外周血、骨髓染色体教材ppt课件.ppt

外周血 骨髓染色体培养和制片中的注意事项 第一篇 细胞遗传学的基本知识 引言 细胞遗传学的形成和发展 1910年澳地利学者摩尔根在果蝇中发现了性锁遗传规律 1925年他又发表了 基因论 1955年 美籍华人徐道觉首先发现了哺乳动物细胞低渗染色体制备法 为医学遗传学的发展奠定了基础 1970年 卡斯伯森发现了人类染色体的分带技术 基本知识1 一 细胞遗传学时期 该时期大致是在1910 1940年 这一时期通过对遗传学规律和染色体行为的研究 确立了遗传的染色体学说 二 什么是染色体的行为 它是指在细胞周期中 染色体在形态和结构方面所表现出的一糸列有规律性的变化 这种变化对于生物的遗传和变异 起着很重要的作用 基本知识2 3 染色体是细胞核内满载遗传信息编码的重要物质 它是由DNA 组蛋白 非组蛋白和少量的RNA所组成的一种核蛋白复合体 从DNA到染色体要经过四级结构的构型变化 它们分别是 核小体 螺线体 超螺线体和染色体 基本知识3 染色体组型 即根据每种生物染色体的数目 大小和形态等特征 借助显微照相技术 将单个细胞内的同源染色体剪下 依次配对和分组排列 这就构成了该个体的染色体组型或核型 由于细胞在有丝分裂的中期 其染色体的形态最为典型 故此 通常把细胞分裂的中期 作为识别染色体的个体性和研究染色体组型的最佳时期 基本知识4 染色体带型 染色体经过一定程序的处理并用特定的染料染色之后 在普通在光镜或荧光镜下 染色体可显示出不同深浅颜色的条纹或不同强度的荧光区带 这种区带就称之为染色体带 染色体上染色体带的形态表现 就称之为染色体带型 这种显示染色体带的过程 就称之为染色体显带 第二篇 培养过程中的注意事项 注意事项 一 器皿的清洗是整个实验的关键性的第一步1 玻璃器皿的清洗新的玻璃器皿先用清水冲干净 再在清洁剂 如洗衣粉 洗洁精等 溶液中 用毛刷彻底刷干净 然后清水冲净 晾干 再用5 10 HCL 浓HCL原液浓度约36 泡过夜后 冲净烘干 再泡入清洗液中24小时 注意泡入的器皿内不能有气泡 再用清水彻底冲净 然后用蒸馏水冲净 普通器皿冲五遍 用作细胞培养的器 如培养瓶等 蒸馏水冲净后 再用三蒸水冲两遍以上 烘干 用纯棉布或无毒的硬纸包裹 高压高温灭菌备用 旧的玻璃仪器的清洗 可免去中间用5 10 HCL浸泡过夜这一步骤 其余的处理方法仍要保留 2 载玻片的清洗处理 把玻片逐片用皂粉液洗刷干净 用粗纱布刷 不要用毛刷 然后用自来水彻底冲净后 晾干 逐片放入清洗液中浸泡24小时 取出后用自来水彻底冲净 泡蒸馏水一天 取出放入盛有80 乙醇的容器 带密封盖 内保存备用 玻片的清洁直接影响染色体铺展 形态及背景的清晰 玻片之间粘在一起时 密封程度高 皂液和清洗液无法浸入 故要逐片浸入 注意事项 二 细胞培养中的有关知识 全血中含有红 白细胞二类 它们均是处于未分裂的间期细胞 红细胞没有核无分裂能力 白细胞虽有细胞核存在 但是在外周血中已处于休止期 因此要使白细胞从间期进入分裂期必须加刺激药物现在 最常用的促使分裂的药品是PHA 它能使白细胞中的淋巴细胞和单核细胞转化为具有分裂作用的母细胞 染色体只有在细胞分裂时才能出现具有一定的形态 这样才便于我们识别 此外 染色体的形态在细胞分裂中期时最典型的 所以在培养过程中还需用秋水仙素类药物 这种药物可以破坏细胞分裂过程中纺锤丝的形成 使细胞分裂停止于中期 由于秋水仙素的作用破坏了纺锤丝的形成 造成了染色体着丝粒不能分开 但染色体的两臂却在S期时已复制了 这就构成了染色体的形态为 X 形或 形 称之为中期染色体图形 为了便于观察和计数 因而在制作过程中还需采用低渗处理 低渗处理的目的在于使细胞膨胀 细胞膜破裂 染色体分散 这样可便于分析 一 培养中应注意的问题1 1 标本中的抗凝剂 标本中的抗凝剂常采用的是肝素 肝素是一种多糖 能阻止白细胞和淋巴细胞与红细胞集结在一起而影响培养的质量 但肝素浓度太高会导致溶血 同时也可抑制淋巴细胞的转化 一般剂量是100单位肝素液可抗凝5毫升血液 培养中应注意的问题2 培养基中的PH值 培养基中的红色来自成分中的酚红 因为它的变色范围较适合作培养基的酸碱度指示剂 它在PH 7时 颜色由红变深紫色 PH 7时 颜色则由红色逐渐变成黄色 外周血的培养液PH 7 2 7 4 另外 因酚红含量有时有差异 使培养液的红色深浅略有差异 但不影响培养效果 另外 在培养中 应注意观察培养基PH的变化 因PH变酸 将不利于细胞的生长 培养中应注意的问题3 培养基接种时的温度 培养基接种的温度应预热至此37度才好接种 若培养基的温度低于4度容易造成细胞的破裂 如果低于10度往往造成细胞进于休眠状态 影响细胞分裂周期 从而使分裂相减少 外周血和骨髓的样品应是越新鲜培养效果就越好 但我们的标本一般都是好几天的 所以当一旦接到标本后应尽快接种并记录每一批标本接种的时间 这样有利于分析有时培养失败的原因 暂时不能接种的应将添加过抗凝剂的外周血样品放在4 10 的冰箱中保存 保存期为3天左右 超过七天后接种 培养效果很差 培养中应注意的问题4 骨髓培养的问题 骨髓细胞处于生长分裂期 可以直接取样制备染色体标本片 为了增加细胞的分裂相数量 可在加入秋水仙素的培养液中作短暂的培养 再收集细胞制备染色体标本片 会获得较满意的分裂相数目 但是 白血病的病人往往都有可能服用过抑制白细胞分裂增殖的药品 再加上也未按停药后一定时间来取材 所以这类病人的骨髓样品往往经培养后 白细胞仍受到药物的抑制而不进行分裂增殖 因此标本片很难找到分裂相 所以应严格遵守细胞计数的原则 培养中应注意的问题5 最佳培养时间 外周血淋巴细胞在体外培养中 受到培养液中的PHA刺激 获得有丝分裂能力 经过68 72小时的培养后 大多数淋巴细胞进行了三次分裂增殖 数目达到制备标本片的要求 培养时间过短 细胞量不足 培养时间过长 细胞老化 营养耗尽 又浪费时间 实验证明 68 72小时的培养 效果最为理想 第三篇 制片中应注意的问题 制片中应注意的问题1 秋水仙素的浓度 秋水仙素的浓度和处理时间的长短 对染色体的分析都有很大的影响 秋水仙素的使用浓度范围比较宽 可差几十倍之多 一般终浓度为0 2 0 5微克 毫升 处理4 6小时 秋水仙素的浓度和处理时间的长短 对染色体的分析都有很大的影响 秋水仙素作用时间越长 被阻止的中期细胞越多 但染色体也会收缩 收缩过度会影响形态 制片中应注意的问题2 低渗处理 低渗处理的时间长短对染色体分析也有很大的影响 过长 细胞膜往往过早破裂 染色体丢失 过短染色体分散不佳 低渗后离心速度不能过高 过高往往会使分裂相过早破裂 完整的分裂相减少 制片中应注意的问题3 1 1 固定液的作用 固定液是稳定染色体的形态结构 清除染色体外层物质对染色体在玻片上展开的影响 通过更换固定液2 3次 清除红细胞的碎片 使标本片的背景更为清晰 广泛使用的固定液是甲醇和冰醋酸的混合物 二者的比例是甲醇 冰醋酸 3 1 现用现配 每次固定时间至少为30分钟 已固定的细胞在固定液中置冰箱4 密封保存一个月也不会变质 制片中应注意的问题3 2 2 加固定液的注意点 1 甲醇和冰醋酸的质量要好 2 固定液要新鲜 要现配现用 配好的固定液要盖好盖子 这是因为 甲醇和冰醋酸都很容易挥发 挥发后会影响固定效果 另外长期吸入 冰醋酸对人体是有害的 轻者会患鼻炎 重者会诱发其他疾病 3 加固定液的速度不能太快 要沿着管壁慢慢的加 上述三点未注意将会造成如下结果 1 染色体带很模糊 2 有残留胞浆的痕迹 使背景不清 3 加固定液的速度太快 则会使染色体容易扭转 4 如固定作用不足 染色体会出现毛刷状 制片中应注意的问题4 胰酶配制要点及使用注意点 胰酶的配制要注意两点 一是要充分溶解 这一过程一般会观察到溶液由混浊变澄清 二是配制时间也不能过