答产生的主要抗体 其亲和力高 分布广 中和毒素 调理吞噬 激活补体 是抗感染的主要抗体 唯一能通过胎盘的Ig IgG1 3 新生儿抗感染免疫 能与葡萄球菌胞壁上的A蛋白 SPA 结合 纯化抗体 免疫诊断 IgG 32 33 IgM五聚体 单体 膜结合型 构成BCR五聚体 分泌型 巨球蛋白 IgM分子量大 不易透出血管 对防止菌血症 败血症的发生具有强大的作用 有较多结合价 是高效能的抗体 其杀菌 溶菌 溶血 促吞噬以及凝集作用比IgG高500倍 1000倍 产生最早 个体发育中最早合成 初次体液免疫应答中最早产生 半衰期较短 5天左右 故IgM既是宫内感染的指标 又是传染病早期诊断的指标 34 IgA 1 血清型IgA占血清Ig总量的10 15 2 分泌型IgA SIgA 结构 J链连接的双体和分泌片 分布 胃肠道和支气管分泌液 乳汁 初乳中含量最高 唾液 泪液中 功能 对机体的局部粘膜 如呼吸道 消化道粘膜 的抗感染免疫有重要作用 新生儿通过母乳喂养 可获得被动免疫 35 36 IgD 单体结构 血清含量低 占Ig总量的0 2 半衰期极短 仅3天 铰链区长 B细胞表面的IgD SmIgD 是成熟B细胞的重要表面标志 未成熟B细胞仅表达mIgM 成熟B细胞 初始型 表达mIgM和mIgD 活化或记忆性B细胞mIgD逐渐消失 37 单体结构 含量最低 约占Ig总量的0 002 黏膜下淋巴组织中的浆细胞产生 与I型超敏反应密切相关Fc RI为高亲和力受体 主要分布在肥大细胞和嗜碱性粒细胞膜上 IgE 38 六 免疫球蛋白的生物学功能 特异性结合抗原激活补体结合细胞通过胎盘和黏膜具有抗原性 39 六 免疫球蛋白的生物学功能 40 V区功能 Ig通过V区识别并特异性结合抗原 发挥免疫效应 结合抗原的效价IgG IgE IgD 双价IgA 4价IgM 理论上10价 实际上5价 介导免疫效应 中和毒素 阻止病原体感染 作为抗原受体识别抗原等 41 C区的功能 1 激活补体 IgG1 3 IgM 经典途径 IgA IgE IgG4聚合物 旁路途径2 结合细胞表面的Fc受体 FcR 调理作用 指抗体 补体促进吞噬细胞吞噬细菌等颗粒性抗原的作用 如IgG与巨噬细胞 中性粒细胞 42 发挥抗体依赖细胞介导的细胞毒作用 antibodydependentcell mdeiatedcytotoxicity ADCC 指具有杀伤活性的细胞如NK细胞通过其表面表达的Fc受体识别结合于靶抗原 如病毒感染细胞或肿瘤细胞 上的抗体Fc段 直接杀伤靶细胞 NK细胞是介导ADCC的主要细胞 抗体与抗原的结合是特异性的 而ADCC杀伤作用是非特异性的 介导I型超敏反应 IgE 43 44 3 穿过胎盘和粘膜 IgG是唯一能穿过人胎盘屏障的免疫球蛋白 对新生儿的免疫具有重要作用 IgG通过结合母体侧滋养层细胞表面的FcRn 主动转移到胎儿血循环 分泌型IgA与粘膜免疫 45 46 Ig基因由三组不连锁的基因群控制 即 轻链基因群 2号 轻链基因群 22号 和重链基因群 14号 基因重排 generearrangement 在B细胞发育过程中 一部分基因片段互相接近 重新排列 形成功能性的Ig基因单位的过程 七 免疫球蛋白基因 47 七 免疫球蛋白基因 表 人胚系基因中Ig基因定位与片段 注 括号中为除假基因及无效基因之外的功能基因片段数 48 49 50 基因重排V D J C基因群中各选择一个片段 组成单个Ig的编码基因 再转录翻译成功能性Ig Ig基因重排 胚系B细胞VH基因 D J V DJ 重排 轻链基因 V J 重排 先是k 重组失败 基因重排 VDJ或VJ基因与C基因连接 形成mRNA 翻译为重链和轻链 以二硫键组合成Ig 七 免疫球蛋白基因 51 TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1987 forhisdiscoveryofthegeneticprincipleforgenerationofantibodydiversity SusumuTonegawa 利川根进 52 七 免疫球蛋白基因 53 七 免疫球蛋白基因 基因重排 重组信号序列 recombinationsignalsequence RSS 是由寡核苷酸组成的七聚体 heptamer 5 CACAGTG3 九聚体 nonamer 5 ACAAAAACC3 以及两者之间较少保守性的间隔序列 spacer 所组成 间隔序列的碱基数为12或23 在重组酶的识别和作用下 带有12bp间隔序列的RSS基因片段只能和带有23bp间隔序列的基因片段结合 保证了基因片段的正确连接 该现象称为 12 23规则 54 七 免疫球蛋白基因 Ig的基因重排信号序列 55 七 免疫球蛋白基因 基因重排 重组酶 recombinase 是一组参与V D J基因片段重组的酶 重组激活基因 recombinationactivatinggene RAG 编码重组激活酶 有RAG 1和RAG 2两种 形成的复合物是一种内切酶 可特异性识别并切除V D J基因片段两侧RSS的保守序列 末端脱氧核苷酸转移酶 terminaldeoxynucleotidyltransferase TdT 表达于B细胞前体 可将数个核苷酸 N 核苷酸 通过一种非模板编码 non templateencoded 的方式加到DNA的断端 其他还有切开发夹结构的内切酶 参与修复DNA双链断端的DNA外切酶 DNA合成酶等 56 七 免疫球蛋白基因 基因重排 57 VDJ基因重组的结果 促进免疫球蛋白基因的转录 58 七 免疫球蛋白基因 类别转换 缺失模型 RNA的可变剪接 59 七 免疫球蛋白基因 60 七 免疫球蛋白基因 膜表面Ig SmIg 和分泌型Ig的基因重排SmIg和分泌性Ig的H链结构相类似 所不同的是SmIg的羧基端多含一段穿膜的疏水性氨基酸残基和胞浆区 因此SmIgH链的转录本 transcript 要比分泌性IgH链转录本多1 2个外显子 膜型和分泌型Ig重链基因的结构和重排相同 但在RNA水平上的剪接有所不同 61 七 免疫球蛋白基因 等位基因排斥现象 早期成熟B细胞只表达Ig两个等位基因中的一个 轻链同种型排斥 每个B细胞合成两型轻链中的一种 62 63 Ig多样性的机制 组合多样性 连接多样性 体细胞高频突变 B细胞 64 1 组合多样性 V D J 的组合及轻重链的组合肽链组合多样性连接多样性VHVH65xDH30 xJH6 11700VkVk50 xJk5 250VlVl30 xJl4 120L250 120 370H L2 5x1083x107总计1014 65 组合多样性 66 2 连接多样性 发生于胚系基因CDR3区位于V J或V D J片段连接处 两个片段之间的连接点不同或丢失或插入数个核苷酸及倒转 3 体细胞高频突变造成的多样性 成熟B细胞在受到抗原刺激后 在生发中心发生体细胞高频突变 多发生在Ig的CDR区 若干核苷酸替换突变 利于提高抗体与抗原的亲和力 67 七 免疫球蛋白基因 免疫球蛋白的多样性连接多样性 P 核苷酸插入N 核苷酸插入 68 Junctionaldiversity 69 Junctionaldiversity 70 71 八 人工制备抗体 多克隆抗体 polyclonalantibody 单克隆抗体 monoclonalantibody 基因工程抗体 geneengineeringAb 72 八 人工制备抗体 多克隆抗体 polyclonalantibody 用含多种抗原决定簇的抗原物质免疫动物 刺激多个B细胞克隆所获得的免疫血清 含多种抗体的混合物 此为多克隆抗体 来源广泛 制备容易 特异性不高 易产生交叉反应 73 带有多个表位 针对不同表位的B细胞 克隆增殖 多种抗体的混合物 多克隆抗体 刺激小鼠 74 八 人工制备抗体 单克隆抗体单个B细胞克隆增殖产生的只针对某一特定抗原决定基的抗体称为单克隆抗体 monoclonalantibody mAb 单克隆抗体通过杂交瘤技术制备所制备的高度均一 属同一类 亚类 型别 单一特异性 仅针对特定抗原表位 的抗体 可大量生产 鼠源单克隆抗体可诱导人体产生人抗鼠抗体 75 GeoregesKohlerandCesarMilstein 1984 monoclonalantibody 76 HAT 次黄嘌呤 H 氨基喋呤 A 和胸腺嘧啶核苷 T HGPRT 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶 77 八 人工制备抗体 基因工程抗体借助DNA重组技术和蛋白质工程技术 按人们的意愿在基因水平上对Ig进行切割 拼接或修饰 重新组装成为新型抗体分子 78 八 人工制备抗体 基因工程抗体嵌合抗体 chimericAb 小鼠V区基因 人C区基因载体表达人源化抗体 humanizedAb 即CDR移植抗体 CDR graftedAb 小鼠CDR基因 人V区框架 79 80 81 八 人工制备抗体 小分子抗体由Fab和Fv组成的抗体片段 包括Fab单域抗体 VH或VL Fv VH和CH1 单链抗体 VH Linker VL 82 分别构建载体 L链表达载体 H链表达载体 共转染细胞 PrVHPrVL Fv 二硫键稳定的Fv disulfide stabilizedFv ds Fv 小分子抗体的制备 ds Fv 83 VHVL 接头DNA Gly4Ser 3 VH引物 PCR VH接头DNA 酶切 克隆 ScFv singlechainFv scFv 的构建 变性