国产多孔钽复合骨形态发生蛋白7植入兔竖脊肌内的生物相容性.doc

www.CRTER.org张辉，等. 国产多孔钽复合骨形态发生蛋白7植入兔竖脊肌内的生物相容性国产多孔钽复合骨形态发生蛋白7植入兔竖脊肌内的生物相容性张 辉1，王 茜2，陶建峰1，王爱军3，史 伟4，卞育婕2，李琪佳5，王志强4 (唐山市第二医院，1关节一科，3创伤二科，河北省唐山市 063000；华北理工大学，2基础医学院人体解剖学系，5医学中心实验室，河北省唐山市 063000； 4华北理工大学附属医院骨科，河北省唐山市 063000)引用本文：张辉，王茜，陶建峰，王爱军，史伟，卞育婕，李琪佳，王志强. 国产多孔钽复合骨形态发生蛋白7植入兔竖脊肌内的生物相容性J.中国组织工程研究，2016，20(16):2376-2383.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.16.013 ORCID: 0000-0002-2962-5069(王志强)文章快速阅读：多孔钽复合骨形态发生蛋白7的生物相容性张辉，男，1981年生，河北省唐山市人，博士，主治医师，主要从事骨移植材料，关节外科，运动医学研究。通讯作者：王志强，教授，主任医师，华北理工大学附属医院骨科，河北省唐山市 063000中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)16-02376-08稿件接受：2016-02-17http:/WWW.大体观察组织学观察扫描电镜观察硬组织切片观察骨形态发生蛋白7植入将两者复合多孔钽材料复合骨形态发生蛋白7的多孔钽具有良好生物相容性及诱导成骨作用 文题释义：骨形态发生蛋白7：又称成骨蛋白1，是骨形态发生蛋白家族中的一员，有促进软骨和骨形成的作用，能在体外促进软骨细胞的增殖和软骨细胞外基质合成，同时具备很强的异位成骨作用，可在异位诱导新骨的形成，在骨缺损修复及软骨分化过程中发挥重要作用。骨形态发生蛋白可通过促进间充质细胞向软骨细胞分化、增殖，增加基质合成等途径，修复关节软骨损伤。多孔钽：弹性模量为2.0-4.0 GPa，介于皮质骨(12-18 GPa)和松质骨(0.1-0.53 GPa)之间，置入骨骼后几乎没有应力遮挡，利于正常的生物学应力传导，可促进多孔钽和宿主骨的整合。同时多孔钽具备良好的空间三维立体结构，孔隙率可达75%-85%，平均孔径在400-600 m，利于细胞长入，可为细胞、血管、组织代谢产物及营养物质运输提供有利的空间环境。摘要背景：骨形态发生蛋白7在体内可诱导骨及软骨形成，并可诱导肌肉中和血管周围的间充质细胞分化为软骨和骨细胞，有促进软骨和骨形成的作用。目的：观察多孔钽复合骨形态发生蛋白7植入兔竖脊肌后，钽-肌肉界面纤维包膜结构、肌肉与小血管向多孔钽内生性生长及异位成骨的能力。方法：在新西兰大白兔左右两侧竖脊肌内分别植入复合骨形态发生蛋白7的多孔钽片(实验组)和多孔钽片(对照组)，植入后2，4，8周，取钽片及其周围0.5 cm肌肉组织，进行扫描电镜、苏木精-伊红染色、Masson染色及硬组织切片观察。结果与结论：苏木精-伊红染色：两组材料周围均有纤维性包膜形成，随时间延长，纤维性包膜逐渐由疏松变致密，厚度也逐渐变薄，材料与肌肉交界面无明显炎症反应。两组间纤维包膜厚度比较差异无显著性意义。扫描电镜：植入2周时，两组多孔钽表面可见少量肌肉及胶原纤维逐渐长入孔隙内部，部分胶原纤维附着于孔壁；植入8周时，多孔钽孔隙内充满了肌腱纤维，纤维与孔壁结合紧密，两组间无明显差异。硬组织切片：植入2周时，两组多孔钽孔隙均内有少量成纤维细胞及肌纤维长入，实验组材料孔隙内可见有新生小血管长入；植入8周时，两组多孔钽表面和孔隙内均长满呈条索状交Zhang Hui, M.D., Attending physician, First Department of Joint Surgery, the Second Hospital of Tangshan, Tangshan 063000, Hebei Province, ChinaCorresponding author: Wang Zhi-qiang, Professor, Chief physician, Department of Orthopaedics, Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, Hebei Province, China错排列的肌纤维，小血管及细胞成分减少，钽-肌肉紧密融合。Masson染色：植入8周时，实验组钽-肌肉界面边缘处肌肉内可见大量间充质细胞、骨胶原及软骨基质形成，以及少量新生的软骨化骨，对照组未见软骨化骨。结果表明，复合骨形态发生蛋白7的多孔钽具有良好生物相容性及诱导成骨作用。关键词：生物材料；材料相容性；多孔钽；支架；骨形态发生蛋白7；生物相容性；异位成骨 主题词：钽；骨形态发生蛋白7；组织工程基金资助：国家科技部科技支撑课题资助项目(2012BAE06B03)；河北省科技支撑资助项目(16277776D)；河北省医学科学研究重点课题计划项目(20160225)；华北理工大学大学博士科研启动基金资助项目2377ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAHBiocompatibility of domestic porous tantalum carrying bone morphogenetic protein 7 in the erector spinae muscle of rabbitsZhang Hui1, Wang Qian2, Tao Jian-feng1, Wang Ai-jun3, Shi Wei4, Bian Yu-jie2, Li Qi-jia5, Wang Zhi-qiang4 (1First Department of Joint Surgery, the Second Hospital of Tangshan, Tangshan 063000, Hebei Province, China; 2Department of Anatomy, Basic Medical College of North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, Hebei Province, China; 3Second Department of Traumatology, the Second Hospital of Tangshan, Tangshan 063000, Hebei Province, China; 4Department of Orthopaedics, Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, Hebei Province, China; 5Experimental Center of North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, Hebei Province, China)AbstractBACKGROUND: Bone morphogenetic protein 7 (BMP-7) can induce bone and cartilage formation in vivo, and induce chondrogenic and osteogenic differentiation of mesenchymal cells in muscles and around the vessels.OBJECTIVE: To observe the structure of domestic tantalum-muscle interface fibrous capsule, growth of muscle and small blood vessels into the porous tantalum and the ability of ectopic osteogenesis after implantation of porous tantalum loaded with BMP-7 into the erector spinae of rabbits.METHODS: Porous tantalum slices loaded with BMP-7 (experimental group) and porous tantalum slices (control group) were implanted into the erector spinae muscle of New Zealand white rabbits. And the porous tantalum slices with surrounding muscle tissues about 0.5 cm thick were removed at 2, 4, 8 weeks after implantation, and observed under scanning electron microscope for hematoxylin eosin staining, Masson staining and hard tissue slice observation.RESULTS AND CONCLUSION: (1) Hematoxylin-eosin staining: Fibrous capsule formation was observed around the materials in the two groups, and with the extension of time, the fibrous capsules were slightly dense, and thinned. There was no obvious inflammatory reaction in the interface between the material and the muscle. There was no significant difference between the two groups in the fibrous capsules thickness. (2) Scanning electron microscope: 2 weeks after the surgery, a small amount of collagen and muscle fibers were formed in the porous tantalum pores in the two groups, and some of collagen fibers attached to the pore walls. At 8 weeks after the surgery, all the pores of porous tantalum were full of muscle fibers that were combined with the pore wall closely. There was no significant difference between the two groups. (3) Hard tissue slices: 2 weeks after the surgery, a small amount of fibroblast cells and muscle fibers grew into the pores of porous tantalum in the two groups and new capillaries grew into the pores of porous tantalum in the experimental group. At 8 weeks after the surgery, the porous tantalum and all the pores were full of muscle fibers that were combined with the pore wall closely, the number of small blood vessels and cells decreased, and the tantalum and the muscle were fused closely. (4) Masson staining: 8 weeks after the surgery, a large number of mesenchymal cells, ossein and cartilage matrix formed in the muscle gaps and a few cartilage bone tissues were formed in the experimental group, but no cartilage was found in the control group. The study showed that porous tantalum carrying BMP-7 has good biocompatibility and osteogenic induction ability.Subject headings: Tantalum; Bone Morphogenetic Protein 7; Tissue EngineeringFunding: the Scientific Support Project of the Ministry of Science and Technology of China, No. 2012BAE06B03; the Scientific Support Project of Hebei Province, No. 16277776D; the Medical Science Research Project of Hebei Province, No. 20160225; the Doctoral Initial Fund of North China University of Science and TechnologyCite this article: Zhang H, Wang Q, Tao JF, Wang AJ, Shi W, Bian YJ, Li QJ, Wang ZQ. Biocompatibility ofdomestic porous tantalum carrying bone morphogenetic protein 7 in the erector spinae muscle of rabbits.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(16):2376-2383.3ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction多孔金属钽是一种新型的骨科植入材料，呈多重的十二面体排列，具有纵横交错、相互连通的微孔结构，这使其具有孔隙率高、弹性模量低及表面摩擦系数高等物理特性。多孔钽金属无明显生物毒性，抗腐蚀能力强，具有良好的骨传导性，是理想的骨缺损修复材料1。鉴于多孔钽材料的独特性质，其在骨及软骨组织修复方面有着显著的优势。有研究表明，具有多孔结构的植入物能促进组织向植入物内部长入，能有效增强植入物稳定性2-4。多孔钽材料具有多孔结构，表面粗糙程度高，利于组织长入，提高了材料置入后的远期稳定性，同时多孔钽材料的孔隙率达75%-85%，孔径在400-600 m，利于组织细胞的长入5。骨形态发生蛋白属于转化生长因子超家族的一个亚群，在体内可诱导骨及软骨形成，能诱导肌肉中和血管周围的间充质细胞分化为软骨和骨细胞6。骨形态发生蛋白7又称成骨蛋白1，是骨形态发生蛋白家族中的一员7，有促进软骨和骨形成的作用。骨形态发生蛋白7能在体外促进软骨细胞的增殖和软骨细胞外基质合成8，同时具备很强的异位成骨作用，可在异位诱导新骨的形成，在骨缺损修复及软骨分化过程中发挥重要作用9。有研究表明，将骨形态发生蛋白7基因重组的兔软骨细胞体外培养后植入兔关节软骨缺损模型中，发现实验组软骨缺损修复明显好于对照组10-11。骨形态发生蛋白可通过促进间充质细胞向软骨细胞分化、增殖，增加基质合成等途径，修复关节软骨损伤11。而骨形态发生蛋白的载体须具备较好的生物相容性，且对细胞的黏附和增殖有支持作用。此部分实验将多孔钽复合骨形态发生蛋白7与多孔钽分别植入兔竖脊肌，通过苏木精-伊红染色观察钽-肌肉界面纤维包膜结构，硬组织切片观察肌肉及小血管向多孔钽内生性生长，以及植入后的异位成骨能力，探讨多孔钽/骨形态发生蛋白7复合物促进软骨化骨及新骨生成能力及与宿主组织的生物相容性，为临床骨及软骨缺损修复提供实验依据。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 自身对照观察动物实验。1.2 时间及地点 实验于2013年1月至2015年10月在华北理工大学动物实验中心完成。1.3 材料 多孔钽材料由重庆润泽医疗器械有限公司提供。实验动物：6月龄健康新西兰大耳白兔18只，雌雄不拘，体质量2.5-3 kg，由华北理工大学动物实验中心提供并饲养，许可证号：Scxk (京)010-0001。多孔钽复合骨形态发生蛋白7的生物相容性实验用试剂与仪器：试剂与仪器来源重组人骨形态发生蛋白7以色列ProSpec公司S-4800扫描电镜美国Thermo公司Minimet1000 磨片机Buehler 公司，美国E-1010离子溅射装置Hitachi 公司，日本Leica1600 硬组织切片机Leica 公司德国TS100倒置相差显微镜日本Nikon公司BIO-RAD 680 伯乐酶标仪美国 BIO-RAD 公司1.4 实验方法 多孔钽/骨形态发生蛋白7复合物的制备：采用粉末浇注高温煅烧技术将钽制成直径为15 mm、高3 mm的薄片，孔径为400-600 m，孔隙率为75%-85%，弹性模量为2.8-3.2 GPa，抗拉伸强度为90-110 MPa，分别按顺序依次在蒸馏水、丙酮溶液及体积分数70%乙醇溶液中超声清洗20 min，用蒸馏水清洗，高压蒸汽灭菌后备用。将5 mg 重组人骨形态发生蛋白7溶入10 mL 6 mol/L尿素溶液中，将多孔钽材料浸入其中，4 下放置12 h，然后冰冻干燥处理，透析除水，氯仿蒸气消毒后备用12。 实验分组及干预：取18只新西兰大白兔，每只兔左右两侧竖脊肌内分别植入多孔钽/骨形态发生蛋白7复合物(实验组)和多孔钽片各2枚(对照组)。10%水合氯醛 (3 mL/kg)缓慢腹腔注射，麻醉成功后，在兔脊柱两侧术区备皮，碘伏消毒术区，铺无菌孔巾，取腰椎旁后侧入路，距离脊柱中线两侧约2 cm处作长约3 cm的对称切口，依次切开皮肤、皮下组织、筋膜，纵行切开竖脊肌，深度为1.5 cm，将材料置入肌肉内，保证上下多孔钽片之间肌肉间隔在1 cm以上，左右各植入2枚，使之与肌肉紧密接触，逐层缝合切口。术后分笼饲养，不限制活动，术后3 d每天用络合碘消毒伤口，术后3 d连续肌肉注射青霉素8104 U。1.5 主要观察指标 取材：植入后2，4，8周，随机取6只兔空气栓塞处死，将多孔钽片连同其周围0.5 cm肌肉组织一同取下，标记组别、编号、时间点。每个时间点两组各12枚标本，其中6枚标本行组织学观察、扫描电镜观察，另外6枚行硬组织切片观察。 大体观察：术后观察动物存活、切口愈合及活动情况。取出植入材料后，观察材料周围有无红肿、化脓，材料与肌肉组织结合紧密情况。 组织形态学观察：将标本一面的肌肉组织小心剔除，显露并取下多孔钽片，标记与肌肉钝性分开一面，准备行扫描电镜观察，余下肌肉组织固定于体积分数4%甲醛溶液，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋并切片，行苏木精-伊红染色(观察多孔钽与肌肉界面的反应、包膜厚度)及Masson染色(观察异位成骨情况)。 扫描电镜观察：4%戊二醛固定取出的植入材料，梯度乙醇逐级脱水，37 电热恒温鼓风干燥箱内烘干后，采用离子溅射装置喷金，扫描电镜观察植入材料内肌肉组织长入情况。 硬组织切片观察：体积分数4%甲醛固定取出的植入材料后，脱水、渗透、包埋及聚合，真空处理；将包埋块取出，抛光切面，硬组织切片机切片，制成 70 m切片，磨片至20 m，干燥，脱塑。甲苯胺蓝染色，空气干燥，中性树胶封固。光镜下观察植入材料内肌肉组织长入情况。1.6 统计学分析 实验结果采用SPSS 17.0统计软件进行统计处理。数据以s表示，组间比较采用独立样本t 检验，组内不同时间点间比较采用单因素方差分析；检验水准=0.05。2 结果 Results 2.1 实验动物数量分析 18只兔均进入结果分析。2.2 材料外观结构及形态特征 国产多孔钽材料呈深灰色、表面粗糙，在材料表面及断面内可见均匀分布的连通的蜂窝状结构，见图1A；扫描电镜观察可见材料表面及断面内存在20-50 m的微粒结构，微粒间存在400-600 m的均匀孔隙，孔隙间相互连通，见图1B，C。2.3 大体观察结果 多孔钽片植入兔竖脊肌后，未见感染、渗出及破溃，切口均一期愈合。取出各组植入多孔钽连同周围0.5 cm肌肉，大体见皮下组织及肌肉无充血及肿胀，无渗出及化脓，材料与肌肉连接紧密，未见明显包囊形成，见图2。图2 植入兔体内的多孔钽连同周围0.5 cm肌肉标本Figure 2 Porous tantalum slices with surrounding muscle tissues (thickness: 0.5 cm) implanted into the rabbits2.4 组织学观察结果 植入后2，4，8周观察可见，两组材料周围均有纤维性包膜形成，随时间延长，纤维性包膜逐渐由疏松变致密，包膜厚度也随时间延长逐渐变薄，材料与肌肉的交界面可见少量散在分布的淋巴细胞，未见炎细胞、巨噬细胞及异物巨细胞。各时间点两组形成的包膜与周围肌肉组织结合均较紧密，两组包膜厚度比较差异无显著性意义(P 0.05)；组内各时间点间比较差异有显著性意义(P 0.05)，见表1。2.5 扫描电镜观察结果 植入后2周，可见两组多孔钽材料表面均附着少量肌肉及胶原纤维，与材料接触不够紧密，材料孔隙内可见少量胶原纤维长入(图3A)；植入后4周，可见两组多孔钽材料孔隙内胶原纤维及肌纤维纵横交错，向孔隙内部生长，形态多样、伸展、拉长，部分横跨孔隙相互连接(图3B)；植入后8周，可见两组多孔钽材料孔隙被大量肌纤维填满，与洞壁连接紧密(图3C)。2383ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH表1 植入后不同时间点两组纤维包膜厚度的比较 (s，n=6，m)Table 1 The thickness of the fiber capsules at different time after implantation表注：与2周比，aP 0.05；与4周比，bP 0.05。组别2周4周8周tP实验组529.33318.864392.83313.556a220.66713.501ab596.5450对照组527.1679.239382.83315.171a218.33318.715ab645.5560合计529.00015.781389.72217.934217.94414.691t0.0610.6380.218P0.9410.5420.807CAB图1 国产多孔钽材料的大体与扫描电镜观察结果Figure 1 The appearance and scanning electron microscope observation of the domestic porous tantalum图注：图中A为多孔钽外观，呈深灰色、表面粗糙，在材料表面及断面内可见均匀分布的连通的蜂窝状结构；B(200)、C(1 000)为扫描电镜观察，材料表面及断面内存在20-50 m的微粒结构，微粒间存在400-600 m的均匀孔隙，孔隙间相互连通。植入后2周 植入后4周 植入后8周ABC实验组 对照组图3 多孔钽/骨形态发生蛋白7复合物植入兔肌肉后不同时间点的扫描电镜观察(1 000)Figure 3 The scanning electron microscope images of the porous tantalum loaded with bone morphogenetic protein 7 implanted into the rabbit muscle (1 000)图注：图中A为植入后2周，材料表面均附着少量肌肉及胶原纤维，与材料接触不够紧密，材料孔隙内可见少量胶原纤维长入；B为植入后4周，材料孔隙内胶原纤维及肌纤维纵横交错，向孔隙内部生长，形态多样、伸展、拉长，部分横跨孔隙相互连接；C为植后8周，材料孔隙被大量肌纤维填满，与洞壁连接紧密。植入后2周 植入后4周 植入后8周实验组 对照组图4 两组材料植入后不同时间点的多孔钽-肌肉硬组织切片观察(甲苯胺蓝染色，100)Figure 4 Hard tissue observation of porous tantalum-muscle interface at different time after implantation (toluidine-blue staining, 100)图注：植入后2周，两组多孔钽孔隙内均可见肌纤维长入，实验组孔隙间可见少量成纤维细胞及新生毛细血管，对照组几乎未见新生毛细血管；植入后8周，两组均可见多孔钽孔隙内长满呈条索状的肌纤维，毛细血管及细胞成分减少，纤维组织包膜薄而致密，钽-肌肉紧密融合。图5 两组材料植入后不同时间点的肌肉组织Masson染色观察(100)Figure 5 Masson staining sections of the muscle tissues at different time after implantation (100)图注：植入后2周，两组钽-肌肉界面处均可见薄层纤维组织包绕，小血管丰富，其间较多间充质细胞，未见软骨基质形成。植入后8周，实验组钽-肌肉界面边缘处肌肉内可见大量间充质细胞、骨胶原及软骨基质形成，少量的软骨细胞，为新生的软骨化骨；对照组未见骨胶原分布，未见间充质细胞及软骨基质形成。2.6 硬组织切片观察结果 两组肌肉及小血管向多孔钽内生性生长。植入后2周，两组多孔钽孔隙内均可见肌纤维长入，实验组孔隙间可见少量成纤维细胞及新生毛细血管，对照组几乎未见新生毛细血管；植入后4周，两组多孔钽孔隙内有大量肌纤维长入孔隙内，孔内纤维组织变得致密，毛细血管增多，但对照组肌纤维及毛细血管数量不及实验组；植入后8周，两组均可见多孔钽孔隙内长满呈条索状的肌纤维，毛细血管及细胞成分减少，纤维组织包膜薄而致密，钽-肌肉紧密融合，见图4。2.7 Masson染色结果 植入后2周，两组钽-肌肉界面处均可见薄层纤维组织包绕，小血管丰富，其间较多间充质细胞，未见软骨基质形成。植入后4周，实验组钽-肌肉界面处可见肌肉间隙内蓝绿色骨胶原形成，呈网格状分布，其间可见间充质细胞及软骨基质形成，未见明显的软骨细胞岛；对照组未见骨胶原分布，未见间充质细胞及软骨基质形成。植入后8周，实验组钽-肌肉界面边缘处肌肉内可见大量间充质细胞、骨胶原及软骨基质形成，少量的软骨细胞，为新生的软骨化骨；对照组未见骨胶原分布，未见间充质细胞及软骨基质形成，见图5。3 讨论 Discussion多孔钽金属是人体修复的新一代材料，多孔钽的弹性模量为2.0-4.0 GPa，介于皮质骨(12-18 GPa)和松质骨(0.1-0.53 GPa)之间，置入骨骼后几乎没有应力遮挡，利于正常的生物学应力传导，可促进多孔钽和宿主骨的整合13-15。同时多孔钽具备良好的空间三维立体结构，孔隙率可达75%-85%，平均孔径在400-600 m，利于细胞长入，可为细胞、血管、组织代谢产物及营养物质运输提供有利的空间环境5，16。国外多项临床研究已证实，多孔钽假体在人工关节领域取得了令人满意的临床效果17-22。目前在骨科领域得到应用较多是美国Zimmer 公司成功研制的多孔钽材料，此材料为专利技术，价格昂贵，国内尚未广泛使用。重庆润泽医疗器械公司与国内多家科研机构合作，采用特有的粉末冶金浇注高温煅烧工艺技术，成功研发了具有自主知识产权的国产医用多孔钽材料，其孔径及孔隙率等参数均已接近Zimmer公司。实验中首先观察了国产多孔钽的外观及内部结构，鉴于肌肉内植入实验可准确反映植入材料相容性的真实状态23，所以通过肌肉内植入多孔钽来探讨多孔钽的相容性。研究结果显示，两组多孔钽材料分别植入兔竖脊肌后，动物伤口均为一期愈合，取材时未发现多孔钽周围肌肉组织颜色及结构与周围肌肉有差别，提示多孔钽材料具有较好的组织相容性。同时通过观察材料周围的包膜厚度发现，两组多孔钽表面具有稳定的包膜形成，随时间延长包膜逐渐变薄，致密程度逐渐增加，8周时包膜变得薄而致密；在植入后2，4，8周各个时间点，两组多孔钽周围的纤维包膜的厚度没有差异；并且在各个时间点，两组的多孔钽周围组织中均没有发现异物巨细胞，取材时材料周围肌肉组织无明显炎症反应，也提示材料的组织相容性好。国外学者在犬的皮下组织置入钽丝，置入后1，2，3个月钽金属周围形成了致密的包膜，钽丝没有发生腐蚀及电解反应，且周围组织无炎症反应24。此次实验结果与国内外相关报道结论一致。多孔钽具有独特的三维空间立体结构，利于细胞黏附、生长及分化，也可促进氧气、水分及其他营养物质的运输，利于组织的长入25-28。在此次实验中通过扫描电镜观察发现，在多孔钽材料表面及内部孔隙中，胶原纤维及肌肉组织随时间延长逐渐增多，初期与材料接触不够紧密，中期胶原纤维及肌纤维纵横交错，不断伸展、拉长；8周时，材料孔隙被大量肌纤维填满，与洞壁连接紧密。以上结果说明，国产多孔钽材料具有极佳的组织相容性及肌长入特性。Hacking等24将Zimmer多孔钽置入犬皮下的研究得到了与作者此次实验相似的结果。同时此次实验硬组织切片结果提示，植入后2周，两组多孔钽材料内逐渐有肌纤维长入，多孔钽与骨形态发生蛋白7复合后，新生毛细血管出现较多孔钽组早；4周两组多孔钽内部均有大量肌纤维长入孔隙，孔内纤维组织变得致密，毛细血管增多；8周，孔隙内长满条索状肌纤维，毛细血管减少，钽-肌肉紧密结合，也提示多孔钽良好的生物相容性，与上述结果一致。骨形态发生蛋白7同时具备很强的异位成骨作用，可在异位诱导新骨的形成，在骨缺损的修复及软骨分化过程中发挥重要作用9-10。而肌袋模型常用来检测异位成骨，可对生物材料的骨诱导性作出正确评价29-36。所以实验中将细胞因子骨形态发生蛋白7与多孔钽复合，来观察复合后植入兔竖脊肌后异位成骨能力。此次实验采用Masson染色从组织形态学水平观察异位成骨。Masson染色主要用于胶原纤维和肌纤维的鉴别，染色结果与组织成分有关，早期幼稚的新生软骨中的胶原显示蓝色，而成熟骨组织的胶原染成鲜红色，而新生骨逐渐变成熟过程中则表现为蓝色至红-蓝相间。实验结果发现，植入后2周，实验组的钽-肌肉界面处可见薄层纤维组织包绕，小血管丰富，其间较多间充质细胞，未见软骨基质形成；植入后4周，实验组 钽-肌肉界面处可见肌肉间隙内蓝绿色骨胶原形成，呈网格状分布，其间可见间充质细胞及软骨基质形成；到达植入后8周时，实验组钽-肌肉界面边缘处肌肉内可见大量间充质细胞、骨胶原及软骨基质形成，少量的软骨细胞，为新生的软骨化骨。而对照组在这3个时间点均未见骨胶原分布，未见间充质细胞及软骨基质形成。提示在此次实验中多孔钽与骨形态发生蛋白7复合后，具备了较强的成骨诱导作用，在兔竖脊肌内出现了异位成骨。Simon等37研究也发现，多孔钛复合骨形态发生蛋白植入小鼠体内4周后，在其周围有异位骨形成，这与此次实验结果类似。根据实验结果，结合以上相关报道，均提示国产多孔钽具有良好的组织相容性，与骨形态发生蛋白7复合后并未影响细胞因子活性，具备较强的成骨诱导作用，再次验证了多孔钽作为组织工程支架材料的优越性的同时，也为进一步软骨及骨损伤的修复提供了新的实验依据。作者贡献：王志强进行实验设计，实验实施为张辉，王爱军，史伟，实验评估为陶建峰，资料收集为卞育婕，王茜成文，李琪佳审校。利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题：实验方案经华北理工大学动物实验伦理委员会批准，批准号为2014036。实验动物在水合氯醛麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：本刊实行双盲外审制度，文章经国内小同行外审专家审核，符合本刊发稿宗旨。作者声明：通讯作者对于研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 Bobyn JD,Stackpool GH,Hacking SA,et al. 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