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脚 025 2 10叮 021 6 5 2 7 09 2 02 7 8 1 3 2 3 21 02 5 950 35 4 7 41 9 7 0 2 20 7 7 8 95 7 835 25 34 3 24 3 5 50 八 2 904 2 5 一 3 3 35 790 9 基因工程国内外进展和差距 戴顺志 中国医学科学院医学情报研究所 夕 基 因工程是分子水平上的遗传工程 它主要运用重组 技术 在特殊酶的作 用 下 在体外人工连接来自不 同生物体的目的基因于有自主 复 制能力 的 载 体 质粒 中 建成重 组 的质粒 将此重 组质粒送入受体生物细 胞去复制和表达 达到 遗传物质的转移 产生所需蛋 白质 重组 技术的主要环节有 目的基因的分离 或 克隆 体外重 组 载体传递或转染和复制 受体 细胞繁殖和表达 蛋白质提纯和 制 备 等 基因工程的最大特点是 打破 了生物种间界限 使微生物 动植物 甚至 人类之间 的遗传物质可以互相转移和重组 据此 这项技术可以用于控制和 改变生物的遗传特 一 一 性 创造对人类有利的新物种 研制治疗和预防传染病 肿瘤 遗传疾病等多种疾病的 制剂 备 探针诊 断疾病 分析和研究分 子生物学及医学的基本理论 重 组 技术首先应用于医药领域 并获得成功 年来 重组 技术已获 得 许多重大进展 我国自八十年代初期引进该技术以来 也有较大 的发展 但由于基础研究 差 实验 手段落后 我国在基 因工程 上未能 做 出任何创新 目前停留在 国外零件 国 内组装 的阶 段中 国内工业水平落后 严重地影响了我国对基因工程产品的开 发 利 用 进一步拉大 了我国与国外的差距 估计约晚 一 年 基因工程的表达系统 在国外重组 受体细胞 又 称表达系统中 第一代 为大肠杆菌 酵母菌和枯 草 杆菌 它们是原核细胞表达系统 第二代为哺乳动物细 胞 真核细胞 痘 苗病毒和昆 虫病毒等 其中大肠杆菌 酵母菌表 达系统比较成熟 已有定型的工业化生产工艺 已 分别于今年 获得美国食品和药品管理局 批准生产 产品投放市场 国 外常用的哺乳动物细 胞有中国地鼠卵细 胞 细胞和绿猴肾细 胞等 尽管哺 乳动物细胞作 为重组 表达系统在国外正处于中间试验阶段 工 业化生产工艺尚待 定型 但其表达 蛋 白质产量比原核细 胞表达系统高 每天可收获 微克 百 万细胞 可 连续收获 个月 哺乳动物表达系统将蛋 白质产物分泌 出细胞外 纯化蛋 白收率达 还 可简化提纯 工序 降低成本 随着动物细胞工业化培养技术 的发 展 使用哺乳动物细 胞表达系统来生产基因工程产品是很有前景的 痘苗病毒作为重 组 技术的表达系统 具有易于应用的特点 因为过去 有生产 和预 防接种痘 苗的经验 技术和设备 为解决痘苗病毒的毒性作用 如引起种痘反应和 变态 反应性脑 炎等问题 目前国外正在改造痘苗病毒 通过诱导突变或 置入胸 腺啼咤激 酶等基因 使其毒力降低 此外 通 过重组多种病毒基因 制备多价活疫苗的研究工作 正在进行 可望通过 动物试验证实 接种重 组 的痘苗病毒 预 防由流感病毒 单 纯疤疹病毒 乙型肝炎病毒 狂犬病毒 疤疹性口腔类病毒 呼吸道合胞病毒和福氏小 鼠白血病病毒引起的疾病 此外 国外还在探索建立 其他表达系统 如伤寒杆菌 巨大芽胞杆菌 多角病毒 昆虫卵巢细胞 链霉菌等 以寻找适用性广 产量高而 无毒的表达系统 我国已建立大肠杆菌 酵母菌 哺乳动物细胞 和痘苗 个重 组 的表达系统 已获表 达成功 目前正致力于启动子 增强子或其他重组 技术的研究 设法提 高 重组体的产量和稳定性 正在从事更 多外源基因重 组的研究和开发工作 基因工程疫苗 重组 技术正在为疫苗的研制和 生产带来革新 它不但可改进现有疫苗 还可 生产和制 备 出许多新疫苗 为 防治重大疾病提供手 段 为计划 免疫的未来创 造 崭新面 貌 一 一 国外研制重组 疫苗的工作进展很快 大 多数主要病原体 的重组基因研 究 已 获 得成功 但进度不一 正分别处于基因表达成功 中间试验 临床试验或改进工艺流程 等阶段之中 中 近期可 以制备出的重组 疫苗有 细 菌方面为麻风杆菌 百日咳 杆 菌 淋病球菌 脑 膜炎菌 传染性腹泻菌 链球菌 和6 绿脓杆菌和梅毒等 病 毒 方 面有乙型肝炎 甲型肝炎 痘疹 性带状疤疹 巨细 胞病毒 单纯忘疹 流感 非甲非乙 型肝炎 轮状病毒 人免疫缺陷病毒 乳 头瘤病毒等 寄生 虫方面为疟原虫 利什曼原 虫 血吸虫 推虫等 真菌方面为组织胞浆菌 曲霉菌和念珠菌等 与国外相比 我国正在研制的重组 疫苗的种类不多 目前都在进行实验室 研 究 现就我国已开发研 究的重 组 疫苗 简述其国内外进展 乙 型肝炎病毒表面抗原重组 疫苗 目前 国内外乙型肝炎病毒重 组 疫 苗的研制工作已取得不 同程度的重要进 展 在国外 乙型肝炎病毒表面抗原基因在大肠 杆菌 酵母菌 哺乳动物细胞和痘苗病毒中均已获得高效表 达 其中酵母系统已完成基 础研究及中间试验 获得了能 供生产乙型肝炎 疫苗的重 组酵母菌 有定型的工业化生产 工艺 重组的疫苗经数千 人临 床观察证明安全有效 美国默克公司改进了 表达系 统 用 甘油醛磷酸脱氢酶启动子替代原来的乙醇脱氢酶启动 子 提高了表面抗原的表达 量 重组酵 母菌表达的乙型肝炎病毒表面抗原虽不含前7区和糖化蛋 白 但动物试验 和 人体临床观察均证明它有良好的抗原性和保护作用 用重组疫苗免疫小鼠 证明其免疫 原性与血源 疫苗相 同 用 之免疫黑 猩猩 产生 了牢固的免疫力 能抵抗34 和3 亚型乙 型肝炎病毒的攻击 接种重组疫苗于 成年人 儿童和新生儿 观察到其抗体 阳转 率均达 以上 用以按种孕妇 证 明它阻 断母 婴之 间乙型肝 炎传播的效果良好 培养 的重 组酵母菌经破 碎 纯化 抗原纯 度大于 默克公司生产的重组 疫 苗已 于 年 月 日获得美国 批准 生产投放市场 美国史克公司 制备的类似疫苗亦可 望今年获得批淮 哺乳动物细胞系统表达的乙型肝炎病毒表面抗原 在国外于 年已进 入中 间 试 验 美国基因技术公司用含有乙型肝 炎病毒表面抗原基因的质粒转染中国地鼠卵细胞 9 9 细胞表达的表面抗原被分 泌到培养液中 表面抗原含糖基化多肤 用纯 化的表面抗原免疫 黑猩猩 显示它有良好的免疫原性和保 护作用 已进行的少量人体观 察 证明其免疫效果优于默克公司血源疫苗 日本三菱化成公司也用此 细 胞进行中 间试验 预计 年可批量生产 美国综合遗传公司用含乙型肝炎表面抗原基因的质粒 转染 细 胞亦获成功 收获的表面抗原经动物试验证明有良好的免疫效果 目前正进 行临床观察 使用痘苗病毒表达重组 乙型肝炎病毒表面抗原的研究 正处于实验室 研究 阶 段 用重 组的痘苗病毒接种家兔 能诱导产生抗体 用之接种黑猩猩 只显示部分免疫 当用乙型肝 炎病毒攻击时 表现出轻微的非显性感染 目前尚未进行临床观察 在国内 酵母菌 哺乳动物细 胞 绿猴肾细胞 和痘苗病毒 天 坛株 三个表达系 统的乙型肝炎基因工程 疫苗的研究 工作 亦取得 不同程度的进展 但均尚处于实验室 研 究阶段 已构建了能表达乙型 肝炎病毒表面抗原的重组酵母菌 但其遗传学性状尚不稳 定 动物细胞和痘苗病毒亦已表达了表面抗原 小 量动物试验证明所表达的抗原有免疫原 一 一 性 由于国内后处理的工 业化生产水平低 以上三个表 达系统均未进 人中间试验 计划 在 七五 期间进行小量制备并完成中间试验 从时间上看 我国乙型 肝炎基因工程疫 苗的研制进 展 比国外至少 晚 年 留乱的重 组 疫苗 百多年来 国内外用 常规方法制备 的霍 乱菌苗均 不 理 想 至今尚未获得安全 高效的菌苗制剂 近年来 国内外利用重 组基因技术 将霍乱 弧菌的肠毒素6亚单位 外膜抗原 溶血素或其他致病因子 的 重 组人大肠 杆菌或 伤寒口服活菌苗 株内 已初步获 得表达 目前均处于实验室研究阶段 我国的基 因工程霍乱疫苗研制工作的起步比国外晚 一 年 七五 期间 霍乱工程疫苗的研 究工作将分二步走 首先争取高效表达肠毒素6亚单位 将之与高浓度灭活全菌混合 制备成口服混合菌苗 第二步是连接细菌有效保护性 抗原和肠毒素6亚单位二种基 因 置人载体 再克隆人伤寒口服菌苗 3 株中 构 建成霍乱 一 伤寒口服活菌苗 年 两者均将进人中间试验 疟原虫重组 疫苗 为帮助世界上 特别是 亚 非 拉发 展中国家数以千万 计的疟疾患者 国内外正在采用重组 技术 研制 疟疾疫苗 由于疟原虫种类多 生活史复杂 各时期疟原虫的抗原 特别是保护性抗 原 的特性 不 明 研制重组 疟原 虫疫苗的难度较大 重 组的疟原虫疫苗研制工作需包括用单克隆抗体筛选 保护性抗原和 分离 重组 表达它们的基因二部分工作 理想 的重 组 疟疾疫苗应是恶性疟原和间 日疟二种疟原虫抗原的混合多价疫苗 在一种疟原虫抗原中最好含有子 胞 子 红 内期 如裂殖子等 疟原虫和配子体 三个时期的疟原虫保护性抗原的混合疫苗 目前 国内 外都在进行疟原虫 特别是恶性疟原虫的童组 疫苗的研究 这 些尚处于实验室研 究 的初期阶段 国外的研究进 展较快 子 胞子 和裂殖子保护性 抗原的基因已分别在酵母菌 和大肠杆菌获得表达 恶性疟原虫子胞子 的重组疫苗已有可能在 年内投产 我国也开 展了恶性疟原虫子抱子和裂殖子重组疫苗的研究工作 已建成子抱子 的9 和 库 正在筛选其有效的 片段 裂殖子 已在大肠杆菌中初步表达 但与国 外相 比 约有 年的差 距 年我国重组 疟疾疫 苗有可能进 入 中间试验 重组 的活性蛋 白 人体液中含有许多具重要生理功能的活性蛋 白或多肤 如淋巴因子 激素 神经多 肤 调节蛋白 酶类 凝血因子等血液成份 这 些物质在体液中含量甚微 目前尚未知 其确切的功能 有些含量较高 已知有临床使用 的价值 但用常规方 法生产存在着来源 困难 产量过低 价格昂贵等问题 重 组 技术出现后 国内外都积极地开展了重组 活性蛋白和多肤的研究 约有 种 之多 目前已取得 了不 同程度的重要进展 人们 预言 通过应用重 组 技术研 究和生产这些活性蛋 白或多肤 将会有一批具调节 生 理功能和免疫功能 的新苗问世 将为人类治疗疾病开拓一个新领域 建立一个全新产 业 在国外 重组 的活性蛋 白和多肤的研究起步早 种类多 进展快 目前 基 因工程的胰岛素 干扰素已商品生产 白细胞介素 一 组织血纤维蛋白溶酶 一 一 原激活剂 5 8 肿瘤坏死因子 等已小批量生产 正进行不 同 阶 段 的临床 试验 可望其中一些在 年以前投放市场 一大批活性蛋白 和多 肤 如 一 集落刺激因子 7 6细胞 生长因子 6 巨噬 细胞激 活因子 3干 扰素 一种 3 型干 扰素 投放市场 日本政府也已批准日干扰素投放市场 预计重 组 的其他类型干扰素也 将于 年后陆续投放市场 在我国 重 组 的 3 型干扰素 年已在大肠杆菌获表达 年已 完 成小 试 小量临床试验证 明 重组 3 型 干扰素经 贴敷法治疗 例宫颈糜烂的病人 贴 敷 次后有效率达 年开始进 入中间试验 估计 年前才 能投放市场 重组 的 型 和 型干扰素正处于实验室研究阶段 与国外相比 我国基因工程干 扰素的研 究和生产的差距约为 年 组织血纤维蛋 白溶酶原激活剂 5 8 5 8 能启动凝血块中的尿激酶 溶解心 脑 血管中的血栓 有人估计5 8 溶解血栓的作用 比尿激酶 链激酶好 国外基 因重 组5 8 已获表达 也已完成工艺流程的研究 目前正处 于临床试验中 现已试用 于治疗 多 例病人 效果良好 一般使用5 8 后 分钟 血栓可被溶解 5 8 可用 于治疗心 脑血管血栓 也可用于抢救因出血性休克而产生的血管内弥漫性凝血 具有广阔的应用 前景和一定 的国防意义 此外 国外还已克隆 出5 8 的抑制物 它可治疗出血性疾病 我国重组 的58 工作起步稍晚 尚处于基因表达的实验室研究阶段 可望 年进 人中间试验 白细胞介素 一 一 是一种淋巴因子 由 淋巴细胞一种亚群产 生 它具有增强数种免疫细胞 如细胞毒性 淋巴细胞 9 自然杀 伤 细胞 细胞 和杀伤细胞 细胞 的活性 年 美国重组 一 的研究首次 获得 成功 美国目前有 家生物技术公 司正在研究重组基因的 或进行其 期 临 一 一 床试验 可望 年投放市场 重组 一 的临床试验表明 仅用一 次剂量 就可 使 3 0 肉瘤 爱滋病的一个主要病症 慢性白血病 卵巢癌和黑色素瘤等缩小 或 消失 显示其抗癌作用良好 此外 国外还致 力于重组基 因的 一 和 一 的研究 也已获表达 一 能诱导产生 一 还 能刺激表皮细 胞生长 有可能用于治疗创伤 和炎性疾病 一 能诱导某些 细胞产生特殊酶类 现正试用于治疗贫血症 我国的 重 组 一 的研究工作还 处于实验 室基 因表达 阶段 希望在 年进入中间试验 肿瘤坏死 因子 也是一种淋巴因子 在破 坏肿瘤细胞中起积极作 用 国外已基因重组 成功 目前正由儿家公 司进行临 床预备试验 美国 2 2 5 公 司进行的临床预备试验表明 重 组的 能破坏肿瘤细 胞 而 无害于正常细 胞 它 与丫干扰素联用的效果优于单独使用 在我 国 重组 的研究 正处于实验室基 因表达阶段 与国外差 距较大 红细胞生成素 8 和心钠素 8 是红细 胞造血系统的特异性调 节因 子 有促进红细 胞的祖代 细胞分化 发育的功能 临床 上有治疗某些贫血症 特别是肾病或 风湿性炎症引起的贫血症的潜在价值 之也是研究 某些血液病分 子机制所必需的活性蛋 白 心钠素是 年从人和大 鼠心脏分离出的一种新的调节肤 具有利钠 利尿 扩张 血管 降低血压 和抗心律失常的作用 对防治心血管疾病可 能具有实际应用的意义 国 内外都已开展了对 8 和心钠素的基因工程研究 都处于实验初期研究阶段 杂交探针 杂交探针是国外基 因工程研 究的一个领域 由双股组成 用化学方法解 离双股 后 单股 就有特异的互补 性结合作用 标记 上同位素或生物素的单股 互补性结合后可显示萤光 因而 杂交探针可作为疾病诊断和基础研究 的一 种 手段 与常规方法相 比 杂交探针具快速 灵 敏度高的特点 如美国基因探针公 司 2 一8 研制出的检 测军团菌病的 杂交探针 用于检测病人血清 痰 粪或肝细胞标本时 可将诊断时间从 小时缩短至 分钟 在 毫克肝组织内可检 测 出 个细菌 从各种细菌分离株中鉴 定 出 个军 团菌株 并证实其中 个为新株 细 胞间 特异的 如 9 癌基因 的 杂交探针还可测出哪个癌基因已 开 启 以进行癌症的临床前诊断 国外现已有数种 如 用于血型和器官移植 和前 列腺癌的 杂交探针投放市场 具有临床应用前景的 杂交探针还有 诊断传染病的 杂交探针 腹泻病原菌和病毒 人性病病原体 巨细 胞病 毒 乙型 肝炎病毒 疤疹病毒及其他病原体 产前诊断先天性异常 如镰刀细胞性贫血 日地中海贫血和4 9 22 氏肌营 养 不良症的 杂交探针 其他还有动脉粥样硬化易感性 职业病和癌症的 杂交探针 我国近年来开展 了一些研制诊断传染病 特别是乙 型肝炎的 杂 交探针的工作 但与国外的差距较大 一 一 基因治疗和基因预防 基因治疗和基因预防 是通过载体 导 人正常基因以取代突变基因 补充所缺失的 基 因 关闭或降低异常基因 癌基因 的表达水平等手段 在基因水平上 对遗传性疾 病和由遗传与环境因素共同作用导致基因突变 缺失或异常表达而引起的严重疾病 如 恶性肿瘤 心血管病 糖尿病等 进行的治疗和预防 在国外 由于分离人体