剩余物课题研究报告111.doc

结论研 究 报 告森林采伐剩余物资源化利用技术及设备的研究王振宇 包怡红 赵垦田 赵玉红 藤继明 程翠林赵海田 张智 刘荣 李德海 焦岩 樊梓鸾 2007年6月76- -目录 目录1 绪论11.1 课题背景11.2 木质纤维素原料的预处理11.2.1 物理方法21.2.2 化学方法21.2.3 生物法21.3 木质纤维素原料转化燃料酒精的菌种选育31.3.1 高产纤维素酶复合菌的构建31.3.2 发酵木糖生产酒精的菌种选育31.4 木质纤维素原料转化酒精的固态发酵41.5 木质纤维素原料转化酒精的发展现状及趋势51.6 本课题的研究目标61.6.1 研究内容62 木质纤维素原料预处理工艺研究82.1 试验材料82.1.1 主要材料与试剂82.1.2 主要仪器及设备82.2 试验方法92.2.1 木质纤维素原料组分的测定92.2.2 纤维素酶液的配制92.2.3 酸预处理92.2.4 碱预处理102.2.5 微体化预处理102.2.6 超低温微体化预处理102.3 试验结果与讨论102.3.1 木质纤维素成份分析102.3.2 酸预处理对木纤维素酶降解率的影响112.3.3 碱预处理对木纤维素酶解率的影响112.3.4 微体化与超低温微体化预处理对木纤维素酶降解的影响122.3.5 几种预处理方式的比较132.4 结论143 纤维素酶高产菌株的选育163.1 试验材料163.1.1 供试菌种163.1.2 培养基及配制163.1.3 主要试剂173.1.4 主要仪器及设备173.2 试验方法183.2.1 还原糖的测定3，5-二硝基水杨酸比色法183.2.2 纤维素酶活力的测定183.2.3 孢子数的测定193.2.4 粗酶液提取193.2.5 透明圈法鉴定纤维素酶产生菌193.2.6 固体发酵法鉴定纤维素酶产生菌203.2.7 菌种间拮抗作用测试203.2.8 二元混菌体系构建203.2.9 菌种配比对产酶的影响203.3 结果与讨论203.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制及回归方程的确定203.3.2 纤维素酶活力的测定213.3.3 透明圈法鉴定纤维素酶产生菌213.3.4 固体发酵法鉴定纤维素酶产生菌213.3.5 菌种间拮抗关系测试223.3.6 纤维素酶高产菌株的组建233.3.7 菌种配比对产酶的影响233.4 结论244 固态发酵生物反应最佳过程控制参数确定254.1 试验材料254.1.1 菌种254.1.2 培养基254.1.3 主要试剂254.1.4 主要仪器及设备254.2 试验方法264.2.1 传代培养264.2.2 种子扩大培养264.2.3 液体发酵剂的制备264.2.4 接种264.3 结果与讨论264.3.1 温度、湿度、pH值及搅拌时间间隔的确定264.3.2 底物初始含水量，接种量，颗粒度的确定294.4 结论315 固态发酵模式对糖转化率的影响325.1 发酵培养基灭菌模式研究325.1.1 高温高压灭菌325.1.2 超声波灭菌325.1.3 臭氧灭菌325.1.4 微波灭菌325.1.5 几种灭菌方式的比较325.2 搅拌模式确定335.2.1 搅拌模式对基质混合效果的影响335.2.2 搅拌模式对传热的影响345.2.3 搅拌模式对固态发酵糖转化率的影响365.3 反应釜模式对固态发酵的影响375.3.1 反应釜几何形状对固态发酵的影响375.3.2 反应釜容积确定405.3.3 通气模式对固态发酵糖转化率的影响405.3.4 通气面积与通气孔孔径设置对固态发酵糖转化率的影响415.4 结论446 最佳反应模式下纤维素固态发酵动力学模型的建立456.1 最佳固态发酵模式动力学模型的建立456.1.1 最佳固态发酵模式不同反应时间的反应物及产物含量测定456.1.2 建立最佳反应模式动力学模型466.2 浅盘固态发酵模式动力学模型的建立476.2.1 浅盘固态发酵模式不同反应时间的反应物及产物含量测定476.2.2 浅盘固态发酵反应模式动力学模型的建立486.3 最佳反应模式与浅盘模式动力学模型的比较496.4 结论507 高产乙醇酵母菌株的诱变选育517.1 试验材料517.1.1 供试菌种517.1.2 培养基及配制517.2 试验方法527.2.1 产乙醇能力强的出发菌株的筛选527.2.2 紫外诱变527.2.3 酵母菌一级筛选TTC法537.2.4 酵母菌二级筛选杜氏小管法537.2.5 酵母菌的三级筛选CO2失重法537.2.6 糖浓度对乙醇产率的影响537.2.7 诱变菌株的遗传稳定性试验547.2.8 分析测定方法547.3 结果与讨论557.3.1 产乙醇能力强的出发菌株的筛选557.3.2 诱变剂量的选择567.3.3 酵母菌一级筛选TTC法577.3.4 酵母菌二级筛选杜氏小管法577.3.5 酵母菌三级筛选CO2失重法597.3.6 糖浓度对乙醇产率的影响597.3.7 诱变菌株UV2的遗传稳定性试验597.4 结论608 同步糖化发酵纤维素转化乙醇最佳工艺参数确定618.1 试验材料618.1.1 供试菌种618.1.2 培养基及配制618.2 试验方法628.2.1 发酵温度对SSF产乙醇的影响628.2.2 纤维素酶用量对SSF产乙醇的影响628.2.3 菌株接种量对SSF产乙醇的影响628.2.4 发酵时间对SSF产乙醇的影响628.2.5 SSF发酵试验628.3 结果与讨论628.3.1 发酵温度对SSF产乙醇的影响628.3.2 纤维素酶用量对SSF产乙醇的影响638.3.3 菌株接种量对SSF产乙醇的影响648.3.4 发酵时间对SSF产乙醇的影响648.3.5 SSF发酵试验658.4 结论669泡沫分离法提取发酵液单细胞蛋白工艺研究. 679.1 实验材料与设备. 679.1.1试验材料与试剂.689.1.2 试验设备.689.2 试验方法.689.2.1 单细胞蛋白的测定方法.689.2.2 泡沫分离法提取发酵液单细胞蛋白工艺研究.689.3 实验结果与讨论.679.3.1 蛋白标准曲线的绘制及回归方程的确定.709.3.2泡沫分离法提取发酵液单细胞蛋白结果分析.709.4 结论.73结论.74附图.75千万不要删除行尾的分节符，此行不会被打印。在目录上点右键“更新域”，然后“更新整个目录”。English Catalog 千万不要删除行尾的分节符，此行不会被打印。在目录上点右键“更新域”，然后“更新整个目录”。8 同步糖化发酵纤维素转化乙醇最佳工艺参数确定1 绪论1.1 课题背景全世界每年大约形成10002000亿t植物有机质，其中有85是纤维素物质，我国每年仅农业生产中生产形成的农作物残渣就约有1013亿t，黑龙江森工林区采伐后丢弃的枝丫有2000万t，同时工业生产中还有数百万吨的纤维素废弃物，其中除很小的一部分被直接还原自然和用作动物饲料外，绝大部分都被焚烧掉，这样不但污染环境，又造成资源的巨大浪费。这类纤维物质主要由纤维素、半纤维素和木质素三大部分构成。目前上述纤雄废弃物，除少部分用于糠醛、木糖、食用菌等产品的生产外，大部分未得到合理的利用。因此，从可持续发展战略的角度考虑，合理开发利用植物纤维素资源已是刻不容缓、势在必行。通过本项研究，发展替代资源，通过植物纤维素的开发利用，在能源、生产资料、生产工艺等方面摆脱传统的产业模式，促进现代工业、农业和生态工程的发展。获得新的食品、药品、保健品、生物制品、农副产品、环保材料和工业制品的原料资源。用植物纤维素可以制成保水剂、土壤改良剂和超吸收聚合物等等，可以用于荒漠化、沙化和盐碱化治理，从根本上改变土壤的理化性质，使脆弱的生态环境得到重建。随着经济的飞速发展，地球上的石油、煤炭储量正以惊人的速度减小，这种局面如不改变，人类将面临一场严峻的能源危机。 本项目采用超微粉碎结合微生物降解对采伐剩余物进行预处理，使植物纤维素及木质素充分解链，同时用筛选出的组合菌对降解产物进行固态发酵，并用蒸馏配合汽膜分离技术分离纯化乙醇，同时用超速离心配合泡沫分离技术分离纯化单细胞蛋白及超吸收聚合物。研制出使森林采伐剩余物资源化的固态发酵生物反应器，采用全新的蜂窝脉动式固态发酵技术，使植物纤维素及木质素的转化率大为提高，为充分开发利用森林采伐剩余物开辟了一个新的途径。该项技术的突破将在发展替代资源、合成环境友好材料以及缓解能源危机等方面起到十分重要的作用。1.可以提高纤维素的利用途径，通过植物纤维素的开发利用，在能源、生产资料、生产工艺等方面摆脱传统的产业模式，促进现代工业、农业和生态工程的发展。获得新的食品、药品、保健品、生物制品、农副产品、环保材料和工业制品的原料资源。2.用植物纤维素可以制成保水剂、土壤改良剂和超吸收聚合物等等，可以用于荒漠化、沙化和盐碱化治理，从根本上改变土壤的理化性质，使脆弱的生态环境得到从建。3.利用植物纤维素这种可再生资源生产乙醇和烯烃类化合物，进一步替代石油、煤炭等一次性资源，对于缓解未采面临的能源危机，确保经济的可持续发展具有重要意义。1.2 木质纤维素原料的预处理预处理的目的是改变天然纤维素的结构，破坏纤维素木质素半纤维素之间的连接，降低纤维素的结晶度，脱去木质素，增加原料的疏松性以增加纤维素酶系与纤维素的有效接触，从而提高酶效率。人们探讨了多种预处理方法，大致可分为物理法、化学法、生物法。1.2.1 物理方法微粉碎处理是用球磨或碾磨将纤维素类物质粉碎，促进糖化；同时，经过粉碎的纤维素粉末没有膨润性，体积小，可以提高基质浓度，得到高浓度的糖化液。微波是指300MHz300KMHz范围的电磁波，微波处理时间短、操作简单、糖化效果好，但由于处理费用高而难以得到工业化应用。蒸汽爆碎预处理是近年来发展起来的一种新的预处理方法，用高温高压下的饱和水蒸气使木质素的-丙烯乙醚及部分的-丙烯乙醚裂开，破坏木质素、半纤维素结合层，然后突然将压力降至常压，这样纤维素的空隙增大。蒸汽爆碎预处理工艺的费用较低，效果明显；但此处理过程中木质素未被除去，虽然较高的基质浓度也只能得到低浓度的糖液。高能辐射(射线、电子辐射等)可使纤维素物质的聚合度(DP)降低，结晶性减少，吸湿性增加，这些都有力于纤维素的酶水解。Saeman等1952年报道，辐射剂量大于106rad就能提高纤维物料的水解速度和转化率。当辐射剂量达108rad时，水解处于最佳状态，此时糖的得率是对照的3倍，而水解速度则提高了17倍。但是辐射处理的成本达每吨138156美元，比研磨成本还高，目前还很难用于大规模生产。Bykov和Frolov1961年指出，纤维素在水悬浮液中反复冷冻和融化(降至-75)可以降低DP水平和增加反应活性。Noriinsho1980年的专利概述了冻结法在减少颗粒大小和改变其结晶方面的作用。1.2.2 化学方法稀酸水解已经成功地用于木质纤维素原料预处理，稀硫酸预处理可以获得较高的得率，显著促进纤维素水解。但酸处理污染环境，对设备条件要求高。碱处理有较强的脱木质素作用，原料除去木质素后，酶水解糖化率将明显提高。臭氧法可以用来分解木质纤维素原料中的木质素和半纤维素。该方法中木质素受到很大程度的降解，但由于需要的臭氧量比较大，整个过程成本较高。1.2.3 生物法虽然有许多种微生物能产生木质素分解酶，但活性低，一时难以得到利用。木腐菌是分解木质素能力较强的菌，通常分为三种：白腐菌、褐腐菌、软腐菌，而以白腐菌分解木质素的能力较强。瑞典等北欧国家则利用无纤维素酶的担子菌突变株对纤维素材料进行脱木素处理，取得了显著的效果。微生物处理方法具有节约化工原料、能源和减轻环境污染等方面的优点，但微生物处理方法的一个最大缺点是处理周期长，而且许多白腐真菌在分解木质素的同时也消耗部分纤维素。采用基因工程技术对白腐菌进行遗传改良，将有助于拓展生物法预处理的实际应用。1.3 木质纤维素原料转化燃料酒精的菌种选育1.3.1 高产纤维素酶复合菌的构建复合微生物群是由两种或两种以上的微生物共同培养、相互作用、相互影响，最终达到发挥其最大群体优势的微生态系统。采用混菌培养有可能获得新型的或优质的发酵产品，混菌培养有时比单菌培养反应更快，产率更高，微生物性能更稳定，所获得的产品往往具有特殊的风味，且在防治杂菌污染方面很占优势。在这样的混合体系中，正常的微生物菌群往往是优势菌群，杂菌基本上没有生存空间，但是混菌培养的反应机制较复杂，许多产品中微生物混合发酵的机理有待阐明。崔宗均，朴哲等以高温堆肥为原料，从中分离、构建了一个具有高效分解天然纤维素能力的复合系MC1，MC1最适的产酶温度为5060，在pH59的范围内均可产生较高的酶活，在中性酸碱度、55条件下，3天可以把培养基重量0.5%的滤纸完全分解，MC1高效的纤维素分解能力在2年以上连续传代的情况下仍保持很好，高效纤维素分解复合系MC1把天然纤维素分解的过程在试验室条件人工再现。所以，具有纤维素分解能力的复合系的研究是今后纤维素微生物分解研究的方向，具有光明的前途。在诸多报道中，丝状真菌是研究最多的纤维素降解类群，其在降解纤维素底物时，菌丝穿过次生壁进入胞腔，由内向外降解纤维素，使纤维逐步被破坏。而细菌则是粘附在纤维上，从纤维的表面向内生长，在接触点处纤维素被降解，使纤维表面呈锯齿蚀痕。木霉属(Trichoderma)是目前研究最多的纤维素降解菌，其中最重要的是里氏木霉(T. reesei)。但里氏木霉菌株的不足之处是尽管它们能产生高活力的C1酶和CX酶，但形成纤维二糖酶的能力较低。而许多曲霉属菌种，如黑曲霉(Aspergillus niger)，海藻曲霉(A. Phoenicis)等，能产生高活力的纤维二糖酶。另据报道，由日本筛选出的棘抱曲霉(A. aculealus)No.F-50，能产生较好的纤维素酶系，其粗酶液对纸浆有很强的协同降解能力，而且纤维二糖酶活力和半纤维素酶活力均较高。为了使维素酶系对纤维素材料的协同作用效率提高，可通过不同菌种的混合发酵，达到较大的纤维素酶解率。1.3.2 发酵木糖生产酒精的菌种选育在秸秆纤维的糖化液中30%为戊糖(以木糖为主)，70%为己糖(以葡萄糖为主)，这些糖类是燃料乙醇产生的直接物质。但20世纪80年代以前人们认为木糖(戊糖)不能被酵母发酵，造成糖化液中30%的戊糖成分不能被利用，直接导致燃料乙醇的产率低。直到1980年Wang等提出木糖可以被一些微生物发酵生成乙醇后，国际上掀起了一股木糖乙醇发酵菌株的研究热潮，迄今已发现100多种微生物可代谢木糖生成乙醇，包括细菌、丝状真菌和酵母。其中酵母菌发酵木糖能力最强，目前人们研究最多的最具有工业应用前景的发酵木糖产乙醇的微生物有三种酵母菌即嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)和休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)。但是这些菌株的乙醇耐受能力差，发酵过程中控氧条件严格，同时也只能在常温条件下进行发酵，这就影响其工业应用。提高酿酒酵母发酵生产乙醇效率的方法有二：一是探索新的发酵工艺；二是选育高产的乙醇酵母。如果能够运用一定的方法，使酵母菌能在高温条件下正常的生长发酵，且耐受乙醇的能力强，并具有高效的转化戊糖和己糖生成乙醇等优良性能，这样的菌株无疑对乙醇发酵工业有着非常重要的社会与经济意义。诱变育种是指利用物理或化学诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，显著提高变异的频率，使人们可以简便、快速地筛选出各种类型的突变菌株，作生产和研究之用37。新的微生物菌种决定着微生物代谢产品，但菌种的生产能力高低，则决定着微生物产品的开发和生产前景，因此，微生物的诱变育种是及其重要的环节。1.4 木质纤维素原料转化酒精的固态发酵固态发酵(Solid State Fermentation，SSF)一词，广义上讲，是指一切使用不溶性固体基质来培养微生物的工艺过程，包括将固体悬浮在液体中的深层发酵，也包括在没有(或几乎没有)游离水的湿固体材料上培养微生物的工艺过程。在多数情况下是指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水不溶性固态基质中，用一种或多种微生物发酵的一个生物反应过程1。本课题中所提到的固态发酵均是指后者。现代发酵工业是当代生物技术产业中以工业化方式生产的主体部分，其发酵技术水平是一个国家生物技术产业发展水平的重要标志之一。众所周知，微生物发酵方法有两类:液体深层发酵与固态发酵。1945年青霉素的大规模工业化生产开创了液体深层发酵技术及现代发酵工业4，发酵工程与生化工程也由此应运而生。固态发酵有着悠久的历史，早在几千年前，我国就已经利用这项技术酿酒和制造各种调味品。只因固态发酵技术至今未达到纯种培养与大规模产业化要求，使固态发酵的生产应用处于停滞状态，一直被隔离在现代发酵工业的大门之外，作为传统与落后的代表而被忽视。当液态发酵与固态发酵具有相同的经济性能时，液态发酵的许多特征使其成为较优选的方法。重要的是，液态发酵的传热、传质均匀性使其有较大程度的可行性。固态发酵含有不溶于水的固体、少量的水分及空气，微生物生成的热导致水分蒸发，使发酵体系具有气液固不均匀三相，存在严重的浓度梯度及传热、传质困难，这样很难控制pH、水活度、最佳反应温度等，使产量大大下降。然而近几年，由于能源危机与环境问题的日益严重，出现了一些重大的问题，如：土壤污染及其生物治理的可能性，疯牛病的流行及寻找牲畜饲料替代品的必要性等，随着这些问题的提出，固态发酵技术以其特有的优点(如无“三废”排放)引起人们极大的兴趣。与其他培养方式相比，固态发酵具有如下优点:(1)培养基简单且来源广泛，多为便宜的天然基质或工业生产的下脚料；(2)投资少，能耗低，技术较简单；(3)产物的产率较高；(4)基质含水量低，可大大减少生物反应器的体积，不需要废水处理，环境污染较少，后处理加工方便；(5)发酵过程一般不需要严格的无菌操作；(6)通气一般可由气体扩散或间歇通风完成，不需要连续通风，空气一般也不需严格的无菌空气。同时，随着微生物基因遗传技术的应用、优良菌株的发现和筛选，以及生产工艺等方面的改进，固态发酵技术也得到了进一步发展。通过研究不同因素对于真菌代谢物的影响而显现出了固态发酵的在应用和生产方面的潜力。由此可见，固态发酵将为解决能源、环境等问题开辟一条新的途径。对固态发酵的研究也将迈上一个新的台阶。迄今为止已有许多类型的固态发酵反应器问世(包括试验室、中试、工业生产规模)。B.Lonsane曾经归纳出了九种不同形式的工业规模的固态发酵反应器:(1)转鼓式；(2)木盒式；(3)加盖盘式；(4)垂直培养盒式；(5)倾斜接种盒式；(6)浅盘式；(7)传送带式；(8)圆柱式；(9)混合型式等。K.E.Aidou也提出了十种不同形式的固态发酵反应器；但以基质的运动情况则可以分为两类:(1)静态固态发酵反应器，包括浅盘式和塔柱式反应器；(2)动态固态发酵反应器。目前静态固态发酵反应器在试验室研究中应用较为普遍，尤其是圆柱式的固态发酵反应器，文献报道的系统，多是将一个或多个静态圆柱式反应器平行放在一个恒温箱中并通以饱和空气。动态固态发酵反应器包括机械搅拌的筒，柱式、转鼓式反应器等。动态固态发酵反应器内微生物生长较快并且均一，放大过程中所遇到的困难是由于物料运动导致在生长过程中菌丝被伤害，这个问题的严重性随着发酵器容积的增大而增加。此外，在放大过程中还会存在:发酵体系湿度控制，保持不染菌，发酵基质聚集成球状而影响传质传热等诸多方面的问题。1.5 木质纤维素原料转化酒精的发展现状及趋势纤维素类资源具有来源丰富、品种多、再生时间短等优点。因此,以纤维素降解发酵生产乙醇是一个具有巨大潜力的新领域。美国政府曾规划在20012003年期间利用稻壳、甘蔗渣、生活有机垃圾、林业废物等以纤维素为主的生物质为原料,建设6个年产57.6万kL的燃料乙醇工厂。目前,日本是世界第3石油进口大国,也希望利用本国资源生产燃料乙醇,但由于其国内粮食生产不足,故对以纤维素为主的生物质废物为原料生产燃料乙醇的技术十分重视。日本每年产有1000万t废木屑,不少企业利用自行开发的技术或引进美国技术开展了以废木屑为原料生产燃料乙醇的工业试验。特别是该国的酒精协会,在借鉴美国技术基础上提出了系统的开发方案,希望快速发展燃料乙醇,减少对石油进口的依赖,同时减少CO2的排放。我国是一个石油消费大国,但是石油资源却相对贫乏。自1993年开始,我国就成了石油净进口国,国家每年都要花费大量的外汇用于换取石油,为了减少石油的进口,国家计委于2001年4月,宣布向全国推广使用车用汽油酒精。目前我国的酒精主要以玉米、小麦、薯干等粮食为原料经过发酵生产而成,而我国是一个人口大国,粮食过剩只是暂时的现象,粮食作为原料生产酒精决非长远之计。车用汽油酒精的推广必将增加粮食的供需矛盾。但我国有十分丰富的植物纤维资源,尤其是农林废弃物资源,开展利用农林废弃物生产燃料酒精的研究不仅可以解决长期以来困扰我国农林废弃物的利用问题,而且可以缓解我国的粮食和能源紧张。因此,利用植物纤维发酵生产酒精的研究,具有十分重要的现实和长远的意义。21世纪面临的能源危机困扰着世界各国。绝大多数能源界学者预计，到2050年前后，世界将面临能源的枯竭，发酵酒精和甲醇将是最现实的液体燃料替代用品。如从减少大气中温室气体浓度、防止地球气温升高的观点出发，那么发酵酒精将是除了H2和电能外，唯一能现实的汽油替代品。根据我国汽油现在的消耗水平进行理论预测,若在汽油中添加10%体积的燃料乙醇,则可替代400万吨等量的汽油,一年可为国家节省外汇15亿美元。纤维素类物质是世界上最大的可再生资源，各国都在研究其转化燃料乙醇的技术，以解决能源安全和减少环境污染，因此，纤维素类物质生产燃料酒精具有广阔的发展前景。1.6 本课题的研究目标二十一世纪人类面临资源紧缺、环境污染、生态破坏等一系列严峻的挑战。其中资源问题已经成为人类社会，特别是中国这样的发展中人口大国可持续发展的最主要瓶颈。生物乙醇是近年来最受关注的石油替代燃料之一。目前虽然粮食淀粉的生物乙醇已基本实现规模化生产。但从战略发展的视角看，世界各国都将各类植物纤维素(包括速生林木、林业采伐及加工剩余物、农作物秸秆等)作为可供使用生产燃料乙醇丰富而廉价的原料来源，其中利用木质纤维素转化燃料乙醇将是解决原料来源和降低成本的主要途径之一。随着全球经济社会的发展，特别是中国经济的快速发展，对林业生物质能源提出了新的更高的需求。大力开发和利用林业生物质能源，对于保障能源安全、改善生态环境、推动林业发展，都具有十分重要的意义。但目前纤维素酶的低活力和低产量以及选育能高效同化五、六碳糖的乙醇酵母却是生物转化纤维素的两大障碍，因此影响了其工业化生产和广泛应用。生物技术对于克服和解决这些问题具有无可替代的重要作用。开发高效转化木质纤维素类可再生资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类急需的燃料、饲料及轻工、化工、医药产品，可以推动未来经济体系的基础，从逐渐枯竭的石油资源向可再生的生物质资源转化，构建可持续发展的循环型社会，具有极其重要的意义和光明的发展前景。本课题正是针对以上几方面进行考虑，研究木质纤维素转化燃料酒精的技术路线及工艺研究。1.6.1 研究内容(1) 考察了不同预处理方法对木质纤维素原料酶水解的影响，这几种方法包括：酸处理、碱处理、微体化预处理和超低温微体化预处理等方法。其中，超低温微体化预处理木质纤维素原料的方法至今未见报道。(2) 通过透明圈法、固体发酵法及菌种拮抗关系，研究了优良稳定的五种真菌的特性，并构建了高产纤维素酶二元混菌体系，确定最优菌种配比。(3) 确定木质纤维素原料固态发酵的过程控制参数和最佳控制方式。(4) 确定反应釜的外观形状，几何尺寸，通气面积等参数，确定适合于纤维素类物质的最佳固态发酵反应模式。(5) 依据以上内容，以米氏方程为基础，建立纤维素原料固态发酵的动力学模型。(6) 采用紫外线诱变，分离、筛选、驯化培养一株高效戊糖和己糖乙醇发酵菌株。采用单因素和正交试验对同步糖化发酵条件进行优化。(7) 采用泡沫分离法对单细胞蛋白进行分离提取，研究最佳提取条件及工艺参数。(8) 所获得的超吸收聚合物的保水性进行测定。2 木质纤维素原料预处理工艺研究纤维素分子是由大量的-D葡萄糖分子以-1,4-糖苷键连接组成的链状聚合物。在天然植物纤维原料中，纤维素通常总是与半纤维素、木质素共存，形成复杂的结构。由于目前所筛选的许多高酶活的纤维素分解菌，其半纤维素酶及木质素酶活性不高，很难将天然植物纤维的三大组成成份降解。另一方面，由于天然的复杂结构，又直接影响着纤维素酶的作用。进行植物纤维原料的预处理有利于纤维素酶降解和转化，并且预处理的效果直接影响着纤维素酶水解的结果。目前预处理方法大致可分三种类型：化学法、物理法和生物法。本章主要选择酸、碱、微体化、超低温微体化四种预处理手段，比较其四种预处理方法的特点及其对木质纤维素酶水解的影响因素。2.1 试验材料2.1.1 主要材料与试剂木质纤维素粉体 来源于哈尔滨市某木材加工厂葡萄糖 分析纯 天津市东丽区天大化学试剂厂3，5-二硝基水杨酸 分析纯 上海化学试剂采购供应五联化工厂浓硫酸 分析纯 北京新光化工试剂厂丙酮 分析纯 天津市福晨化学试剂厂甲苯 分析纯 天津市福晨化学试剂厂氢氧化钠 分析纯 天津市福禄化工试剂厂甲基橙 分析纯 天津市福晨化学试剂厂无水乙醇 分析纯 北京化工厂柠檬酸钠 分析纯 天津市东丽区天大化学试剂厂柠檬酸 分析纯 天津市东丽区天大化学试剂厂十六烷基三甲基溴化铵 分析纯 上海山浦化工有限公司十二烷基硫酸钠 分析纯 天津市石英钟厂霸州市化工分厂盐酸 分析纯 天津市东丽区天大化学试剂厂2.1.2 主要仪器及设备微型植物粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司722型可见分光光度计 上海第三仪器有限公司ALC 110.4电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司101-2 A电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司GXZ型智能光照培养箱 宁波江南仪器厂马富炉 天津市中环试验电炉有限公司球磨机 ND6-2L型 南大天尊设备有限公司生产PHS-3C酸度计 上海精密科学仪器有限公司98-1-13电子控温电热套 天津市泰斯特仪器有限公司FW100高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司超声波清洗器 上海科导超声仪器有限公司2.2 试验方法2.2.1 木质纤维素原料组分的测定2.2.1.1 中性洗涤纤维NDF的测定 准确称取风干样品0.51.0克放入100毫升中性洗涤剂(3%十二烷基硫酸钠，PH=7)内煮沸12小时，冷却结束后，用100目尼龙绢纱套在玻璃漏斗上进行抽滤，滤渣转入已称重的玻璃滤锅，热水冲洗数次，真空抽滤,除去部分水份后，放入100烘箱烘干后，再在干燥器中冷却，恒重，即可求出中性洗涤纤维NDF量。2.2.1.2 酸性洗涤纤维ADF的测定 称取风干样品25克，(粉碎，通过1毫米筛孔)，于回流容器中加入100毫升酸性洗涤剂20克十六烷基三甲基烷化氨于1升1.0N浓硫酸中)510分钟内加热至沸腾，回流1小时，用套有尼龙绢纱的玻璃漏斗抽滤，转入已称量玻璃滤锅（100120目孔径)，每次用50毫升热水冲洗数次，真空抽滤，最后用丙酮洗涤12次，于100烘箱内烘干，冷却后恒重，即可求出酸性洗涤纤维ADF。2.2.1.3 酸不溶木质素的测定 将装有酸性洗涤纤维的坩埚内加入72%硫酸液浸没内容物，搅拌成糊，在15下消化3小时，真空抽干，热水多次洗涤，pH试纸检查无酸性，置坩埚于100烘箱内烘干，放在干燥器中冷却称至恒重。再将其灰化，留下的灰分为样品中硅酸含量，称酸不溶灰分，烘干沉淀量与灰化量之差为酸不溶木质素ADL。纤维索=ADF-ADL-灰分。2.2.2 纤维素酶液的配制 准确称取纤维素酶制剂0.5g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，酶液的浓度为5mg/mL，4冰箱中保存备用。2.2.3 酸预处理分别称取一定量木纤维素粉体，各加入0.5%，1%，2%，3%，4%，5%，6%的稀硫酸，固液比1:10，室温放置24小时后过滤，将滤液调pH至中性( 0.1%甲基橙为指示剂)，测定水抽提液的含糖量。将滤渣用水冲至中性，烘干以后取1.0g，加入50mL纤维素酶溶液(酶液配制:0.5g纤维素酶溶解于100mL pH4.8，0.05mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液)在50静置保温48h后煮沸灭活，测定还原糖量。2.2.4 碱预处理分别称取一定量木纤维素粉体，分别加入0.5%、1%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、4.0%的NaOH，固液比为1:25，室温放置24小时后过滤，将滤液调pH至中性( 0.1%甲基橙为指示剂)，测定水抽提液含糖量。将滤渣用水冲至中性，烘干以后取1.0g，加入50mL纤维素酶溶液(酶液配制:0.5g纤维素酶溶解于100mL pH4.8，0.05mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液)在50静置保温48h后煮沸灭活，测定还原糖量。2.2.5 微体化预处理取10g烘干的木质纤维素粉体，装入球磨机磨罐中，加入玛瑙球后调节球磨机转数为200转/分，在不同时间内进行微体化处理，然后用振动筛进行筛分至50250m。取木质纤维素微粉体1.0g，加入50mL纤维素酶溶液(酶液配制:0.5g纤维素酶溶解于100mLpH4.8，0.05mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液)在50静置保温48h后煮沸灭活，测定还原糖量。2.2.6 超低温微体化预处理取10g烘干的木质纤维素粉体，在温度为-196条件下进行超低温快速冷冻，待物料充份冷冻后，迅速取出放入球磨机磨罐中，加入玛瑙球后调节球磨机转数为200转/分进行研磨1h，在不同的时间内进行如此冻磨处理。从预处理后的物料中取1.0g，加入50mL纤维素酶溶液(酶液配制：0.5g纤维素酶溶解于100mL pH4.8，0.05mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液)在50静置保温48h后煮沸灭活，测定还原糖量。预处理的转化率（%） （2-1） 式中 S预处理本身产生的还原糖量(g) M预处理物干重(g)C木质纤维质原料含量酶解糖化率(%) （2-2）式中 S酶解液中还原糖量(g)M预处理物千重(g)C木质纤维质原料含量2.3 试验结果与讨论2.3.1 木质纤维素成份分析表3-1 木质纤维素成份表水分%半纤维素%纤维素%木质素%灰分%可溶物%4.1625.144.716.65.653.832.3.2 酸预处理对木纤维素酶降解率的影响图3-1 不同H2SO4质量分数预处理由图3-1可知，在酶解之前，硫酸预处理时过程中会有相当的一部分还原糖产生，但浓度不高，对于不同浓度的硫酸预处理木纤维素得到的还原糖量变化不显著。这是因为水提液中的糖多为半纤维素水解下来的木糖和阿拉伯糖，由于固液比是一样的，所以半纤维素水解下来的糖量差别不大；预处理后的酶解获得的还原糖在硫酸浓度为0.52%之间出现了上升趋势，硫酸浓度超过2%之后酶解还原糖曲线又趋于平稳，由于酸的浓度影响预处理过程中木质素结构破坏的程度，所以导致了酶解液中糖量的不同。预处理得到的还原糖和酶解得到的还原糖总和为总糖转化率，变化趋势和前两者基本相同。总体来讲，酸浓度在2%4%之间总变化不明显。所用酸浓度越高，对设备要求越高，成本也越高，所以综合以上分析，H2SO4预处理的最佳条件为2.0% H2SO4，预处理糖转化率为4.68%，预处理后酶解糖转化率为6.8%，总糖转化率为11.46%。2.3.3 碱预处理对木纤维素酶解率的影响从图3-2可以看出，碱预处理木纤维素过程中水提液得还原糖量随NaOH浓度变化而逐渐上升，当NaOH浓度为4%时，水提液中糖转化率为3.52%，依然很低。在预处理后的酶解过程中，由于NaOH浓度较低，木质素脱除的效果不明显，所以导致了半纤维素不容易水解。但其可促使木质素分解，破坏其与纤维素之间的联系，纤维素和半纤维素结合位点充分暴露出来，更易于与纤维素酶作用，因而酶解得到的糖量较多。就酶解液而言，在0.5%1.0%之间产糖量呈上升趋势，而在1.0%2%之间逐渐减小，说明了碱浓度的变化对于纤维素结晶度的变化有比较大的影响。总来说，以1.0%NaOH预处理为试验的最佳条件，总糖转化率为21.42%。图3-2 不同NaOH质量分数预处理2.3.4 微体化与超低温微体化预处理对木纤维素酶降解的影响2.3.4.1 不同处理时间对木质纤维素的影响 取一定量的经过不同时间内经过微体化处理和超低温微体化预处理的原料中分别取1.0g，加入50mL纤维素酶溶液(酶液配制：0.5g纤维素酶溶解于100mL pH4.8，0.05mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液)在50静置保温48h后煮沸灭活。测定还原糖量。结果如图3-3所示，超低温微体化预处理在不同时间内酶解糖化率明显高于未经过超低温微体化预处理的木质纤维素的糖化率。所以微提化处理与超低温处理相结合是一种比较有效的预处理方法。图3-3 不同预处理时间对木质纤维素糖化率的影响2.3.4.2 颗粒度对木质纤维素粉体糖化率的影响 经过微体化处理和超低温微体化预处理10h后的木质纤维素，经振动筛（60300目）进行筛分处理，分别得到颗粒度为50250m的粉体物料，各取一定量的物料在上述条件下进行酶解糖化。结果表明，超低温微体化预处理在不同颗粒度时酶降解糖化率明显高于未经过超低温处理的木质纤维素糖化率。图3-4 不同颗粒度对桦木纤维素糖化率的影响通过图3-4可以得知，微体化预处理底物酶解效率随处理时间的增加其糖化率提高，酶解反应10小时，糖化率可达20.28%。超低温微体化预处理底物酶解效率趋势和微体化预处理趋势相同，其糖化率高达31.78%。但两种预方法处理时间超过10小时以后酶解增加缓慢；预处理底物颗粒度大小对糖化率有较大影响，随着颗粒度的减小而提高，但颗粒度小于100m（160目大小）时糖转化率反而降低，首先，这是由于随着粉碎处理次数的增加，木质纤维素颗粒之间由于受到强烈剪切力和摩擦力的作用使得其中的多糖部分被糊化，不能被纤维素酶有效利用；另一个原因是由于颗粒度减小到一定程度增加了酶反应的空间位阻，使酶解效率降低。在相同预处理时间和颗粒度条件下超低温微体化预处理底物酶解效率明显高于普通微体化预处理，这可能是由于超低温冷冻后，增加了底物的机械强度，使桦木纤维的晶体结构及纤维素、半纤维素、和木质素之间联结的化学键在预处理过程中比较容易遭到破坏，增加了与酶反应的结合位点，酶解得糖率提高。超低温微体化预处理是一种比较有效的预处理方法，在本试验条件下，超低温微体化预处理后，酶降解条件为pH值4.8，温度45，酶用量为20IU/mg时，产生还原糖量为243.67mg/g底物，酶降解糖转化率可达31.78%。2.3.5 几种预处理方式的比较根据各种不同预处理方式最终糖转化率比较，得到结果如表3-2所示表3-2不同预处理方式酶解转化率的比较 糖转化率（%）未处理酸预处理碱预处理微体化预处理超低温微体化预处理预处理得糖率0.04.681.420.00.0酶解糖转化率3.296.5820.020.2831.78总糖转化率3.2911.2621.4220.2831.78图3-5 不同预处理方式的糖转化率比较从图3-5可知，未处理的木纤维素由于结晶度较高，酶与底物结合不充分，酶解效率较低，还原糖转化率仅为3.29%；酸处理木纤维素时，会产生一定量的还原糖，还原糖转化率为4.68%，预处理后酶解还原糖转化率为6.58%，总糖转化率为11.26%；碱预处理木纤维素还原糖转化率比较低，仅为1.42%，而酶解还原糖转化率较高为20%，因为碱预处理会溶解一部分木质素，减小木质素的阻碍作用，使木质纤维素结晶度降低，酶解还原糖产率升高；微体化和超低温微体化预处理使均未产生还原糖，而经过纤维素酶降解后，经过超低温微体化预处理得木纤维素酶解还原糖转化率最高，可达31.78%。在这四种预处理方法中还原糖转化率最高，说明超低温微体化预处理木纤维素的方法是一种有效的预处理方法。2.4 结论本章主要介绍了以下几种方法在木纤维素预处理方面的应用并得到以下结论：酸预处理法：由于半纤维素主要成分是戊聚糖、已聚糖，不溶于水而溶于稀酸，因此在酸水解中半纤维素能被大部分水解为还原糖，但是由于木质素不溶于酸，纤维素仍被木质素所包埋，其对木质素与纤维素的结合层破坏不够，纤维素晶体机构没有被充分破坏，因此不利于进一步的酶水解。碱处理法：由于木质素可溶解于碱液，破坏其与纤维素结合的紧密结构；脱去木质素后，木质纤维素中的半纤维素和纤维素比较容易被纤维素酶降解，因此酶解过程中碱处理的纤维质转化率要比酸处理高，但碱处理对半纤维素的降解能力低，所以总的纤维质转化率并不是很高。对预木质纤维的预处理方面的研究，国内外已有很多报道，方法也很多，但都有各自的不足之处。本项研究首次采用超低温微体化预处理法对木纤维素进行处理，此种预处理方法在国内外未见报道。由于超低温条件下，增加了底物的机械强度，使桦木纤维的晶体结构及纤维素、半纤维素、和木质素之间联结的化学键在预处理过程中比较容易遭到破坏，纤维素更容易被释放出来；超低温微体化预处理后，物料颗粒度减小，表面积增大，增加了与酶反应的结合位点，酶解得糖率提高。通过对不同预处理方法的研究，超低温微体化预处理法是一种有效的预处理木纤维素的方法，经此法处理后的原料酶降解糖化率均高于酸、碱和微体化等预处理法。经超低温微体化预处理10小时得到的100m大小的木纤维素粉体，加入50mL纤维素酶溶液(酶液配制：0.5g纤维素酶溶解于100mL pH4.8，0.05mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液)在50条件下，静置保温48h，酶降解糖转化率至少可达31.78%。此法为木质纤维素酶解前的预处理提供了一种新的有效途径。3 纤维素酶高产菌株的选育纤维素是地球上最庞大的可再生资源。利用微生物所产生的纤维素酶可以有效降解纤维素。纤维素酶(cellulase)指的是降解纤维素的一类酶的