草莓组织培养.doc

草莓的组织培养一、茎尖1概述 通过对草莓茎尖离体培养的试验研究表明：取草莓茎尖为外植体， 以035mm大小为宜；用MS+0.5mg/L6-BA+O.2mg/LNAA培养基不定芽再生率高；以1/2MS+O.1mg/LIBA生根效果最好。2.结论 （1）再生途径：草莓刚抽出的匍匐茎的茎尖 （2）灭菌方法：洗去泥土、灰尘，再用自来水冲淋23h，置超净工作台上进 行75乙醇和01升汞不同时间的灭菌处理，最后用无菌水冲洗58次，接种于诱导培养基中。诱导培养基为MS+05mgL6一BA+02mgLNAA+3蔗糖(wv)+05卡拉胶，pH值为5.65.8。每个灭菌处理接种2O枚外植体，l5d后观察记录外植体的污染、死亡、无菌成活生长等情况。 （3）培养基：芽诱导试验，于MS培养基附加02mgLNAA、IAA、IBA不同 种类生长素的培养基中，20d后调查记录幼芽分化情况。继代培养与扩大繁殖，MS培养基附加0.5mg/L6-BA、0.01mg/LNAA。根诱导试验,用1/2MS附加不同浓度(mg/I)IBA有005、01、02、05及不加IBA的5个处理. （3）条件：培养基均在11.1大气压下热压灭菌20min。培养温度(25 2)。每日光照12h，光强2000Lux。 （1）再生途径：用其花药、花蕾、叶、叶柄、子叶、下胚轴等作外植体进行离 体培养。 （2）灭菌方法：洗去泥土、灰尘，再用自来水冲淋23h，置超净工作台上进 行75乙醇和01升汞不同时间的灭菌处理. （3）培养基：MS+BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L(浓度单位,下同)；MS+6一 BA0.5+KT0.5；MS+BA2.0+IAA1.0；MS+BA2.0+NAA0.5+2,4-D0.1；MS+BA2.0+IBA0.1。以上培养基各加CH100mg/L，蔗糖20g/L(为30g/L)。用于花药诱导培养基；用于花药幺伤组织分化培养；、用 于其余5种外植体(叶盘、叶柄、下胚轴、子叶、花蕾)诱导培养；仅用于花蕾培养。 （4）条件：培养条件均为12h光照12h黑暗。光强度1200-1500lx、温度(25 2)。 三、叶片 以红颊、章姬、丰香草莓叶片为试材，对影响草莓叶片不定芽再生的主要因素进行了试验研究，建立了草莓离体叶片的再生体系。试验结果表明，基因型、不同激素种类和配比直接影响了草莓叶片再生芽的发生。基因型是影响草莓叶片再生能力的决定因素，不同激素配比是不定芽产生的关键因素。叶片愈伤组织的诱导培养基以MS+TDZ23mg1较理想，芽伸长的理想培养基为MS+6一BA03O5mgl，生根培养基以12MS+IBA03mg1较适宜，移栽成活率可达90以上。2.结论 （1）再生途径：先采取当年生匍匐茎茎尖培养繁殖，建立起三个品种的无性繁 殖系；再从继代3周的无菌苗上剪取叶片作为外植体，进行不同的处理，每瓶接10片叶盘，每处理重复5瓶。 （2）灭菌方法：于121下高温高压蒸汽灭菌20min。 （3）培养基：基本培养基为MS培养基。茎尖培养与组培苗继代培养基为MS+6 一BA030.5mg/l+蔗糖2Og/l+琼脂7g/l，pH值为58， （4）条件：叶片接种在诱导培养基后，直接置于温度为25、光照强度为 20001x、光周期16h的培养条件下。1、 取材。每年的6-8月，选择植株生长健壮，匍匐茎充实，尖端生长良好，无病虫害的优良植株取其茎尖或花药，作为组织培养的外植体。 2、 消毒。材料取来修整后用纱布包好放在自来水龙头下冲洗2-4小时（以茎尖为例），然后进行表面消毒。先用70%酒精漂洗半分钟，然后用0.1%的新洁尔灭浸泡15-20分钟，再用0.1%的升汞（氯化汞）消毒5-8分钟，最后用1-2%的过氧乙酸消毒1分钟。每次都要用无菌水冲洗3-4次后再进行下一次消毒。整个消毒过程都应在超净工作台内完成。 3、 接种。接种在超净工作台内进行，接种前要先用酒精灯对接种用具（镊子、接种针、接种架等）消毒自然放凉。先用镊子一层层的剥去茎尖外的幼叶和鳞片，然后在解剖镜下找到生长点（可带1-2个叶原基）用接种针挑出生长点（小于0.5毫米），放入事先准备好的盛有培养基的培养瓶内，封好瓶口，置于培养室内培养成小植株。 4、 室内培养。培养室要求干净清洁，室内装有紫外线杀菌灯，每天要对室内进行消毒，以防污染。培养温度20-28，最适温度25，相对湿度70%，光照强度1000-2000勒克斯，每日光照10小时左右。 5、 继代培养。每培养25-30天，培养瓶内的小植株就会分出3-5个小植株，把这些小植株分出放于继代培养基内培养；过20-30天后又会长出小植株，如此反复进行继代培养，增加繁殖系数。 6、 诱导生根。根据生产需要可在1-2月份集中一批苗子生根。草莓试管苗生根很容易，有的在继代培养基上便可生根。或者在培养基中加入0.5毫克/升的LBA，经30天左右便可长出6-10条长约2-3厘米的小根。 7、 温室驯化。把生好根的小苗经光照锻炼7-10天，从试管内取出，洗净根部培养基，移栽入事先准备好的营养土内，使其逐渐长大发出5-6片新叶的过程称为驯化。驯化用的营养土要求土质以疏松的沙土掺入少量有机质。移栽后要浇透水，支小拱棚覆盖塑料薄膜保湿。驯化温度以15-20，前两周空气相对湿度80-100%，第三周开始短时间放风，放风强度逐渐加大，至移栽后第四周可去掉覆盖物。根据情况每天或隔天喷水一次，保持土壤湿润而不积水为宜。驯化一般需2-3个月即可移出。经病毒鉴定，确认无毒后放入网纱大棚内繁殖。 1. 培养基的配制：培养基由植物生长所必需的有机营养成分、微量元素和生长调节剂组成。首先配制基本培养基，包括微量元素、有机物质、蔗糖(3%)、琼脂(0.6%)等。为调节被培养物的生长和分化，还需加入细胞分裂素和其他生长素，如6-苄氨基嘌呤(BA)0.25毫克升、吲哚丁酸(IBA)0.51.0毫克升、GA3(赤霉素)0.1毫克升等，组成MS培养基。配好后装入三角瓶或试管，经高压消毒后备用。 2.采取茎苗：在6月份选取刚扎根的匍匐茎苗，对茎苗进行消毒。消毒方法是，剥去茎苗外面的叶片，用肥皂水洗干净，再用自来水冲洗一小时。在无菌条件下，用70%的酒精漂洗10分钟后，用5%的次氯酸钠溶液消毒78分钟，再用无菌水冲洗5遍，使接种材料无细菌和真菌。然后在超净工作台上，无菌条件下剥取茎尖生长点0.5毫米，接种到上述已配好的培养基上，每个培养瓶可接种57个茎尖。接种后，在26的恒温、光强2000勒克斯、每天光照6小时的条件下进行培养。 3.初代培养：对刚接种到培养基上的匍匐茎尖进行培养，使茎尖分生组织分化出芽和无根小植株。在培养基上加入有利分化的激素，成为分化培养基。茎尖经30天以上的培养，一个茎尖能分化出数个无根小植株。 4.继代培养：把已分化好的新芽转入到新培养基上，进行继代培养繁殖，使新芽不断增殖，加速生长。34个星期后，可获得3040个腋芽形成的芽丛，芽丛中有的抽生新茎，并有正常叶片。经过多次继代培养，使增殖的数量达到一定要求，再把无根苗转入生根培养基上培养，促进生根。 5.生根培养：生根培养时要撤去BA，即去掉了细胞分裂素类的激素，增加生根培养激素，如吲哚丁酸(IBA)等。生长在这种培养基上的无根植株不再增殖，在每株无根苗基部生出许多不定根，可得到成批完全小植株。 6.移植：在把试管苗种植到土壤里以前，可先将其培养在无菌土壤中，或在盛有由蛀石、草炭、锯末等基质组成的培养土的小塑料盆中进行培养。培养时，应将试管苗放在温室中，温度保持在2025为宜。为了保持湿度，以利于试管苗成活，移植后的14天内要用薄膜遮阴，待外界气温适合时，再移植到田间培植。要注意防治蚜虫等虫害，加强田间水、肥管理，可喷两次50毫克千克赤霉素，促进抽生匍匐茎。新抽生的匍匐茎苗为原种苗，经多 次、多量繁殖，即可获得成批生产用苗。 组织培养技术 1、培养程序和培养基 5-6月于晴天的下午在健壮、无病的草莓刚抽出的匍匐茎上取茎尖，大小为03-04mm，作为组织培养的外植体。 用于草莓茎尖培养诱导芽分化的基本培养基为MS，附加6-BA05mg/L，NAA02mg/L，蔗糖30g/L，琼脂粉65gL，pH值调至58-60。 在草莓茎尖的扩大繁殖阶段，采用MS培养基附加6-BA05mg/L、NAA001mgL。扩大繁殖主要是将丛生苗分块即每5-7株切成一块，转入继代培养基。在转苗过程中，去掉原生叶片有利于新苗分化，在扩大繁殖中随时清除愈伤组织，有利于新苗增殖和生长。 诱导生根培养基用12MS附加不同浓度IBA。试验表明：以IBA01mgL的浓度处理的生根率最高，为100，平均根条数为24条。不加TBA及IBA浓度超过02mgL，多数苗都是先于苗基切口处产生愈伤组织，随后在愈伤组织上分化生根，致使成活率大大降低。 2、操作技术要点及培养条件 (1) 灭菌与接种 预处理为了灭菌彻底，常把接种材料先进行湿润处理，使灭菌剂能顺利地渗入材料。可用多种湿润剂，我们采用的是75的酒精，湿润的时间为半分钟至1分钟。 灭菌处理在草莓组织培养中常用灭菌剂的种类很多。我们曾用过次氯酸钠10水溶液(含有效氯04-05)，浸泡接种材料10-15分钟；次氯酸钙(漂白粉)，用其饱和上清液，浸泡接种材料15-30分钟；过氧化氢10-12水溶液浸泡10-20分钟；新洁尔灭5-10水溶液，浸泡10-15分钟；升汞01水溶液，浸泡8-10分钟。其中前4种灭菌剂对接种材料比较安全，但因灭菌时间较长，常常使接种材料的外层氧化变褐，以致影响培养效果。升汞有很强的杀菌能力，但浸泡时间稍长会造成接种材料中毒。因此，在草莓组织培养中，如把握好 时间，升汞是应用较多的灭菌剂。灭菌后的接种材料，要用无菌水充分清洗，通常要换水3-5次。 接种以培养无病毒苗为主要目的的草莓组织培养，所接种的茎尖材料很小，在接种时首先要求准确熟练地剥取茎尖生长点，并使用固体培养基比较适宜，接种时应注意不能将整个茎尖埋入培养基中。培养基须用1-11大气压热压灭菌20分钟。 从材料接种到生根苗长成，这期间的培养温度一般应稳定在252。每日光照12小时，光强以2000Lx为宜。培养室温度在18-26范围内，瓶苗可以正常生长及发根，但在28以上时，绿苗普遍变黄，生根率降低，根尖发黄老化，幼苗易产生玻璃化现象。 1、 移栽技术 试管苗的苗龄为15天，主根长15cm左右，白色无须根，移栽成活率可达90-100。移栽前要将培养瓶从培养室中取出置于自然条件下，打开瓶盖进行透气锻炼。2、 24小时后，从瓶中取出幼苗，清除干净根部及根颈处的培养基，栽入苗圃或穴盘中进行驯化。基质可采用经过灭菌处理的腐熟的锯木屑或腐叶土，也可采用经过灭菌处理的由蛭石与珍珠岩按体积计以1：1比例配成的混合物，或园土与煤渣按体积计以2：1比例配制成的混合物。 2、提高移栽成活率的关键 选择不定根直接生自茎基，根多且粗壮，叶片在3片以上，叶大、厚、深绿的生根苗，成活率普遍较高。栽培基质要用清水冲洗干净，或用多菌灵或甲基托布津掺拌灭菌，用煤渣作基质时，还要用02冰乙酸中和使碱性降低。移栽时采取“深栽浅埋”。深栽就是在移栽时根要栽得深，浅埋的标准是使小苗的根颈与土表平齐，或略高于土表。注意控制光照与温度、湿度。小苗移栽后，放在温室内或塑料拱棚内培养，温度控制在15-20，湿度维持在80左右为宜。同时由于刚移栽的小苗茎杆脆嫩，应尽量采用喷雾状浇水，水量也不宜过大，落干后再喷。遮光50，一周后，可逐渐增强日光照射。草莓茎尖培养脱毒快繁技术研究1 材料与方法1. 1 材料 红颊草莓匍匐茎来自温室草莓植株。1. 2. 1 材料预处理自田间选取健壮的红霞草莓母株上生长充实而小叶尚为展开的匍匐茎顶端23 cm长的顶芽先用小镊子摘除匍匐茎的外部大叶,用流水冲洗3090min,在超净台上进行灭菌处理。先用75%酒精消毒30s ,再用无菌水冲洗35 次, 然后用0.1%的升汞溶液处理，不同的消毒时间,最后用无菌水冲洗56 次。接种150支MS培养基的试管，每个处理接50支。进行观察，记录数据。1. 2. 2 诱导分化培养 在超净工作台上剥取0.5mm 的草莓茎尖生长点,接入诱导分化培养基中。诱导培养基配方有以下6种：A1：MS+6-BA1.0mg/l+NAA0.01mg/L A2：MS+6-BA1.0mg/l+NAA0.05mg/L A3：MS+6-BA1.0mg/l+NAA0.1mg/L A4：MS+6-BA2.0mg/l+NAA0.01mg/L A5：MS+6-BA2.0mg/l+NAA0.05mg/L A6：MS+6-BA2.0mg/l+NAA0.1mg/L 1. 2. 3 增殖培养 把2号配方诱导分化出的草莓小苗转接入不同配方的继代增殖培养基,每种配方10个培养瓶，每个配方500ml。用不同颜色的绳子扎瓶口区别不种处理。接种时把芽团分细小些,约5株/瓶，在增殖培养过程中需30 d 左右继代1 次,并记录组培苗的增殖情况。继代增殖培养基配方为B1：MS+6-BA1.5mg/L+IBA0.15 mg/L;B2：MS+6-BA1.5mg/L+IBA0.2 mg/L;B3：MS+6-BA1.5mg/L+IBA0.25 mg/L1. 2. 4生根培养 把继代增殖的60天后的芽丛接入到不同生根培养基的配方，生根培养基配方有：C1：1/2MS+IBA0.1mg/LC2：1/2MS+IAA0.1mg/L C3：1/2MS+NAA0.5mg/L+白糖15g/L 13培养条件以MS为基本培养基（1L),则用不同移液管量取大量元素、微量元素、铁盐、有机酸等备用。将搪瓷杯放于电炉上加热，称取琼脂9g，用剪刀剪碎琼脂，放入搪瓷杯中，用玻璃棒不停搅拌，使琼脂完全溶