三点测交、伴性遗传、双因子杂交综合大实验.doc

山东大学实验报告 2013年 05 月 08 日姓 名 班 级 同组人 科 目 遗传学实验 题 目 双因子杂交、伴性遗传和三点测交 组 别 第五组 一、研究背景 果蝇（Drossphila）是遗传学试验中最常用的多年生物之一。属昆虫纲，双翅目，果蝇科，果蝇属。果蝇的染色体数目少（仅四对，2n=8），具有许多自然的或诱发的可遗传突变性状，世代周期短（25下1012天一代，个体小易于饲养，培养费用低廉，繁殖能力强，后代数目繁多，故被作为遗传学实验的典型模式生物。后续实验要作果蝇的杂交实验，需要大量的果蝇，本次实验可以学会识别果蝇的各种形状、区分果蝇的性别以及基本的饲养方法，为后续的实验打下基础。 黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)，果蝇科(Drosophilidae)果蝇属(Drosophila)昆虫。因其生活史短（在25左右温度下十天左右繁殖一代），繁殖力强（雌性可一次产下400个0.5毫米大小的卵），相对性状明显且可遗传，易于培养，培养成本低（酵母和细菌，腐烂水果），符合上述遗传学实验研究要求，同时因其染色体仅4对，基因组仅约165Mb，并且基因组超过60%的片段同人类疾病基因相似。故已将其作为一种常见的模式生物(model organism）大量使用在遗传学(genetics)和发育生物学(developmental biology)的研究。2、 研究目的1、通过对果蝇的杂交实验，正确理解分离定律的实质，并验证与加深理解三个的遗传规律。2、认识伴性遗传的正、反交差别，掌握伴性遗传的特点。3、掌握绘制遗传学图的原理和方法，加深对重组值、遗传学图、双交换、并发率和干涉等概念的理解。4、掌握果蝇的杂交技术，并学会记录交配结果和掌握统计处理的方法。5、尝试设计实验，验证缺刻翅的遗传型三、实验原理 本次设计实验就是利用果蝇进行一系列的遗传学验证实验和染色体基因相对顺序和距离的测定，下面简要介绍关于双因子杂交、伴性遗传和三点测交的基本原理。1、双因子杂交（dual factors hybridize）：果蝇的灰体基因（E）与黑檀体基因（e）为一对相对性状，位于R70.7位置，而长翅（Vg）与残翅（vg）为另一对相对性状，位于R67.0位置。这两对基因是没有连锁关系的，位于不同染色体上的非等位基因。 因此非同源染色体的这两对非等位基因可以很好的验证自由组合定律。自由组合规律：位于非同源染色体上的两对非等位基因，其杂合体在形成配子时，等位基因彼此分离，非等位基因可自由组合进入同一配子，结果产生4种比例相等的配子。若显性完全，F1自交产生F2代表现出4种表型，比例为9：3：3：1。双因子杂交的遗传规律： 双因子杂交正交 双因子杂交反交 18 14 14 18灰长 黑残灰长 黑残F1 灰长 F2: 灰长：灰残：黑长：黑残=9：3：3：1F1 灰长 F2: 灰长：灰残：黑长：黑残=9：3：3：1 2、伴性遗传（sex-linked inheritance）：位于性染色体上的基因叫作伴性基因，其遗传方式与位于常染色体上的基因有一定差别，它在亲代与子代之间的传递方式与雌雄性别有关，伴性基因的这种遗传方式称为伴性遗传。果蝇的红眼与白眼是一对相对性状，由单基因控制，位于X染色体上，基因之间的关系为红眼对白眼完全显性。当红眼果蝇（）和白眼果蝇（）杂交，F1代中的果蝇均为红眼，F2代中红眼果蝇白眼果蝇=31，但在雌果蝇中全为红眼，在雄果蝇中红眼果蝇白眼果蝇=11。当反交时，F1代中的雌果蝇为红眼，雄果蝇却为白眼。F2代中红眼果蝇白眼果蝇=11，在雌果蝇或雄果蝇中红眼果蝇与白眼果蝇的比例均为11。 伴性遗传的遗传规律： 伴性遗传正交 伴性遗传反交 XwXw 白眼 红眼 X+YX+X+ 红眼 白眼 XwY 18 w w 18 F1: X+ Xw Xw Y 红眼 白眼F1: X+ Xw X+ Y 红眼 红眼 F2: X+Xw Xw Xw X+ Y Xw Y 红眼 白眼 红眼 白眼 1 ： 1 ： 1 ： 1F2: X+ X+ X+Xw X+ Y Xw Y 红眼 红眼 红眼 白眼 1 ： 1 ： 1 ： 13、三点测交位于同一条染色体上的基因是连锁的，而同源染色体上的基因之间会发生一定频率的交换，使子代中出现一定数量的重组型。重组型出现的多少反映出基因间发生交换的频率的高低。而根据基因在染色体上直线排列的原理，基因交换频率的高低与基因间的距离有一定的对应关系。基因图距就是通过基因间重组值的测定而得到的。如果基因座位相距很近，重组率与交换率的值相等，直接将重组值作为基因图距；如果基因间相距较远，两个基因间往往发生两次以上的交换，必须进行校正，来求出基因图距。三点测交：用野生型纯合体与三隐性个体杂交，获得三因子杂种（F1），再使F1与三隐性基因纯合体测交，通过对测交后（Ft）代表现型及其数目的分析，分别计算三个连锁基因之间的交换值，从而确定这三个基因在同一染色体上的顺序和距离。通过一次三点测验可以同时确定三个连锁基因的位置，即相当于进行三次两点测验，而且能在试验中检测到所发生的双交换。如果两个基因间的单交换并不影响邻近两个基因的单交换，那么预期的双交换频率应当等于两个单交换频率的乘积，但实际上观察到的双交换值往往低于预期值，因为每一次发生单交换，它邻近也发生一次交换的机会就减少，这叫干涉。一般用并发率表示干涉的大小。 三点测交（一次杂交，一次测交） 6号（wsnm/wsnm） 18号(+/Y) 白卷小 红直长 F1: (+/wsnm) (wsnm/Y) 红直长 白卷小 统计F2代各类型及数目填入统计表4、 缺刻翅验证 书上所说，缺刻翅具有雄性致死的特征但是作为实验室长期保存的缺刻翅品种而言，在缺刻翅培养基内不存在野生型，那么雄性也应为缺刻翅。与书上的结论矛盾，因此缺刻翅的遗传需进一步验证采用缺刻雌与18号雄杂交，统计其F1代表型特征四、实验器材1、材料： 18号果蝇（野生型）及三种突变体果蝇即14号果蝇（黒身残翅）、w号果蝇（白眼）和6号果蝇（白眼卷刚毛小翅）、缺刻翅果蝇2、试剂：乙醇、乙醚、果蝇培养基等3、器具：麻醉瓶、酒精灯、白瓷板、毛笔、镊子、培养管、棉球等五、实验步骤第一周（4月1日 周一）：双因子正交18 14姓名:日期: 1.准备工作： 将麻醉瓶和器具（白瓷板、毛笔等）进行消毒灭菌，放凉。领取培养管6支，填写标签并贴在培养管上。 标签写法举例如右：选处女蝇: 共有4种果蝇品系，安排6个大桌分别负责 18号、14号、W号、6号果蝇的麻醉和雌雄分选2.杂交组合设计:双因子正交：18 14双因子反交: 14 18 伴性正交: 18 W伴性反交: W 186个杂交三点测交：6 18三点测交：6 183、培养：按照设计的组合将处女蝇和雄蝇分装在各个培养管中，每管中35对即可。用毛笔轻扫进培养管的管壁上，塞上棉塞后平放桌上。待管中果蝇都苏醒并活动自如以后，再将培养管竖着放进培养盒里。放25培养箱进行培养。第二周（4月7日 周日）：4、倒掉亲本果蝇并处死第三周（4月15日 周五）：5、观察F1代是否符合应该的表型，选择生活状态良好的F1互交，35对即可，放入新的培养管中置25培养箱进行培养。第四周（4月22日 周五）6、清除培养瓶中所有的F1亲本第五周（4月29日 周五 以及4月31日 周日）：7、观察F2，统计F2，处理数据。（统计过的果蝇放入酒精瓶中，杀死）六、实验数据表1 双因子杂交的实验数据双因子正交（1814）双因子反交（1418）组别灰 长灰 残黑 长黑 残灰 长灰 残黑 长黑 残本组4261215031第一组186934060第二组1052122440第四组3215104225123第五组168343000第六组31101123213123第七组17722无无无无全体1665749178822377表2 伴性遗传的实验数据伴性遗传正交（18W）伴性遗传反交（W18）组别白 红 白 红 白 红 白 红 本组360138745第一组81203612121414第二组1312018无无无无第四组252205121131318第五组02002114252321第六组3120197787第七组59085625全体5793016667706470表3 三点测交的实验数据三点测交（618）组别红直长+白卷小wsnm红直小+m白卷长wsn+红卷小+snm白直长w+白直小w+m红卷长+sn+本组188201210第一组185300300第二组174901230第四组222121310第五组1321133500第六组3112132710第七组2113540101全体14046321282361表4 缺刻翅验证的实验数据本组缺刻翅18缺刻18缺刻18F14402对F1自交F28142118二组缺刻翅18，F1代四种表型都有F1中缺刻18F281066F1中1818F2无19无17注：本组为第三组：柏捷铭&吴晓璇 第一组：自振涛&刘雅真 第二组：李钰茜&徐霖 第四组：吴显伟&刘馨德 第五组：吴宏宇&石文昊 第六组：张振宇&杨金才 第七组：殷军&翟贞文由于某些小组未长出F2代，因而数据为无。7、 数据分析由于单个小组的实验数据有限（我们组为第三组），在统计上需要大量的数据作为基础，因此实验数据的分析过程中的观察值和预期值都是基于全班实验结果的总计数据。对单个小组进行数据分析意义不大。1、双因子杂交的实验数据分析（1）预期F2的表型与比例： 灰长：灰残：黑长：黑残=9：3：3：1（2）正交的子二代的数量明显比反交的子二代的数量多这与求偶行为有一定的关系。（3）将F2中相同表型的个体叠加起来，作为这种表型的观察值，进行2测验。表4 双因子杂交的2测验灰长灰残黑长黑残总计观察值（O）254798624443预期值（E）249838328443偏差O-E5-43-4（O-E）2/E0.100.190.110.572=0.97df=4-1=3；=0.05；2=7.81结论：22；实验值与预期值有显著性差异，不符合红：白=3:1的分离比（2）伴性遗传反交：df=4-1=3；=0.05；2=7.81因而反22；观察值和预期值之间的差异不显著，实验结果符合反交1：1：1：1的分离比3、三点测交的实验数据分析：表6 三点实验F2果蝇的性状查看与统计表型实得数比例重组发生在wsnsnmwm+ + +14069.4%w sn m46+ + m3216.4%w sn +12+ sn m811.6%w + +23w + m62.6%+ sn +1合计268100%14.2%19.0%28.0%两端的基因间距离进行校正：28.0%+22.6%=33.2%据本次实验结果算出的三个基因的相对顺序和距离19.014.2 w sn m33.2 图1 w-sn-m三个基因的遗传学图单交换率分别为14.2%和19.0%；双交换率为2.6%并发率=2.6%(14.2%19.0%)=0.96，干扰=1-0.96=-0.04；说明一次交换后会干扰它的临近再发生一次交换。因此w-sn-m三个基因之间存在着正干扰。与理论基本相符。4、缺刻翅验证实验数据分析本组缺刻翅18缺刻18缺刻18F14402对F1自交F28142118二组缺刻翅18，F1代除缺刻雄都有F1中缺刻（杂合）18F281066F1中1818F2无19无17综合两组实验的F1代分析，都未见到缺刻雄性，貌似如同书上猜测具有雄性致死的特点从本组的F2代进行分析又见到了缺刻雄，因而书上的说法存在疑问。从F1代数据分析，否定了常染色体显隐性，X染色体显隐性的可能。而从二组的F1中1818自交而言更加印证缺刻基因非隐性基因。综上所述：判断缺刻翅不是普通的遗传类型。显然缺刻雄确有一定的雄性缺失性，但是在尝试通过多种致死模型来验证时，发现都不符合规律。且缺刻翅雄蝇消失的情况仅出现在F1代，甚至有可能是缺刻雄蝇生存率低，且出的慢造成的，可能在筛选F1时，缺刻雄仍然为幼虫。另一种可能为果蝇具有某些选择性（如同人类的计划生育），在基数小的情况下，选择性表达出具有快速繁殖能力的18野生雄果蝇（后代数量由雌性保证，因而繁衍后代的质量由雄性来表现，因为雄性交配，成本极低），当培养基中果蝇数量较多密度较大，选择占空间小，所需营养少，且繁衍周期长（猜测）的缺刻翅型。因而后代才出现缺刻雄性八、思考与讨论1、在双因子杂交实验中，观察到反交的F2代数量明显比正交的F2代少，而且在F2代计数时发现反交的后代出来的慢，因而猜测反交的后代出生率低并且生长周期长，还有可能是14的生殖过程较长，或者由于求偶行为造成的2、对于红白眼伴性遗传正交的实验结果存在的显著性差异，差异主要存在于白眼数量较少导致的显著性差异。班中有一组同学做了白眼红眼存活率的实验（其他组因为种种原因无幼虫出现），将红眼白眼自交，同样的雌雄个数，同样的天数进行培养，其结果为红眼F1代38只，白眼F1代27只，样本量不多，但具有一定倾向表明：白眼存活率比红眼存活率低。从生物进化上客观上讲，野生型红眼果蝇本应具有较高的存活率，与实验结果相符。另一种可能为白眼从蛹中孵化较慢，每个组都减少了一些于是导致整体白眼数量偏低。3、若在伴性遗传的正交的实验结果中出现一只白眼雌果蝇，这个例外个体产生，是由于在减数分裂的过程中两条姐妹染色单体不分离造成的，F2中出现了不应该出现的性白眼，但这种情况极为罕见，约几千个体中有一个。不分离现象解释如下图所示：F1 X+Xw X+YX+配子 X+ X+ Xw Xw 0 X+ Y F2