生化制药1.doc

胰蛋白酶的生产工艺工艺过程:a。预处理:将新鲜或冻胰脏在阴凉处剪去脂肪和结缔组织，用清水洗净，切成小块，用绞肉机反复搅拌数次得胰糜。b 提取:将胰糜移入搪瓷缸中，加两倍体积自来水，在搅拌机下加入1mol/L硫酸溶液，调节ph至3.0间歇搅拌18-20小时，然后压滤提取液，收集滤液备用。滤渣再加一倍体积水搅拌1-2小时过滤，收集滤液，对滤渣再重复提取一次，合并三次滤液。用5mol/h硫酸或氢氧化钠溶液调节ph2.5静止5一6h，在4下过滤，除去杂质，收集滤液。C 盐析制备酶原: 将滤液移入另一搪瓷缸中，搅拌下缓慢加入硫酸铵至75%饱和度，静置8h离心分离 析物，压干，滤饼为粗酶原混合物。 d.酶原的激活: 把滤饼用10倍体积的4冷水溶解，加入氯化钙，用氢氧化纳调节ph8.0，然后加入滤饼重1%量之活力较高的结晶以蛋白酶，4,下静置12h 使酶原激活，立即滤去不容物，收集滤液 (内含大量胰蛋白酶和糜蛋白酶)。 e盐析分离两酶:将上述滤液用5mol/.硫酸调节pH至2.5 搅拌下加入硫酸铵粉末使达40%饱和度。在4下放置8h，收集盐析物(含糜蛋白酶)和滤液(含胰蛋白酶)。. F 胰蛋白酶的制备: 滤液在4下搅拌加入硫酸按粉末，使溶液达75%饱和度，在4下放置8h，过滤收集沉淀即得胰蛋白酶粗品.用预冷至4的 4mo1L、ph9.0的硼酸缓冲溶液溶解粗品，过滤除杂，滤液1mol/L的氢氧化钠溶液调节ph至8. .4下放置8h，当有大量沉淀再加入1/4倍体积的预冷至40.2 mol/L、ph8.0的的硼酸缓冲液，使沉淀分散。然后放置使其结晶，大量沉淀出现后离心分离沉淀或冻干，得到结晶胰蛋白酶蛋白酶胰岛素(2)生产工艺过程与控制 提取 冻胰块用刨胰机刨碎后加人2.3一2.6倍的86%-88%的乙醇和5%的草酸，在13-15搅拌提取3h，离心。滤渣再用1倍量的68%-70%乙醇和0.4%的草酸提取2h离心，合并乙醇提取液。 碱化、酸化 提取液在不断搅拌下加人浓氨水调节ph8.0-8.4立即进行压.滤，除去碱性蛋白，滤液应澄清，并及时用硫酸调节ph3.6-3.8,降温至5，静静置时间不少于4h使酸性蛋白完全沉淀。减压浓缩 吸取上清液至减压浓缩锅内，下层用帆布过滤，弃沉淀滤液并入上清夜30以下减压去乙醇，浓缩至相对密度（1.04-1.05） 去脂、盐析 浓缩液转入去脂锅内在5min内加热至50后，立即用冰盐水降温至5，静置3-4h，分离出下层澄清液。用盐酸调节Ph至2.3 -2.5 ,于20-50度下搅拌加入27%的固体氯化钠，保温静置数小时，析出物即为胰岛素粗制品。 精制 盐析物按重量计算，加入7倍体积的蒸馏水溶解，再加人3倍体积的冷丙酮用4mol/L氨水调节ph至4.2-4.3.，然后补加丙酮，使水溶液中水与丙酮的比例7;3.充分搅拌后低温5下放置过夜，次日离心得上清液。 在上清液中加人4mol/L的氨水调pH至6.2 6.4，加人3. 6%的醋酸溶液(浓度为20%)，再用4mol/L的氨水调pH至6.0，低温放置过夜，次日过滤的滤液。 结晶 将过滤液的沉淀用冷丙酮洗涤得到干品，再按干品质量每克加2%柠檬酸50ml,醋酸锌溶液2ml、丙酮1 6rnl，并用冰水稀释至100ml，溶解5以下用氨水调节pH至8.0。，迅速过滤。滤液立即用10%的柠檬酸溶液调节ph至6.0补加丙酮使终浓度为I6%，慢速搅拌3-5h使结晶析出。在显微镜下观察，有结晶析出时再放置5左右的低温下3-4d至结晶完全析出.离心收集晶体，并小心刷去上层灰黄色无定形沉淀，用蒸馏水或醋酸馁缓冲液洗涤，再用丙酮、乙醚脱水，离心后再五氧化二磷真空箱中干燥，即得结晶胰岛素。 (三)质量检验 胰岛素效价测定一般用家兔血糖降低法或小鼠血糖降低法测定。规定产品每毫克效价不得低于26u.胰蛋白酶（从猪胰残渣中提取）2)从猪胰残渣中提取 工艺路线:工艺路线见图 工艺过程: A.提取:将提取胰岛素后的猪胰渣投入搪瓷缸中，加入10倍左右水，搅拌下用盐酸调节ph2.5-3.2 。.在室温温下间歇搅拌20h离心分离，收集提取液备用。 B.盐析:在搅拌下，缓慢向提取液中加入硫酸按粉末，使达75%饱和度，4下静止8h，滤出上清液 沉淀滤干，得盐析物。 C，激活:将盐析物置搪瓷桶中，加入十倍量水，缓慢搅拌使其全部溶解，缓慢加入氯化钙粉末 用氢氧化钠调节P至8.0，加入滤干盐析物重之1%的胰蛋白酶，4下静止8h使酶原激活 D 去杂质:将激活液过夜，去除硫酸钙沉淀，用.2.5MOL/L,硫酸溶液调ph2.5静止8h 后除去杂质收集滤液。E. 二次盐析:搅拌下慢慢向滤液中加入硫酸铵粉末至75%饱和度，4下静置8h,滤出上清液，收集盐析物F. 透析 :将盐析物加入2倍体积4的0.001mol/L盐酸溶液中，调节Ph 3.0, 4下堆0.001mol/L的盐酸溶液透析除盐，收集透析好的酶液。G. 柱层析:先将透析好的酶液用0.0lmol/L、ph5.0的枸橼酸钠缓冲液透析平衡过两次去除杂质，将滤液上CM-C甲基纤维素柱先用构椽酸钠缓冲液平衡好)，用0.0lmol/L、ph5.0的枸橼酸钠缓冲液透析，洗脱，流速4 O ml/1h 洗至流出液无色为止。.H.制备糜蛋白:：，用0.0 5 mol/L PH5.0的拘椽酸钠缓冲液进行洗脱，洗脱液中加入硫酸铵粉末至50%饱和度，盐析过夜，收集盐析物，用0.01mol/L盐酸透析除盐，冷冻干操，即得糜蛋白酶。 I. CM-C羟甲基纤维素从柱中倒入搪瓷桶中，加入1.5倍体积的0，1 mo1/L PH6.O的枸橼酸钠缓冲液，试问搅拌洗脱1 .5小时，收集洗脱液(CM-C可再生使用)，加入硫酸钱粉末至75%饱和度，盐析过夜4，过滤收集盐析物，用O.O1moI/L盐酸透析除盐，冷冻干燥，即得糜蛋白酶干粉。工艺讨论：A.目前提取糜蛋白酶主要有两种途径:一是从动物胰肠中直接提取;二是从猪胰残渣中提取。本文介绍的工艺均为同时提取两种酶，并利用了猪胰残渣废料，综合利用价值高，且工艺比较简单、深产成本低，具有广泛的实用性B 本工艺基于两种酶原可被胰蛋白酶激活的原理，采用硫酸该粉末至75%饱和度一次盐析法，得到的盐析物，在经激活后分离提取产品。整个操作在低温下进行C. 由于钙离子可促进酶原激活并且对酶用稳定作用，故激活中加入氯化钙，可以按所得半干盐析物重量的四分之一作为硫酸铵重量，再根据溶于水之后体积计算出硫酸铵的浓度。所加氯化钙的粉末除抵消硫酸重量外，还需要多加