硫酸庆大霉素胶囊抗生素效价的测定及评价-本科毕业论文

*大 学本 科 毕 业 论 文题目：硫酸庆大霉素胶囊抗生素效价的测定及评价姓 名：学 号：专 业： 年 级： 完成日期： 指导教师： 本科生毕业论文（设计）独创性声明本人声明所呈交的毕业论文（设计）是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文中没有抄袭他人研究成果和伪造数据等行为 。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。论文（设计）作者签名： 日期： 本科生毕业论文（设计）使用授权声明海南师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交毕业论文（设计）的复印件和磁盘，允许毕业论文（设计）被查阅和借阅。本人授权海南师范大学可以将本毕业论文（设计）的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存、汇编毕业论文（设计）。论文（设计）作者签名： 日期： 指 导 教 师 签 名： 日期： 目 录摘要11.前言22. 材料与方法32.1实验材料与仪器设备32.1.1实验材料32.1.2培养基配方42.1.3实验试剂42.1.4实验仪器42.2实验方法42.2.1短小芽孢杆菌菌悬液的制备42.2.2培养皿的选择52.2.3操作环境系统的监测52.2.4磷酸缓冲溶液的选择52.2.5 平均装量62.2.6标准品与供试品溶液的制备62.2.7双碟的制备72.2.8放置牛津杯82.2.9滴加抗生素82.2.10抑菌圈测定仪的使用93.结果与分析93.1操作环境系统的监测93.2缓冲体系93.3 平均装量113.4试验菌浓度113.5样品测试结果123.5.1实验结果图123.5.2实验结果统计133.6 讨论164.结论17致谢17参考文献18硫酸庆大霉素胶囊抗生素效价的测定及评价作者： 指导老师： 摘 要：为了解我市某药品生产企业生产的硫酸庆大霉素胶囊质量是否合格，本研究采用管碟法对该抗生素效价，通过全自动抑菌圈测定仪进行效价分析，结果表明测试的2批药品T131156和T110109的R值分别为0.2659和0.2702，均小于0.273；2批药品回归比较均显著( P 0.0 5 )，标准品和检测品均呈平行直线关系；2批药品T131156和T110109的平均可信限率Pt的FL%分别为4.2428%和3.4479%，均小于5%；2批药品T131156和T110109的测定效价分别为662.0827u/mg和646.1536u/mg，均高于估计效价的90%且低于估计效价的110%。综上所述，测试的2批药品抗生素效价均符合药典要求，质量合格。关键词：硫酸庆大霉素；抗生素效价；抑菌圈测定仪Abstract：In order to understand whether the quality of Gentamicin sulfate capsules which Produced by a pharmaceutical factory of Hai Kou is qualified or not, we had do the antibiotic titer evaluation analisysed by cylinder-plate method and the Automatic inhibition zone determinator. The R value of T131156 and T110109 which had determined was 0.2659 and 0.2702, they were all less than 0.273. Comparison of two batches of drugs were significantly regression(P0.05). Standards and testing products showed a parallel linear relationship. The FL% of the average rate Pt of this two batches of drugs were 4.2428% and 3.4479%, all of them less than 5%. The determine titer of this two drugs were 662.0827u/mg and 646.1536u/mg, they are higher than 90% of the estimated potency and less than 110% of the estimated potency. In summary, the antibiotics titer of this two batches of drugs which up to the specification of Pharmacopoeia, qualitative qualification. Key words：gentamicin sulfate；antibio tic titer；inhibition zone tester1.前言抗生素微生物效价测定是利用抗生素抗菌的程度，作为客观指标来衡量抗生素有效成分的一种方法，是药典检定的常规方法，在国际上通用。此方法符合临床应用的要求，能确定抗生素的医疗价值。随着仪器设备的发展，部分抗生素可以用物理或化学的方法测定其含量，但微生物效价测定法依然作为抗生素效价的主要方法并被各国药典所采用。抗生素微生物效价有三种方法：管碟法、稀释法、比浊法1。稀释法一般用于测定药物的 MIC，该方法未被药典收载过；比浊法仪器设备要求较高，操作时菌种很容易被污染，所以一直也没有被中国药典采用；而管碟法却是是国际通用法，灵敏度高，具有准确性重复性好，易于操作等特点，被广泛用于进行抗生素效价，其主要原理是将抗生素的标准品溶液和未知浓度的检测品溶液，滴定到放置在含有敏感性试验菌的菌层培养基上的钢管里，经过培养，形成一定大小的抑菌圈，测量抑菌圈的直径进行抗生素效价。管碟法分为三种：一剂量法、二剂量法、三剂量法。一剂量法操作较繁琐，中国药典在1977年版后该方法已被淘汰。二剂量法属于反应平行线测定法，反应平行线测定法的原理是根据标准品和供试品的剂量反应呈线性关系，且在标准品与供试品所形成的直线相互平行的基础上计算的，二剂量法标准品与供试品高低浓度之比是2:1或4:1，高低浓度之比为2:1时标准品溶液的高浓度所形成的抑菌圈直径是18-22mm【2】。三剂量法只采用于标化标准品。无论采用哪种方法进行抗生素微生物效价，对操作环境的洁净度都有一定的要求，即需对环境操作系统进行监测。管碟法对抗生素微生物效价洁净度要求为300000级【3】，我国GMP及国标GB/T16294-1996均以直径为90mm平皿在0.5h内的最大允许菌落数为各洁净区的沉降菌限度标准。洁净控制标准如下表：表1 洁净控制标准洁净级别微生物最大允许数沉降菌CFU/皿100级110000级3100000级10300000级15如果洁净区内每个取样点的沉降菌含量均小于相应级别下相同测量时间的沉降菌最大允许含量，则该环境符合沉降菌洁净度的要求，否则，应当加强清洁和消毒，直到洁净度符合标准。在符合标准的环境操作系统下所得的实验结果，需符合2010年版中国药典的规定：标准品与供试品两条直线应相互平行(P0.05)时，且可信限率5%，实验结果才是有效的；统计时，应列举管碟法中的原始数据和数值范围，将原始数据中的最高值减去最低值得出每一列的数据范围，比率（R）=数值的最大范围值/所以数值范围的总和，R值不应超过0.273【4】，R值是衡量效价测定的抑菌圈数据是否合理，如果超过了0.273，则需要检查列中的最大范围异常反应。另规定，测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应重新调整其估计效价进行试验【5】。 基于药典对抗生素微生物效价的标准，本实验选用硫酸庆大霉素胶囊进行抗生素效价。硫酸庆大霉素胶囊内容物为白色或类白色的粉末或颗粒，计算其称样量需先确定其平均装量，药典规定取药品10粒，每粒装量与平均装量相比较，装量差异限度应在10%以内，超出装量差异限度的不得多于2粒,并不得有1粒超出限度1倍【6】。近年来，药品的质量问题所引发的事故越来越多，已经是人类健康所关注的一重大问题。抗生素新品种不断的涌现和种类越来越多，临床应用也越来越广，对该抗生素进行效价测定检测是否符合药典规定，对指导临床用药，保证药物疗效等方面具有重要的现实意义。2. 材料与方法2.1实验材料与仪器设备2.1.1实验材料2.1.1.1 实验菌种 短小芽胞杆菌CMCC（B）632022.1.1.2 实验药品 标准品：硫酸庆大霉素(批号201403,效价575.7u/mg,广州市齐云生物技术有限公司)供试品：硫酸庆大霉素普鲁胶囊（样1：批号 T131156， 样2：批号 T110109，海南普利制药股份有限公司）2.1.2培养基配方 蛋白胨10g，牛肉膏3g ，氯化钠5g ，琼脂1520g ，蒸馏水1000mL， 121高压灭菌30min 2.1.3实验试剂 磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，氢氧化钠2.1.4实验仪器 表2 主要仪器设备信息仪器设备名称型号厂家全自动菌落抑菌圈测定仪分析系统HICC-V杭州万深检测科技有限公司超净工作台Hfsafe-1200力康发展有限公司电子天平AR224CN奥豪斯仪器有限公司陶瓦盖直径115mm北京索莱宝科技有限公司牛津杯内径6.0mm,外径8.0mm，高10mm海南师范大学生物实验室购买电热恒温培养箱DHP-9272上海一恒科技有限公司2.2实验方法2.2.1短小芽孢杆菌菌悬液的制备2.2.1.1 菌种活化 从-80冰箱中将装有短小芽孢杆菌的塑料管取出，置于冰块中直到塑料冻管内部结冰全部液化，在超净工作台里将短小芽孢杆菌转接到平板上，置于35-37的培养箱里培养24h。2.2.1.2 菌种培养 将已活化好的菌种转接到平板中，在35-37培养箱里培养7天。2.2.1.3 菌悬液的制备 向已培养了7天的短小芽孢杆菌的平板加入2- 3mL无菌蒸馏水，用涂布棒将菌种洗下，转移到灭过菌的锥形瓶里，置于4冰箱里保存备用。2.2.2培养皿的选择培养皿底部不平时，会使培养基厚度不均匀，培养基厚度大，抑菌圈半径变小，培养基厚度小，抑菌圈半径大【8】，容易造成实验误差，故应该选择底部平整，厚度均匀且规格一样的培养皿。选择时，可将培养皿放在水平台上，底部垫一层白纸，分别加入3-4mL的水，然后滴加蓝色墨水，观察蓝色是否深浅一致，如颜色深浅一致则表示培养皿底部平整【9】。2.2.3操作环境系统的监测操作环境系统的洁净度采用沉降菌进行检测。本次实验用的是操作室分为两部分，中间由玻璃门隔开，其中一部分为无菌操作室，另一部分为半无菌操作室，这两部操作室都设有紫外灭菌灯。将制备好的营养琼脂倒在6平皿里，凝固后，将1个平板放在无菌操作室的超净工作台上，2个平板放在及无菌室里两个不同的位置，剩下3个平板放在半无菌操作室的三个不同位置，分别打开平板30min以上，之后置于35-37培养箱中培养48h。2.2.4磷酸缓冲溶液的选择称取磷酸氢二钾5.59g，磷酸二氢钾0.41g，加水蒸馏水1000mL，制成磷酸缓冲液，用NaOH溶液调整其pH值。2010版的中国药典规定效价硫酸庆大霉素用的磷酸缓冲溶液pH=7.8，且不添加任何物质。但有文献表明，硫酸庆大霉素微生物的效价测定，高剂量的抑菌圈直径大小很难达到18-22mm，在pH7.8-8.8之内，其抑菌圈的大小随缓冲液pH值的增大而增大，且在缓冲液中加入4%以上的氯化钠，直径能达到18-22mm这个范围【10】。为了选择最适条件的磷酸缓冲液，本实验做了两组对照，一组pH值为7.8不滴加NaCl与滴加NaCl的磷酸缓冲液，另一组pH值为8.4不滴加NaCl与滴加NaCl磷酸缓冲液。2.2.5 平均装量倾出供试品硫酸庆大霉素胶囊的内容物迅速称量，记录每粒胶囊的重量，每个批号分别称量10粒，并计算每个批号的平均装量。表3 供试品的平均装量颗粒 样1/g 样2/g1 0.2734 0.26662 0.2731 0.26723 0.2722 0.26714 0.2721 0.26695 0.2730 0.26786 0.2720 0.26827 0.2719 0.26788 0.2735 0.26799 0.2724 0.267610 0.2730 0.2681平均装量 0.2726 0.26752.2.6标准品与供试品溶液的制备抗生素吸湿性很强，称量的时候很容易吸收操作环境空气中的水分而影响精确度，称量时要用精确度达到1/10万的分析天平快速一次性称量，称量完后立即将药品盖好，以免吸水。药品的称样量可根据海南普利制药有限公司质检部提供的公式计算：称样量=（R23.5638u/mg平均装量）标示量。R：一般取值为123.5638u/mg：是指药品要达到15000个单位2.2.6.1 标准品溶液的制备标准品的标示量是575.7u/mg，要达到15000个单位需要称量0.026g。称量前，先将标准品从4冰箱取出，置于室内待其温度与室温平衡后，再称量0.026g用50mL容量瓶加超纯水定容至50mL。充分混匀后，取2mL标准品溶液分别用100mL和50mL装量的磷酸缓冲液稀释成高浓度为12u/mL、低浓度为6u/mL的标准溶液，稀释前，先将已配制好的磷酸缓冲液润洗要稀释用的容量瓶，量取过滤液的吸管要用过滤液润洗2-3次。2.2.6.2 供试品溶液的制备样1的平均装量是0.2726g,样2的平均装量是0.2675g，代入以上公式得样1称样量=0.4089g，样2称样量=0.40125g。重新拿新的胶囊进行称量，避免药品吸收水分而影响结果，称量好后分别装入50mL容量瓶加超纯水定容至50mL,并用滤纸过滤收集液体，收集液体用的器皿要用过滤液润洗。标准品和供试品所用的磷酸缓冲液应是同一瓶，防止浓度或pH值不一样而影响实验结果。稀释时和标准品操作方法一样，需要用磷酸缓冲液润洗要稀释用的容量瓶和量取过滤液的吸管，分别取2mL标准品溶液分别用100mL和50mL装量的磷酸缓冲液稀释成高浓度为12u/mL、低浓度为6u/mL的样液。2.2.7双碟的制备2.2.7.1试验菌浓度的确定 由于实验过程中是用平板培养试验菌，冲洗时没有固定无菌水的用量，在制备菌层培养基时无法确定试验菌的浓度，所以可通过加最适量的菌悬液来取得最佳结果。200mL培养基加菌量范围是3.5mL-5.5mL【11】,故可先测试培养基加菌量分别为3.5mL、4mL、4.5mL、5mL所形成的抑菌圈效果哪个最好，选出最适加菌量。2.2.7.2制备底层培养基从无菌操作室里选择一个较平的超净工作台，如果超净工作台面凹凸不平，可以在操作台上放置一块大的玻璃板，以保证放置平皿的位置平整。加注底层培养基前，先将灭过菌的培养皿底部平均划分为4个区域，分别标注上标准品和供试品的高低浓度，之后用10mL的灭菌大口移液管吸取20mL培养基加注到平整培养皿里，作为底层培养基。加注时避免培养基温度太低，防止培养基内部结块而影响培养基表面水平。2.2.7.3制备菌层培养基将已灭菌的200mL装量的培养基加热融化后冷却，注意培养基温度过高会使菌种致死，导致无圈或者抑菌圈破圈。细菌一般是冷却到48-50，芽孢可冷却到60左右【12】，加入已经制备好的短小芽孢杆菌菌悬液3.5mL-5.5mL,摇匀。用灭菌的10mL大口移液管吸取含有菌液的培养基5mL，注入到底层培养基上，轻轻晃动，使含有菌液的培养基均匀的平铺在底层培养基上，置超净工作台上待凝固备用。2.2.8放置牛津杯用镊子将已灭菌的牛津杯等距离的放置到制备好的双碟培养基上，放置后，静置5-10min，再滴加标准品和供试品溶液。2.2.9滴加抗生素每批供试品至少准备6个双碟，用灭过菌的胶头滴管滴加抗生素溶液，滴加前先用滴加液润洗2-3次。按已经划分好的区域滴加，滴加顺序为SHTHSLTL，也可以是SLTLTHSH（S：标准品，T：供试品，H：高浓度，L：低浓度），但由于抑菌圈测定仪系统固定的检测顺序是THSHTLSL,故本次实验的添加顺序没有按药典规定的顺序添加，而是根据抑菌圈测定仪检测顺序THSHTLSL添加抗生素，最终都不会影响检测结果。滴加的溶液应与钢管口平满，如果过满，需用胶头滴管轻微吸取多余的部分，且滴加抗生素的时间间隔不能太长，会引起抗生素扩散的时间不同而影响实验结果。滴加时胶头滴管如果有气泡或开口端有液体残留时，应重新吸取溶液滴加，避免滴加过程气泡破裂或溅落使培养基表面破圈。滴加完毕后，轻轻的将双碟平稳放入35-37培养箱，放置双碟时应保持一定的距离，以免受热不均匀影响抑菌圈的大小，最后用灭过菌的陶瓷盖盖住双碟，培养16-18h【13】。2.2.10抑菌圈测定仪的使用检查：检查软件锁、扫描仪数据连接线均已正确连接上电脑的USB 接口，扫描仪的安全锁均处于开锁状态且扫描仪电源处于打开状态；打开：插上测定仪的密钥，在桌面上找到抑菌圈自动测定的快捷方式，点击打开；设置：打开设置页面，将成像方式选择扫描仪，选择六皿；标定：选择标定中的扫描时自动标定，系统会自动根据扫描的分辨率将图像尺寸与实际大小进行对应；扫描及分析：用酒精擦掉平皿底部划分的区域，分别在双碟边缘上标出标准品的位置，然后选出6个双碟按一定顺序安置在扫描仪上进行扫描，调整好每个目标区的大小及位置，选择“六皿抑菌圈正片”，点击执行，则抑菌圈的直径大小均测量出来。效价分析：点击效价分析，接着点击统计即可得出结果统计表。3.结果与分析3.1操作环境系统的监测 表4 沉降菌落数操作室无菌操作室半无菌操作室序号123123CPU/皿000011从上表4中可知，无菌操作室沉降菌平均菌落数为0，半无菌操作室平均菌落数不到1，操作环境系统达到100级，而抗生素微生物效价要求300000洁净区，操作环境系统远远符合洁净度要求。3.2缓冲体系在不同试验条件下的磷酸缓冲液所形成的抑菌圈直径大小如下：表5 磷酸缓冲液pH=7.8的抑菌圈直径不滴加NaCl 滴加NaClpH=7.8dS1dS2dT1dT2dS1dS2dT1dT215.43518.44215.21018.13316.91418.37116.22218.7815.32118.32215.10518.05916.26118.78116.42818.3315.33618.21015.16718.21116.71118.18616.08918.8915.21918.39815.31018.27116.56618.11416.73318.94范围0.216 0.232 0.205 0.212 0.653 0.667 0.644 0.61表5数值显示， pH=7.8且不滴加NaCl的磷酸缓冲液比率（R）=0.232/(0.216 + 0.232+ 0.205+ 0.212)=0.2680.273；滴加NaCl的磷酸缓冲液比率（R）=0.667/( 0.653 + 0.667+ 0.644+ 0.61)=0.25910.273；滴加NaCl的磷酸缓冲液比率（R）=0.959/(0.959 + 0.834+ 0.874+ 0.73)=0.2820.273，pH=8.4的抑菌圈数值比率均大于0.273，数值存在异常值，在是否滴加NaCl的数值范围上与pH=7.8的情况一样，不滴加NaCl的磷酸缓冲液比滴加NaCl的磷酸缓冲液所形成的抑菌圈直径小，但数值大小差异也小。两个不同条件的磷酸缓冲液统计结果表明，pH=8.4所形成的抑菌圈直径大，但出现异常值的机率也大，pH=7.8且不滴加NaCl的磷酸缓冲液所形成的抑菌圈数值符合药典规定，效果最佳。3.3 平均装量 样1平均装量为0.2726，样2平均装量为0.2675，每个批次的每粒装量与各平均装量大小相比范围如表7： 表7 每粒装量与平均装量相比大小范围颗粒 样1/g 样2/g 1 0.0008 0.0009 2 0.0005 0.00033 0.0004 0.00054 0.0005 0.00065 0.0004 0.00036 0.0006 0.00077 0.0007 0.00038 0.0009 0.00049 0.0002 0.000110 0.0004 0.0006庆大霉素胶囊每粒装量与其平均装量相比较所得的结果，所有装量差异限度都在10%以内，符合2010年版中国药典规定。3.4试验菌浓度试验菌浓度过低,抑菌圈边缘会模糊不清; 试验菌浓度过高会使抑菌圈太小而影响抗生素效价【14】。不同加菌量所形成的抑菌圈直径大小及清晰度如下：表8 菌悬液用量与抑菌圈直径及清晰度的关系菌液量/mL 3.5 4 4.5 5高剂量 18.842 18.622 18.474 18.331低剂量 15.661 15.432 15.420 15.297抑菌圈清晰度 边缘不清晰 边缘清晰 边缘很清晰 边缘很清晰表8数据表明，抑菌圈直径随菌悬液用量的增加大小变化不大，均在18-22mm范围内。加菌量为4.5mL时，抑菌圈边缘很清晰，应是最适加菌量。3.5样品测试结果3.5.1实验结果图 图1 样1抑菌圈图2 样2抑菌圈3.5.2实验结果统计在结果统计前，需检查抑菌圈直径大小是否存在异常值，将最大值范围值和所有数值范围的总和代入公式：比率（R）=数值的最大范围值/所以数值范围的总和，当比率（R） 0.05回归 1 56.1607 56.1607 1,225.7112 0.05剂间 3 56.3802 18.7934 410.1673 0.05误差 15 0.6873 0.0458 总 23 57.1075 碟数 m=6 圈数 k= 4 估计效价 At=638.0000剂间比 r= 2.0000 浓度比 D= 1.0000 对数值 I=0.3010t表 t=2.1350 自由度 f=15R的对数 M= 0.0161 回归系数 g=0.0037 标准误差 Sm=0.0086 对数值 R=1.0377 R上限Rh=1.0829 R下限 Rl=0.9948测定效价 Pt= 662.0827 Pt上限Ph=690.8606 Pt下限 Pl= 634.6791平均可信限率Pt的FL%= 4.2428 %样1统计表显示：比率（R）=数值范围的最大值/所有数值的范围总和=0.519/1.952=0.2659，比率0.2659未超过0.273限值，即表中所有抑菌圈直径测定值均是合理的；变异来源中的回归比较显著( P 0.0 5 )，即标准品和检测品呈平行直线关系；平均可信限率Pt的FL%= 4.2428 % 0.05回归 1 52.4882 52.4882 1,848.2134 0.05剂间 3 52.5434 17.5145 616.7189 0.05误差 15 0.4260 0.0284 总 23 53.2107 碟数 m=6 圈数 k= 4 估计效价 At=638.0000剂间比 r= 2.0000 浓度比 D= 1.0000 对数值 I=0.3010t表 t=2.1350 自由度 f=15R的对数 M= 0.0055 回归系数 g=0.0025 标准误差 Sm=0.0070 对数值 R=1.0128 R上限Rh=1.0483 R下限 Rl=0.9785测定效价 Pt= 646.1536 Pt上限Ph=668.8366 Pt下限 Pl= 624.2790平均可信限率Pt的FL%=3.4479 %样2结果统计表中显示：比率（R）=数值范围的最大值/所有数值的范围=0.500/1.850=0.2702，小于0.273,故统计表中所有测定值均是合理的；回归比较显著( P 0.0 5 )，标准品和检测品呈平行直线关系,平均可信限率Pt的FL%= 3.4479%5% ，实验结果成立。样2的测定效价是646.1536 u/mg，高于估计效价的90%且低于估计效价的110%，符合2010年版中国药典规定，该药品合格。3.6 讨论抗生素微生物效价测定的操作步骤比较繁琐，影响因素较多，任何一个环节操作不当或粗心大意都造成很大的误差，甚至会导致整个实验的失败。如加菌量过少，抑菌圈边缘模糊，加菌量过多，抑菌圈直径变小；磷酸缓冲溶液pH值过高或过低，对效价结果影响也很大；试验菌的浓度、抗生素称样量、培养温度、培养时间等也会有所影响，除了这些因素外，可能还存在其他因素，只有不断进行具体实验研究，才能不断认识和掌握问题所在和找到解决方法，使实验结果更接近真实值，误差更小。4.结论用管碟法对硫酸庆大霉素胶囊进行抗生素效价，得出了其最适的实验方案：加菌量4.5mL,缓冲液pH=7.8且不添加任何物质，在36培养箱里培养16个h，得到抑菌圈边缘较清晰，标准品高剂