食用菌源中的生物活蛋白和活肽的研究概况.doc

食用菌源中的生物活性蛋白和活性肽的研究概况 李桃秀摘要：食用菌味道鲜美，风味独特，并且含有多种生物活性物质，不仅具有较高的食用价值，还具有重要的医疗保健功能，成为学者们研究的热门物质。本文对食用菌的生物活性蛋白的各种生理学功能进行整理和分类，并介绍了几种现阶段分离提取食用菌活性蛋白比较典型的方法。然后，对几种食用菌活性肽及其分离提取方法进行综述，并提出一些食用菌生物活性物质的分离提取研究方面存在的缺陷以及应用前景。关键词：食用菌；活性蛋白；活性肽0 引言食用菌（edible fungi）是一类可以食用的大型真菌,具有肉质或胶质的大型子实体，又常称为蘑菇或者食用蕈菌。食用菌既是一类重要的菌类蔬菜，又是食品和制药工业的重要资源。多年来， 食用菌营养成分研究表明， 食用菌是一种高蛋白质、高膳食纤维食、低脂肪的理想食品。尤其是食用菌的蛋白质含量， 平均约为15%-25%，,食用菌子实体的蛋白质含量一般为鲜重的3%-4%或干重的30%-45%1。蛋白质消化率高, 大约70 % 的食用菌蛋白质在人体内消化酶作用下, 分解成氨基酸被人体吸收。因此，食用菌中氨基酸的种类、含量，必需氨基酸的种类是评价食用菌的蛋白质质量的一个重要指标。而多肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物, 但肽的营养和生理功能优于高蛋白( 大分子蛋白质) 和氨基酸。具有防病、治病和调节人体生理机能的功效, 这些功效是原蛋白质及其所组成的氨基酸所不具备的,所以肽是提供机体生长、发育所需的物质。食用菌中富含蛋白质、氨基酸、维生素及微量元素,从其中分离和纯化的物质,表现出很强的抗肿瘤、免疫调节、抗病毒、抗细菌和抗其它寄生物,还有治疗糖尿病、心血管病和高胆固醇症的作用。近年来国内外学者们对食用菌中的活性物质的研究有了很大的成果，对食用菌中的生物活性蛋白和活性肽的研究也越来越多，食用菌作为保健食品进入了人民大众的生活中。1 生物活性蛋白1.1 食用菌中活性蛋白1.1.1 抗病毒蛋白食用菌作为一类大型真菌,普遍用于食用和药用,且资源十分丰富,进一步开发利用,前景非常广阔。从食用菌中分离到的物质,表现很强的抗病毒活性。近年来,从食用菌中发现多种抗病毒的蛋白，如2003年孙慧2等人从杨树菇（Agrocybe aegerita）的子实体中提取出一种有抑制烟草花叶病毒( TMV) 侵染活性的蛋白质AAVP,结果显示，当AAVP 的浓度为200 mg/ L 时, 对TMV 的抑制率为84. 32 %。而它对供试的3 种植物病原真菌: 绿色木霉、香蕉炭疽菌和甘薯蔓割病菌的菌丝生长没有任何抑制作用。说明AAVP 具有抗病毒活性而没有抗真菌活性。2004年，陈宁3等人从从灰树花子实体中分离到了一种具有抑制烟草花叶病毒( TMV) 侵染活性的热稳定蛋白GFAP，并将GFAP 与TMV 混合接种心叶烟, 当GFAP 浓度为32 mg/L 时即可完全抑制浓度为10 mg/L 的T MV 的侵染, 而4 mg/ L 的GFAP 对浓度为40 mg/L 的TMV 的抑制率仍可达60%以上。2007年，对鸡油菌，蘑菇，香菇，平菇，茶树菇，鸡腿菇，真姬菇和金针菇8种食用菌乙醇提取物水溶液进行抗植物病毒( TMV ) 活性测试, 结果表明8种食用菌提取物对TMV 都具有不同效果的抑制作用, 推测食用菌提取物中可能含有小分子抗植物病毒( TMV )活性物质。PIRAINO4 等1999年从皱盖罗鳞伞( Rozites caperata) 中分离纯化了一个分子量为10 425 Da 的抗病毒蛋白( RC-183) ,该蛋白显示对I 型和型单纯疱疹病毒复制的抑制,此外该蛋白还有对水痘带状病毒、流感A 病毒和呼吸道合胞体病毒的抑制作用,由质谱和其它方法研究表明它是一个结合有泛素的多肽。1.1.2 免疫调节蛋白真菌免疫调节蛋白（fungal immunomodulatory protein，FIP）是20 世纪90 年代从高等担子菌( 蘑菇类) 子实体中提取的与植物凝集素和免疫球蛋白的结构及免疫功能相似的一类小分子蛋白质。近年来随着学者们对真菌免疫调节蛋白研究的发展，已经有好几种真菌免疫调节蛋白被分离纯化。SHEU5 等2004 年从毛木耳(Auricularia polytricha) 子实体中分离到一个分子量13.4 kDa ,等电点为5.1 的免疫调节蛋白APP。2007年，郭琦6等人从金针菇中提取出一种具有免疫调节功能的蛋白质FIP-fve,又称为朴菇素，这种蛋白具有免疫调节和细胞凝集活性。FIP gts 也是从松杉灵芝中发现的一种免疫调节蛋白，可以治疗癌症和自身免疫性疾病。FIP vvo 是从草菇中提取得一种免疫调节蛋白，能够增强细胞因子的表达。FIP 家族成员在体内外具有不同程度的促进细胞分裂和免疫调节功能7。1.1.3 凝集素凝集素是一类不同于免疫球蛋白的蛋白质或糖蛋白, 它能与糖专一地、非共价地可逆结合, 并具有凝集细胞和沉淀聚糖或糖复合物的作用。食用菌富含多种具有生物活性的蛋白质，凝集素是其中的一种，也是研究的最深入的一种，有重要的医学和生物学功能。已有多种大型真菌凝集素被分离纯化，大多数大型真菌凝集素具有很强的抗肿瘤活性。Koyama8 等在2002年从牛肝菌( Boletopsis) 中分离的一个单体凝集素KL15，可诱导单核母细胞白血病细胞U937 的凋亡。同时实验表明Caspase 酶抑制剂可抑制DNA 梯状条带的形成，进一步证明凝集素诱导细胞凋亡的机制是通过激活Caspase 酶而完成的。这是第一次报道真菌凝集素具诱导细胞凋亡的活性。Zhao 9等从杨树菇中分离了相对分子质量为15800Da不含糖的橘果粉胞凝集素( AAL) ，体外可抑制多种肿瘤细胞生长。肿瘤组织中，可见典型的凋亡细胞生物化学和形态特征。2005年江苏食品与发酵报道了关于食用菌凝集素的主要生理功能，有：抗肿瘤活性，抗病毒活性，免疫调节, 促有丝分裂，抗进食活性和杀虫活性等10。1.1.4 核糖体失活蛋白核糖体失活蛋白( Ribosome Inactivating Proteins , RIPs ) 是一类作用于rRNA而抑制核糖体功能的毒蛋白。LAM11 等2001 年从斑玉覃(Hypsizygus marmoreus) 中纯化出一个核糖体失活蛋白hyp sin ,其分子量为20 kDa ,这个核糖体失活蛋白对落花生球腔菌、梨轮纹病菌、尖饱镰刀菌 和灰葡萄孢 等真菌的菌丝体生长有抑制作用,还能抑制兔网织红细胞蛋白合成,抑制HIV-1反转录,同时还观察到该蛋白对鼠白血病细胞以及人白血病细胞和肝癌细胞的抑制 。NG12 等2004 年从金针菇( F.velutipes ) 子实体中得到分子量分别为30kDa和19kDa 的核糖体失活蛋白flammin 和velin , 在兔网织红细胞裂解液翻译系统中抑制蛋白质合成的半抑制浓度分别为1.4nM 和2.5nM。不同的核糖体失活蛋白具有不同的活性, 如免疫抑制作用、抗有丝分裂活性、抗增殖和抗肿瘤活性、抗病毒及抗HIV21 病毒活性等。1.1.5 RNaseRNase 是一类广泛存在于动植物体内的核酸水解酶。除了水解RNA 的活性外，很多RNase 具有潜在的细胞毒性。RNase 能广泛参与RNA 代谢、细胞成熟、细胞凋亡以及宿主防御RNA 病毒等过程。有些RNase 具有抗病毒和抗肿瘤等特殊的生物学功能13。Ngai 等14从糙皮侧耳中分离一种9000的低分子量Rnase，可抑制L1210细胞的增殖。Rnase 通过水解RNA 磷酸二酯键来降解RNA。不同的Rnase 专一性不同，如RnaseT1 作用位点是3鸟苷酸与其他核苷酸的5OH 间的连接键。1.2 食用菌活性蛋白的分离提取方法2001年，孙慧2用硫酸铵分级沉淀、离子交换(DEAE-Sepharose) 和分子筛(S-200) 的方法, 从食用菌杨树菇的子实体中分离提纯了一种具有抑制烟草花叶病毒( TMV) 侵染活性的蛋白质, 称作为AAVP。2004年，陈宁3等人通过硫酸铵分级沉淀、阴离子交换柱层析及凝胶过滤柱层析, 从灰树花子实体中分离到了一种具有抑制烟草花叶病毒( TMV) 侵染活性的热稳定蛋白GFAP。而伍善广15等人在2010年采用传统水浸提法提取茶树菇子实体中的蛋白质和多肽，通过对浸提产物的体外活性分析。实验结果表明，茶树菇蛋白质提取率随浸提时间延长而增大，但当浸提超过12h 后，茶树菇蛋白质提取率略有降低；碱性条件可以缩短茶树菇蛋白质提取时间、提高蛋白质提取率。2. 生物活性肽生物活性肤是一类由种天然氨基酸以不同的组成和排列方式构成的从二肤到复杂的线性、环形结构的不同的肤类的总称, 是源于蛋白质的多功能化合物。无论是从结构还是从功能来说，生物活性肤都是自然界中存在种类最多，功能最复杂的一类化合物，广泛的存在于细菌、真菌、植物和动物中。生物活性肤具有多种人体代谢和生理调节功能, 特别是一些低肤不仅有比蛋白质更好的消化吸收性能, 还具有促进免疫、调节激素、抗菌、抗病毒、降血压和降血脂等生理机能, 食用安全性极高, 是当前食品科技界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。目前报道较多的是从植物蛋白或动物蛋白中提取分离得到的活性肤，而食用真菌活性肤的研究仅局限于灵芝肽、姬松茸肽、云芝肽、茶树菇肽等2.1 灵芝肽分离和研究灵芝活性肽，可使其充分发挥功效，开发成保健品。由于小肽比蛋白质、游离氨基酸更易吸收，对于体弱的病人服用小肽制剂可改善其蛋白质营养状况，小肽制剂也可成为运动员营养中很好的氮源。湖南工业研究所16首先发现灵芝肤具有提高人体耐缺氧能力的活性。他们以氨水作洗脱液，采用732lHI型阳离子树脂分离灵芝发酵液的醇、水提取物，得到四个肤。两个酸性肤(由n种氨基酸组成)一个碱性四肤和一个中性肤(9种氨基酸组成)，其中中性肤的活性最强。1997年，何慧17等人研究了发酵灵芝粉中肽类化合物的分离及其生物活性。将发酵灵芝粉的水和醇提取物上离子交换树脂柱, 依次用酸性、中性、碱性淋洗液洗脱分组,得酸溶性、水溶性和碱溶性的肽类化合物。研究发现对羟基自由基的抑制作用:中性洗脱部分 碱性洗脱部分,抑制率高达81% ,酸性洗脱部分抑制作用不明显。2001年，孙慧18等人又采用Cu-SephadexG-25柱层析法将灵芝水的提取超滤膜过滤物中小肽与游离氨基酸有效地分离。经氨基酸分析确定肽的纯度和组成，肽除具有较好的抗羟基自由基活性外，还具有较高的必需氨基酸含量。经毛细管电泳分析初步认为得到13 种肽。2.2 云芝肽云芝糖肽（polysaccharopeptide，PSP）是1984年上海师范大学杨庆尧教授首次从培养的云芝深层菌丝体中提取出来的一种多糖肽，是云芝的主要活性成分，近年来关于云芝糖肽的免疫调节作用，特别是在抗肿瘤的免疫调节辅助治疗方面，进行了很多基础和临床的研究。2010年，林丽19等人对云芝糖肽的免疫调节作用进行了综述，推测云芝糖肽能通过上调免疫球蛋白的量和激活补体来达到活化B淋巴细胞的作用，从而最终执行体液免疫的作用，抑制肿瘤的生长；且云芝糖肽能提高患者免疫功能。云芝糖肽还具有刺激集落刺激因子分泌的作用，PSP能通过体内间接途径诱发或促进CSF造血生长因子的分泌，从而能刺激受照射机体自身造血功能恢复。2011年，杨明俊20等人对云芝糖肽在免疫调节、抗肿瘤等方面药理活性及其作用机制的最新研究进展作了综述，介绍了云芝糖肽对机体免疫功能的双向调节作用，以及云芝糖肽通过线粒体通路和死亡受体通路诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制和抑制前列腺癌干细胞进而预防肿瘤发生的机制。而关于云芝肽的分离提取方法，2008年，宋万杰21首次采用超高压提取技术提取云芝菌丝体中活性肤类成分，确定了超高压提取肤类成分的最佳工艺参数为:提取压力40OMPa、保压2min、料液比1:5、高压处理前浸泡2.5h，在此条件下，活性肤的得率为3.23%，对轻基自由基的抑制率为62.25%。他还以云芝菌丝体蛋白酶解液为原料，得出三种蛋白酶对菌丝体蛋白水解能力的大小次序为中性蛋白酶酸性蛋白酶碱性蛋白酶;三种酶解液的多肤得率也以中性蛋白酶最高。2.3 姬松茸肽2004年，焦迎春22等人采用两次葡聚糖凝胶色谱法从姬松茸菌丝体中提取的肽类物质, 初步分离获得肽, 继而分析了肽的氨基酸组成和分子量。结果表明, 姬松茸菌丝体中的活性肽含有丰富的氨基酸, 是一种具有高F 值( 22. 5) 的寡肽, 其分子量在1500 30000U 之间。同年，焦迎春23等人还通过对姬松茸菌丝体中活性肽提取工艺的初步研究, 并采用单因素考察及正交实验法对姬松茸菌丝体的活性肽提取条件进行了优化。结果: 在姬松茸干菌丝粉中加入8 倍体积的水, 在温度28和pH 9.0的条件下, 用70%乙醇的沉淀提取6 h, 所得提取液中活性肽的含量及抗氧化性均最优, 经毛细管电泳图谱分析其活性肽分布也较适2005年，洒威24等人通过单因素考察及正交实验法对姬松茸子实体活性肽提取条件进行了优化。结果显示在姬松茸干子实体粉中加入8 倍体积的水, 在温度为4 和pH9. 0 的条件下, 用70%乙醇的沉淀提取6 小时, 得到提取液的活性肽的含量及抗氧化性均最优, 经毛细管电泳图谱分析其活性肽分布也较适宜。2.4 褐蘑菇肽2009年刘莹采用单因素和正交试验，以水提醇沉的方法来获取褐蘑菇子实体中的活性肽类物质，试验结果表明，褐蘑菇子实体活性多肽的最佳提取条件为：温度4、时间6 h、料水比112、pH 值8、水醇比11.5。2.5 茶树菇肽从食用真菌中提取纯化降血压活性肤还属于一个崭新的研究,在国内研究较少,国外对于此的研究也是处于起步阶段。从2001年之后，国外越来越多的学者开始研究食用菌中的活性肽的分离提取方法，曾有学者研究了一系列食用菌的水、乙醇、甲醇提取液的降血压活性,其中灰树花的水提液降血压活性最强,其对ACE的活性抑制率可达到58.7%,2005年,张丽梅26等人同样对灰树花进行了研究,简化了ACE抑制肤的提取工艺条件。2008年，孙红娜27对茶树菇降血压活性肽进行了分离提取研究，结果为固液比1:40,溶液pH为8,30恒温搅拌提取,此时蛋白质提取率（D）可达到88.3%,提取液对ACE的抑制率为49.3%3 存在的缺陷及前景我国菌物资源丰富，化学成分的结构种类丰富，且很多食用菌中含有多种生物活性物质，具有多种抗病性，可用作多种医疗保健食品中。但是，目前对食用真菌活性成分与药理作用的关系及作用机理的研究还不够充分，鉴于食用真菌的食用价值和保健价值，有必要对其进行深入研究。而目前食用菌的分离提取工艺中，提取率都还偏低，且实验较为费时费力。随着研究的不断深入，以及当代先进技术的应用，食用菌的生物活性蛋白和活性肽等生物活性物质的提取工艺会越来越成熟，且活性肽的生产成本和产量将会大大增加，食用真菌的综合开发利用将会展示出更为美好的前景。参考文献1 高观世， 张陶， 吴素蕊等.食用菌蛋白质评价及品种间氨基酸互补性分析J.中国食用菌2012，31(1):35-38.2 孙慧，吴祖建，谢联辉等.杨树菇( Agrocybe aegerita) 中一种抑制TMV侵染的蛋白质纯化及部分特性J.生物化学与生物物理学报，2001 , 33(3): 351-354.3 陈宁，吴祖建，林奇英等.灰树花中一种抗烟草花叶病毒的蛋白质的纯化及其性质J.生物化学与生物物理进展,2004,31 (3)：283-286.4 PIRAINO F , BRANDT CR. 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