固相萃取-反相高效液相色谱法检测水产品中孔雀石绿和结晶紫及其代谢物.doc

固相萃取-反相高效液相色谱法检测水产品中孔雀石绿和结晶紫及其代谢物孔雀石绿（MG）和结晶紫（CV）具有高毒素、高残留和致癌、致畸、致突变等特点，当其进入生物体内，就会产生具有更强危害的隐性孔雀石绿（LMG）和隐性结晶紫（LCV）。鉴于孔雀石绿和结晶紫的危害性，包括我国在内的许多国家都将它们列为水产养殖中的禁用药物。 GB/T 19857-2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定和SN/T 1479-2004 进出口水产品中孔雀石绿残留量检验方法中均采用有机溶剂提取后经固相萃取柱净化，然后采用高效液相色谱法或液相色谱-串联质谱法测定。 迪马科技在参考上述两个标准的基础上开发出中性氧化铝和阳离子交换固相萃取柱串联净化后，反相高效液相色谱柱检测。该方法准确可靠，重复性好，回收率高，可作为水产品中孔雀石绿和结晶紫及代谢物的检测方法。水产品中孔雀石绿和结晶紫及其代谢物的检测(参考SN/T 1479-2004进出口水产品中孔雀石绿残留量检验方法和 GB/T 19857-2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定)1 适用范围本方法适用于水产品中孔雀石绿和结晶紫及其代谢物的检测。2 样品准备/提取1、称取已粉碎（已均质）的样品1 g于15 mL离心管中，加入1 mL 0.05 mol/L苯磺酸溶液、1 mL0.25 g/mL盐酸羟铵溶液、0.4 mL0.1 mol/L乙酸铵溶液(pH4.5)和8 mL乙腈，涡旋混合2 min，4000 rpm离心1 min；2、将上清液转移至50 mL离心管中，残渣按照步骤1重复提取一次；3、合并两次提取液，并加入6 mL三氯甲烷和7 mL水，涡旋混合1 min，4000 rpm离心1 min；4、取下层清液于旋蒸瓶中，向上层清液加入6 mL三氯甲烷，重复提取一次；5、合并两次下层三氯甲烷溶液，40减压蒸至近干，加入5 mL乙腈待净化。3 SPE柱净化ProElut Al-N（1 g/6 mL）（Cat.#：65306）上层ProElut SCX（500 mg/3 mL）（Cat.#：63604）下层(1)活 化：加入10 mL乙腈，流出液弃去； (2)上 样：将待净化液加入小柱，流出液弃去；(3)淋 洗：加入5 mL乙腈淋洗小柱，流出液弃去，并去掉上层Al-N小柱；(4)洗 脱：加入5 mL5%氨水乙腈，收集洗脱液；(5)重新溶解：将洗脱液在40 下减压蒸干，1 mL定容液*溶解残渣，过微孔滤膜供HPLC分析。*定容液：乙酸铵缓冲液：盐酸羟铵溶液=2：1乙酸铵缓冲液：乙腈：0.05 mol/L乙酸铵溶液(pH4.5)=75:25；盐酸羟铵溶液：取1 mL0.25 g/mL盐酸羟铵溶液用水定容至100mL。4 分析条件色谱柱：Platisil ODS，250 x 4.6 mm，5 m（Cat.# 99503）流 速：1.0 mL/min 检测器：UV 591 nm和UV 266 nm柱 温：30 进样量：20 L 流动相：A：乙腈 B：0.05 mol/L乙酸铵溶液(pH4.5)梯度：时间/ min05.511.011.0120B288828285添加回收结果分析物添加水平(mg/kg)回收率(%)RSD(n=4)%孔雀石绿1.00 82.81 7.85 结晶紫1.00 98.60 1.39 隐色孔雀石绿1.00 95.46 2.73 隐色结晶紫1.00 90.03 1.31 5.1孔雀石绿和结晶紫检测图谱(UV 591nm)1.孔雀石绿2.结晶紫5.2 鳕鱼中孔雀石绿和结晶紫(添加水平1.0 mg/kg)检测图谱(UV 591nm)1.孔雀石绿2.结晶紫5.3 鳕鱼中孔雀石绿和结晶紫(空白)检测图谱(UV 591nm)5.4隐色孔雀石绿和隐色结晶紫检测图谱(UV 266nm)1.隐色孔雀石绿2.隐色结晶紫5.5 鳕鱼中隐色孔雀石绿和隐色结晶紫(添加水平1.0 mg/kg)检测图谱(UV 266nm)1.隐色孔雀石绿2.隐色结晶紫5.6鳕鱼中隐色孔雀石绿和隐色结晶紫(空白)检测图谱(UV 266nm)6 Diamonsil C18(2) 测定孔雀石绿和结晶紫及其代谢物结果6.1样品制备制备方法：1.0 mg/L孔雀石绿标准溶液(流动相配制)6.2 分析条件色谱柱：Diamonsil C18（2），250 mm 4.6 mm，5 m（Cat#：99603）流 速：1.0 mL/min 检测器：UV 591 nm和UV 266 nm柱 温：30 进样量：20 L 流动相：A：乙腈 B：0.05 mol/L乙酸铵溶液(pH4.5)梯度：时间/ min05.511.011.0120B288828286.3孔雀石绿和结晶紫检测图谱(UV 591nm)1.孔雀石绿2.结晶紫6.4隐色孔雀石绿和隐色结晶紫检测图谱(UV 266nm)1.隐色孔雀石绿2.隐色结晶紫水产品种孔雀石绿和结晶紫及其代谢物的检测（大部分有现货）参考SN/T 1479-2004进出口水产品中孔雀石绿残留量检验方法和 GB/T 19857-2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定货号名称规格样品前处理65306中性氧化铝固相萃取柱ProElut Al-N1 g/6 mL, 30/pk63604强阳离子交换固相萃取柱ProElut SCX500 mg/3 mL, 50/pk24435812管防交叉污染真空SPE萃取装置12位48031,3,6 mL柱管通用连接器15/pk4806考克(控制流量)15/pk99011真空/正压两用泵，无油1/pk99013抽滤瓶套装(包括硅橡胶管2米,2L抽滤瓶及橡胶塞)1/pk37177ProMax针头式过滤器 Nylon13 mm,0.22 m 100/pk37180ProMax针头式过滤器 Nylon13 mm,0.45 m 100/pk色谱柱及保护柱99503反相高效液相色谱柱Platisil ODS250 4.6 mm ID, 5 m99603反相高效液相色谱柱Diamonsil C18(2)250 4.6 mm ID, 5 m6201EasyGuard C18 保护柱10 4.0 mm2个柱芯+1个柱套99611反相高效液相色谱柱(LC/MS用)Diamonsil C18(2)50 2.1 mm ID, 3 m标准品55-46396-250MG孔雀石绿草酸盐2437-29-8250 mg56-46364-250MG结晶紫548-62-9250 mg50P-C14629500隐色孔雀石绿129-73-7100 mg50P-C14629400隐色结晶紫1173023-92-1100 mgHPLC溶剂缓冲盐离子对试剂50101乙腈 HPLC级4 L50102甲醇 HPLC级4 L50117二氯甲烷 HPLC级4 L50132冰乙酸 HPLC级50 mL50144甲酸 HPLC级50 mL50138醋酸铵 HPLC级100 g通用色谱产品52401B瓶架/蓝色50 孔52401A瓶架/白色50孔5323样品瓶（棕色/螺纹）2 mL, 100/pk5325样品瓶盖/含垫（已经组装）100/pkH80465HPLC 进样针25 L订购电话：北京：400-608-7719上海：021-6126 3966广州：02