静注人免疫球蛋白ACA测定影响因素分析.docx

医学院药学院2011届药学本科学位论文静注人免疫球蛋白抗补体活性（ACA）测定影响因素的探讨 学 生： 年 级： 2011级专 业： 药 学指导教师：制药工程硕士研究生；副主任技师实习地点： 2014 年 03月 10日1目 录摘 要 21. 前 言 2 2. 材料与方法 2 3. 结 果 44. 讨 论 5参考文献 5 静注人免疫球蛋白抗补体活性（ACA）测定影响因素的探讨摘要：静注人免疫球蛋白(pH 4)(IVIG)是XXXX有限公司生产的具有多种抗体活性的血液制品，因具有广泛的应用价值而受到临床重视。其低pH 值能更好地保证Fc段生物学活性，一般认为少量的IgG 多聚体能暴露出Fc段补体结合位点，从而促使抗补体活性(ACA)产生1-2。ACA 是IVIG中一项重要的指标，它指IVIG 中IgG 多聚体在没有结合抗原的情况下，激活补体的能力。IgG 多聚体通过激活补体使补体消耗，从而使机体的免疫防御能力下降。头痛、潮红、颤抖、背痛、恶心是较常见的不良反应症状3。因此，ACA的高低对IVIG 的质量起着至关重要的作用。据文献报道4，影响ACA 的因素可能与IgG 多聚体含量、Na 浓度、pH 值、葡萄糖的浓度有关。据此，我们进行了研究。另外，还研究发现枸橼酸含量对ACA 也有一定影响。本文就以上因素对其进行实验分析。关键词：静注人免疫球蛋白(IVIG) 抗补体活性（ACA）1.前言静注人免疫球蛋白（PH4）主要组成成分本品蛋白质中95%以上为免疫球蛋白，为无色或浅黄色澄清液体，可带轻微乳光。含有广谱抗病毒、细菌或其他病原体的IgG抗体，另外免疫球蛋白的独特型和独特型抗体能形成复杂的免疫网络，所以具有免疫替代和免疫调节的双重治疗作用。经静脉输注后，能迅速提高受者血液中的IgG水平，增强机体的抗感染能力和免疫调节功能。静注人免疫球蛋白抗补体活性含量检测按中国药典2010版三部附录IX K进行测定。2.材料与方法：2.1实验材料2.1.1试剂2.1.1.1氯化钠购白天津海光药业有限公司；2.1.1.2葡萄糖购白天津海光药业有限公司；2.1.1.3枸橼酸购自湖南尔康制药有限公司；2.1.1.4钙镁离子贮备液、巴比妥缓冲贮备液、明胶巴比妥缓冲液、阿氏液均自制；22.1.1.5 IVIG(pH 4)样品为本公司用低温乙醇分离法生产的，抽取3批，批号分别为20130301、20130302、20130303。2.1.2仪器2.1.2.1 721型可见分光光度计为上海第三分析仪器厂产品；2.1.2.2 501型超级恒温水浴箱为上海市实验仪器总厂产品；2.1.2.3 660PH 计为上海英格仪器厂产品；2.1.2.4 LambdaBIO 紫外分光光度计为美国PE公司产品。2.1.3 实验动物2.1.3.1 豚鼠15只，雄性，年龄40d，体重400500g，健康状况良好；2.1.3.2 兔子，2个月龄，雄性，体重1200-1500g，健康良好；2.1.3.3 绵羊，雄性，体重33Kg ，健康。以上动物均由XXXX有限公司提供。2.2 实验方法2.2.1 豚鼠血清(补体)的制备对豚鼠进行心脏采血，放入大试管中，待血凝固后，取出血清，4 离心除去血细胞，制备混合血清，尽快分装，一70 保存，也可冻干保存。豚鼠血清每1 ml中的补体总活性应不低于200CH50。2.2.2 溶血素兔抗羊红血球血清。用羊红血球免疫兔子，使兔子产生抗体，分离血清制得。2.2.3 绵羊红血球 由绵羊颈静脉无菌采集全血与等体积的阿氏液混合，无菌分装于试管中，4 保存1周后方可使用。如未污染细菌可用4周。2.3检测方法2.3.1 ACA 测定 按照中国药典2010年版三部附录IX K 中的方法测试3批样品。2.3.2 多聚体含量测定采用中国药典2010年版三部附录III B 高效液相色谱法(HPLC)进行分析，根据峰面积计算IgG 多聚体含量。3. 结果：3.1 IgG多聚体含量对ACA测定的影响 将3批IVIG 样品放入60 恒温水浴中加热，使之产生IgG 多聚体，每隔一定时间取样对其IgG 多聚体含量和ACA 测定，结果见表1。结果表明，3批IVIG的IgG 多聚体含量对ACA 测定的影响无显著差异(P005)。3.2 Na 浓度对ACA 测定的影响 将3批IVIG 样品中加入不同浓度的NaCl，将pH值调至71(等电点)，测定其ACA，结果见表2。3批检测结果均表明，随着Na 浓度的增加，WIG 样品中ACA有下降趋势。由此可见，Na 浓度对ACA 测定有一定的影响。3.3 pH值对ACA测定的影响将3批IVIG 样品pH 值调整前和调至71后测定ACA，结果见表3。结果表明，随着pH 值增加至IVIG 等电点，ACA有一定程度的降低。由此可见，不同pH 值对ACA 的测定有一定影响。3.4 不同浓度的葡萄糖对ACA测定的影响将3批IVIG 样品中分别加入不同浓度葡萄糖做保护剂，测定其ACA，结果见表4。结果表明，加入浓度为5 的葡萄糖做保护剂时ACA 最低。此结果与文献嘲中结果一致。3.5枸橼酸对ACA测定的影响将3批IVIG 样品中分别加入不同浓度枸橼酸，测定其ACA，结果见表5。结果表明，加入枸橼酸可以使ACA升高。4. 讨论：从实验结果可以看出：(1)IVIG 中IgG 多聚体含量对ACA 测定结果没有显著影响，与文献 1结果一致，但我们认为ACA 的产生不仅与IgG 多聚体含量有关，还有其他未探明因素；(2)Na 浓度，pH 值和葡萄糖的浓度均对ACA 测定有一定影响。其中，随着Na 浓度的增加，IVIG 样品中ACA 有下降趋势；pH 值增加的过程中，ACA 有降低趋势；5 的葡萄糖做保护剂时ACA 最低。这与文献5-6 研究结果一致：(3)生产上在制作pH 40的IVIG 过程中，实验证明，用枸橼酸调整反应的pH 值能使IVIG 中ACA 增高，甚至超出测定范围，用半透膜透析法超滤除去反应过程中加入的枸橼酸则明显能使ACA 降低。所以，一般生产上采用HC1来控制反应中的pH 是有一定道理的。但加入微量的枸橼酸即能使ACA有较大波动，其原因还有待于进一步探讨研究。X表1 IgG多聚体和ACA 的关系制品批号 20130301 20130302 20130303IgG多聚体含量（%） 0.91 4.01 7.11 0.81 4.17 7.03 0.88 4.33 6.97ACA（%） 16.5 17.1 16.4 11.9 11.7 12.1 17.5 18.1 17.3表2 Na+浓度和ACA 的关系制品批号 20130301 20130302 20130303Na+浓度（%） 0 0.3 0.6 0.9 0 0.3 0.6 0.9 0 0.3 0.6 0.9ACA（%） 16.4 15.3 14.3 13.9 8.2 7.9 6.2 3.1 17.3 16.4 13.4 11.8表3 pH 值和ACA 的关系制品批号 20130301 20130302 20130303pH 值（%） 3.98 7.21 4.01 7.12 4.05 7.08ACA（%） 17.2 10.8 9.6 5.4 15.2 12.8表4 葡萄糖浓度和ACA 的关系制品批号 20130301 20130302 20130303葡萄糖浓度（%） 3 4 5 6 7 3 4 5 6 7 3 4 5 6 7ACA（%） 20.1 19.4 16.4 11.8 10.8 16.5 15.4 11.8 8.7