Illumina平台测序原理及常见测序文库构建.ppt

Illumina平台测序原理及常见几种测序文库构建流程简介 目录 第一部分 测序测序原理与流程简介 文库构建 6hrs cBotHiSeq2500MiSeq HiSeq2000HiSeq2500GAIIxMiSeq HCS RTAICSMSRCASAVABaseSpace 1 8samples 1 8samples DNA Illumina测序流程 文库构建 6hrs cBotHiSeq25001 8samplesMiSeqHiSeq2000HiSeq25001 8samplesGAIIxMiSeqHCS RTAICSMSRCASAVABaseSpace DNA 文库构建流程 片段化DNA末端补平3 加A接头连接PCR 高质量DNA文库结构 文库构建的目的是在目的DNA片段两端都连接上想要的接头 此单链部分与FlowCell表面上P7接头相同 此单链部分与FlowCell表面上P5接头相同 IndexSequencingPrimer 文库构建 6hrs cBotHiSeq2500MiSeq 1 8samples HiSeq2000HiSeq25001 8samplesGAIIxMiSeqHCS RTAICSMSRCASAVABaseSpace 测序芯片 FlowCell 简介 flowcell是有2个或8个泳道 Lane 的玻璃片 与一元硬币的厚度相当 每个泳道 Lane 内的上下两个表面随机的布满了能够与文库两端接头分别互补配对的寡核苷酸 oligos P7和P5接头 在flowcell上进行cluster簇生成 仪器简介 单条DNA模板 约1000条DNA模板的拷贝 cBot HiSeqSequen ncceerr 35个循环的桥式PCR cBot工作流程 DNA文库变性 使用NaOH将双链DNA文库变性为单链模板链杂交 将单链DNA模板杂交到FlowCell上第一链合成 以FlowCell表面上的oligos为引物 合成第一链 桥式PCR 冲走单链DNA模板 以合成的第一链为模板进行35循环的桥式PCR 线性化 将与P5接头连接的DNA链从FlowCell上去除 阻断3 OH 防止在后续测序过程中继续延伸DNA链 杂交测序引物 DNA模板杂交和一链合成 接头序列 5 3 延伸 含有P7和P5两种接头的FlowCell表面 单链DNA分子与FlowCell表面的对应接头杂交以杂交的单链DNA为模板 FlowCell上的接头为引物 合成第一链 新合成的链 原始模板链 双链DNA变性 丢弃原始模板链 模板链被冲洗走 新合成的链留在FlowCell上 桥式PCR扩增 单链DNA与FlowCell表面对应接头杂交 形成 桥 以接头为引物进行扩增 桥式PCR扩增 变性 变性双链的 桥 得到与FlowCell相连的两条互补的单链DNA分子 第二轮桥式PCR扩增 完成桥式PCR扩增 完成28循环的桥式PCR 线性化 双链 桥 变性为单链 红色箭头为P5接头上的切割位点 线性化 切割并冲走与P5接头相连的那条DNA链 阻断 阻断3 OH 杂交Read1引物 Read1测序引物 将测序引物杂交到文库的接头上 Illumina测序流程 HiSeq2000HiSeq2500GAIIxMiSeq HCS RTAICSMSRCASAVABaseSpace 文库构建 6hrs cBotHiSeq25001 8samplesMiSeq 1 8samples 进行Read1测序杂交Index测序引物 进行Index测序PairedEndTurnround 合成Read1互补链杂交Read2测序引物 进行Read2测序 HiSeqSBS测序流程 HiSeqSBS测序流程 1 2 3 PairedEndTurnaround SequencingBySynthesis SBS测序原理 4种Fl NTP s 聚合酶 拍照 收集信号 去阻断 切除荧光基团 X36 151 可逆终止化学反应 一次加入4种修饰的dNTP 可逆终止子 准确度高可以得到同聚物序列 合成照相 收集信号去阻断 切除荧光基团 下一个碱基合成 100Microns Clusters 已完成测序合成的片段 Blocked3 ends 变性掉已完成测序合成的片段 恢复被阻断的3 OH PairedEndTurnround 形成的桥 5 3 延伸 桥式PCR 5 3 延伸 PairedEndTurnround 形成的双链的桥 PairedEndTurnround 模板链 PairedEndTurnround 等温变性 完成15轮桥式PCR后 进行线性化 将模板链切除 保留新合成的子链 新合成的链 3 OH阻断 Read2测序引物 PairedEndTurnround 线性化 3 OH阻断 杂交Read2测序引物 SequencingBySynthesis2ndRead X36 151 4种Fl NTP s 聚合酶 拍照 收集信号 去阻断 切除荧光基团 Illumina测序流程 HCS RTAICSMSRCASAVABaseSpace 文库构建 6hrs cBotHiSeq25001 8samplesMiSeqHiSeq2000HiSeq25001 8samplesGAIIxMiSeq 第二部分 常见文库构建流程简介 文库分类 DNA类文库DNA小片段文库DNA大片段文库Exon文库PCR Free文库简化基因组文库 单细胞样本文库等 RNA类文库转录组文库表达谱 RNA Seq SmallRNA DNA小片段文库 DNA小片段文库片段大小在1Kb以下的普通DNA文库 200bp 350bp 500bp DNA小片段文库可用来进行人重测序 动植物 微生物的denovo和重测序 16srRNA测序 宏基因组测序等项目类型的文库构建 DNA小片段建库流程 DNA小片段建库流程 DNA小片段建库流程 DNA小片段建库流程 DNA大片段文库 DNA大片段文库 又名末端配对 mate paired 文库片段长度大于1Kbp 主要用于动植物 微生物的denovo测序 DNA大片段文库建库流程 DNA大片段文库建库流程 为什么要建大片段文库 Exon文库 人类外显子组总共约30Mb 占全部人类基因组约1 外显子具有高度的保守型 且大部分疾病的致病位点位于外显子区 外显子测序是指利用序列捕获技术将外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法 Exon文库主要用于人全外显子测序和目标区域测序 Exon文库流程 外显子捕获方式 液相杂交液相杂交是通过在溶液中 利用链碱基配对的原理 将DNA片段与探针杂交 然后洗脱 富集目的片段 Exon测序特点 优点 1 与全基因组测序相比 外显子测序具有测序覆盖度更深 数据准确性更高 花费成本更低等优势 对研究已知基因的SNP Indel等具有较大的优势 不足 1 与全基因组测序相比 不能检测到基因组内较大的结构性变异 2 与转录组测序相比 不能检测到新的基因 PCR Free文库 PCR Free文库 顾名思义 就是在文库构建过程中不需要进行PCR的文库 主要是针对一些特殊样本 比如GC含量高 PCR扩增困难的样本 PCR产物 不足 所需的样本起始量较多 PCR Free文库与普通文库比较 简化基因组 RAD seq 文库 RAD seq即基于酶切的简化基因组测序技术 是指利用限制性内切酶对基因组进行酶切 结合一定大小的插入片段文库 对其进行高通量测序 快速鉴定高准确性的变异标记 SNPs 信息的技术与传统技术相比 该类技术操作简单 不受参考基因组限制 可简化复杂基因组 另外 基于SNPs的分子标记技术性价比高 稳定性好 在基因组中分布更加广泛 特别是适合大样本量的分析 简化基因组文库建库流程 转录组文库 真核生物 原核生物 总RNA 利用Oligo dT 富集mRNA 去除rRNA 随机引物六聚体反转录合成cDNA 末端修复 加A 加接头后PCR扩增 Illumina测序 将mRNA随机打断成 200nt 转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有mRNA 应用 转录本的种类和基因定量基因的转录结构可变剪切发现新的转录本 链特异性转录组建库 使用ssRNA seq可以确定转录本是来自正链还是负链 以便更加准确的获得基因的结构以及基因表达信息 并且发现新的基因 很多基因组区域具有正负链的转录本 反义转录是真核基因的一个特征 是一种重要的调控方式 常规转录组建库方法基础上 在合成第二条cDNA链时 替换dTTP为dUTP 加上接头后降解含dU的DNA单链 链特异性转录组建库 均一化 DSN 建库 方法 构建常规转录组文库 库检合格后取80 100ng文库进行DSN处理 然后PCR再次出库 目的 减低高丰度表达基因 有效富集低丰度表达基因 DSN酶 双链特异性核酸酶 Duplex SpecificNuclease DSN 能够选择性降解双链DNA和DNA RNA杂交体中的DNA 由于高丰度的基因形成双链的速度较快 所以降解也比较多 RNA Seq 是用来研究某一生物对象在特定生物过程中基因表达差异的技术 具有定量准 可重复性高 检测范围宽 成本低等特点 真核生物 原核生物 总RNA 利用Oligo dT 富集mRNA 去除rRNA 随机引物六聚体反转录合成