SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离大肠杆菌全蛋白.ppt

SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离大肠杆菌全蛋白 实验六 LOGO Yoursitehere 实验目的 学习SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理 掌握SDS 聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质的操作技术 基础性很强 使用范围广泛 学习蛋白质的考马斯亮蓝染色鉴定 LOGO Yoursitehere 实验原理 聚丙烯酰胺凝胶 是由单体丙烯酰胺 Acr 和交联剂N N 甲叉双丙烯酰胺 Bis 在催化剂N N N N 四甲基乙二胺 TEMED 和过硫酸铵 AP 或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶 以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE AP提供自由基 TEMED是催化剂 催化自由基引起的聚合反应进行 LOGO Yoursitehere 实验原理 聚丙烯酰胺 LOGO Yoursitehere 实验原理 LOGO Yoursitehere 聚丙烯酰胺凝胶有下列特性 凝胶透明 有弹性 机械性能好 化学性能稳定 与被分离物不起化学反应 对pH和温度变化较稳定 几乎无吸附和电渗作用 样品用量少 灵敏度可达10 6g 凝胶孔径可调节 分辨率高 LOGO Yoursitehere SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS 十二烷基磺酸钠 蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中 与SDS分子按比例结合 形成带负电荷的SDS 蛋白质复合物 LOGO Yoursitehere 由于十二烷基硫酸根带负电 使各种蛋白质 SDS复合物都带上相同密度的负电荷 它的量大大超过了原蛋白质分子的电荷量 因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别 SDS与蛋白质结合后 还可引起构象改变 蛋白质 SDS复合物形成近似 雪茄烟 形的长椭圆棒 因此在进行电泳时 蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量 而与所带电荷和形状无关 因此 可以利用SDS PAGE测定蛋白质分子量 LOGO Yoursitehere 凝胶系统的分类 连续性凝胶电泳 不连续凝胶电泳 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同 带电颗粒在电场作用下 主要靠电荷和分子筛效应 不连续系统中由于缓冲液离子成分 pH 凝胶浓度及电位梯度的不连续性 带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应 分子筛效应 还具有浓缩效应 LOGO Yoursitehere 实验原理 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应 浓缩效应电荷效应分子筛效应 LOGO Yoursitehere 浓缩效应 不连续体系由电极缓冲液 浓缩胶及分离胶组成 浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶 凝胶缓冲液为pH6 8的Tris HC1 分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶 凝胶缓冲液为pH8 8的Tris HC1 电极缓冲液是pH8 3的Tris 甘氨酸缓冲液 LOGO Yoursitehere 浓缩效应 1 凝胶孔径的不连续性 浓缩胶的凝胶浓度较小 孔径较大 把较稀的样品加在浓缩胶上 样品的移动速度较快 最终使样品 堆积 在浓缩胶和分离胶之间而被浓缩至一个狭窄的区带 大大提高了电泳的灵敏度 LOGO Yoursitehere 在pH6 8的凝胶缓冲体系中 前导离子或快离子 HCl 解离 Cl Cl 泳动速度最快 尾随离子 trailingion 或慢离子 CH2 NH2 COOH CH2 NH2 COO 泳动速度最慢 蛋白质 P 泳动速度介于快慢离子之间 电泳时 Cl 超过P走在最前面 其后形成一个离子浓度较低的低电导区 较高电位梯度 P和慢离子加速移动 P压缩成层 mcl cl mp p mG G Cl代表氯离子 P代表蛋白质 G代表甘氨酸根离子 有效迁移率 m m为迁移率 为解离度 当进入pH8 8的分离胶时甘氨酸解离度增加 其有效迁移率超过蛋白质时 不再形成高电压 浓缩效应 2 缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 LOGO Yoursitehere 实验原理 考马斯亮蓝是一种染料 和蛋白质结合呈蓝色 G250用来测定蛋白质含量 R250用来对电泳条带染色 LOGO Yoursitehere SDS PAGE LOGO Yoursitehere 实验方法 分离胶的制备 浓缩胶的制备 加样 待分离样品的准备 电泳 染色 脱色 LOGO Yoursitehere 分离胶的制备 置小烧杯中 混匀 迅速用移液器滴入二块玻璃板之间 短玻璃朝外 凝胶加至横板的2 3 用滴管加少许水 在室温中聚合20 30分钟 注意 acr bis有神经毒 制胶时避免产生气泡 LOGO Yoursitehere 浓缩胶的制备 将分离胶上层的水倒去 并用滤纸擦干置小烧杯中 混匀 迅速加入配制好的浓缩胶溶液至接近短玻璃的顶端 插入加样梳 聚合30分钟 LOGO Yoursitehere 加样 样品制备 取大肠杆菌培养物1ml 6000rpm离心5分钟 弃上清 用100ul蒸馏水重悬 加25ulloadingbuffer沸水煮沸5分钟 10000rpm离心5min 聚合后 将凝胶板取出 置于电泳槽中 短玻璃朝内 加入电泳缓冲液 小心拔去加样梳 用微量进样器吸取10ul样品 加入凝胶的每个凹槽中 注意 加样前先倒入电泳缓冲液 没过短玻璃 上样时不要扎破加样孔 也要避免样品溢出 LOGO Yoursitehere 电泳 在电泳槽中注入Tris 甘氨酸缓冲液 样品端接负极 短玻璃的一边 电压控制在180V 电泳约1 1 5小时 溴酚蓝距离分离胶底端1cm LOGO Yoursitehere 染色和脱色 染色 电泳结束后 撬开玻璃板 将凝胶板做好标记后放在大培养皿内 加入染色液 染色30min 脱色 染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次 再用脱色液脱色20min 更换脱色液过夜 剥胶时要小心 保持胶