饲料中植酸酶活性测定方法探讨.doc

饲料中植酸酶活性测定方法探讨摘 要:参照国标测定植酸酶活性的方法,研究了钼黄法和钼蓝法的稳定性及植酸酶活性测定时反应体系中缓冲液、pH值以及Cu、Zn、Mn金属离子对酶活性的影响。结果表明:钼黄法与改进后的钼蓝法稳定性没有明显差异,但钼蓝法更适合微量磷的测定;柠檬酸盐缓冲液作为植酸酶酶解反应的缓冲体系时显色的稳定性较差;反应温度、pH及Cu、Zn金属离子对酶活性影响较大,测定植酸酶活性时需要严格控制反应条件,屏蔽金属离子的干扰。关键词:饲料;植酸酶;活性;测定 目前,植酸酶制剂在畜禽饲料生产中已得到广泛应用,但饲料中植酸酶活性的测定方法还存在一些争议。2002年,国家颁布了饲用植酸酶活性的测定方法标准(GB/T 18634)2002),该标准注明其适用于饲料添加剂用的植酸酶产品,也适用于添加有植酸酶的配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料,但配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料成分显然更为复杂,其适用性受到质疑1。因此,关于饲料中植酸酶活性测定方法问题有待进一步研究。1 试验材料与方法1.1 主要仪器与设备电热恒温水浴锅(室温-100e,控温精度?1e)、离心机(最高转速6 000 r/min)、721型分光光度计、分析天平、pH计、磁力搅拌器、0. 22Lm微孔滤膜。1.2 试剂1.2.1 偏钒酸铵-钼酸铵-硝酸显色液方法见GB/T 18634)2002。1.2.2 盐酸-乙酸钠缓冲液方法见GB/T 18634)2002乙酸缓冲液(I)的配制。1.2.3 磷标准溶液将磷酸二氢钾于105e恒温箱中干燥2 h,在干燥器中保存;称取磷酸二氢钾0. 020 3 g,溶解于蒸馏水中定容至100 ml。1.2.4 植酸酶溶液方法见GB/T 18634)2002。1.2.5 植酸钠溶液方法见GB/T 18634)2002。1.2.6 硫酸-钼酸铵溶液量取20 ml浓硫酸(98% )于100 ml蒸馏水中,称取1. 500 g钼酸铵微热溶解于50 ml蒸馏水中,按比例混合待用。1.2.7 抗坏血酸溶液称取5. 400 g抗坏血酸用蒸馏水溶解,定容至100 m,l于4e冰箱保存待用。1.2.8 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液按一定体积比混合0. 1 mol/L柠檬酸溶液和0. 1 mol/L柠檬酸钠溶液,用pH计调节,使其pH值分别至2. 50、3. 50、4. 50、5. 50、6. 50、7. 50。1.2.9 SnCl2-甘油溶液称取2. 501 g SnCl2溶解于100 ml甘油中,避光保存,溶液可稳定数周。1.2.10 钼酸铵-硫酸-酒石酸氧锑钾显色液量取硫酸-钼酸铵溶液150 m,l称取0. 070 g酒石酸氧锑钾溶于20 ml蒸馏水,将以上溶液混合待用。1.2.11 三氯乙酸溶液量取三氯乙酸15 ml用蒸馏水定容至100 ml。1.2.12 硫酸锌溶液称取0. 088 5 g ZnSO4#7H2O于100 ml容量瓶中,用pH5. 50盐酸-乙酸钠缓冲液溶解并定容至刻度,摇匀。1.2.13 硫酸铜溶液称取0. 078 2 g CuSO4#5H2O于100 ml容量瓶中,用pH5. 50盐酸-乙酸钠缓冲液溶解并定容至刻度,摇匀。1.2.14 硫酸锰溶液称取0. 061 5 g MnSO4#H2O于100 ml容量瓶中,用pH5. 50盐酸-乙酸钠缓冲液溶解并定容至刻度,摇匀。1.3 试验方法1.3.1 植酸酶活性单位的定义国家标准GB/T 18634)2002定义:植酸酶样品在植酸钠浓度为5. 0 mmol/L、温度37e、pH值5. 50的条件下,每1 min从植酸钠中释放1Lmol无机磷,即为一个植酸酶活性单位,以/U0表示。1.3.2 测定原理钼黄法(偏钒酸铵法)原理:植酸酶在一定温度和pH值条件下,水解底物植酸钠,生成正磷酸和肌醇衍生物,在酸性环境中,用钒钼酸铵处理生成黄色复合物,在415 nm波长下进行比色分析。钼蓝法原理:植酸酶在一定温度和pH值条件下,水解底物植酸钠,生成正磷酸和肌醇衍生物,在酸性环境中,用钼酸42 万 丹等:饲料中植酸酶活性测定方法探讨/2007年第11期铵处理生成蓝色复合物,在810 nm波长下进行比色分析。1.3.3 钼蓝法反应条件的探讨1.3.3.1 SnCl2-甘油溶液和抗坏血酸-酒石酸氧锑钾作反应体系还原剂的比较分别取磷标准溶液2 ml放至4个50 ml容量瓶中,分A、B组,每组2个平行样。A组分别加入4 ml钼酸铵-硫酸-酒石酸氧锑钾显色液, 1 ml抗坏血酸溶液,定容至50 m;l B组分别加入4滴SnCl2-甘油溶液, 2 ml硫酸-钼酸铵溶液,定容至50 ml。均在室温下静置20 min,于810 nm波长下测定其吸光值。1.3.3.2 反应体系的温度及加热时间的探讨以酒石酸氧锑钾-抗坏血酸作还原剂,试剂的添加量同3. 1. 3. 1中A组,定容摇匀后分别在40、50、60、70和100e下加热5、10和15 min,立即冷却至室温,测定吸光值。1.3.3.3 钼黄法与钼蓝法比较参照国家标准GB/T 18634)2002植酸酶活性测定方法,取3 ml植酸钠溶液和0. 1 ml植酸酶溶液,再加入9 mlpH 5. 50的盐酸-乙酸缓冲液,分别用钼蓝法和钼黄法进行比色分析。1.3.4 不同反应体系条件对植酸酶活性测定影响1.3.4.1 缓冲液取3 ml植酸钠溶液和0. 1 ml植酸酶溶液于比色管中,分别加入9 ml pH 5. 50的盐酸-乙酸钠缓冲液和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液于37e电热恒温水浴锅加热30 min。到达设定时间后立即从水浴锅中取出,并加入4 ml三氯乙酸溶液终止反应。取反应后混合液0. 25 ml于50 ml容量瓶中,加入钼酸铵-硫酸-酒石酸氧锑钾显色液4 ml和抗坏血酸溶液1 m,l定容。在50e电热恒温水浴锅中水浴加热15 min后立刻冷却至室温,在810 nm波长处测定吸光值。1.3.4.2 pH值对植酸酶活性的影响设置6个平行,分别加入的盐酸-乙酸钠缓冲液的pH值为2. 50、3. 50、4. 50、5. 50、6. 50、7. 50;其余操作同1. 3. 4. 1。1.3.4.3 不同浓度Cu2+、Zn2+、Mn2+对植酸酶活性的影响试验分3组,每组4个平行。以pH5. 50盐酸-乙酸缓冲液作反应体系的缓冲液,加入硫酸铜溶液、硫酸锌溶液、硫酸锰溶液分别为0. 0、0. 1、0. 2和0. 3 m;l其他试剂添加量及操作步骤同1. 3. 4. 1。2 结果与讨论2.1 钼蓝法的改进及改进后的效果用未经改进的钼蓝法测定磷含量时显色稳定性如图1所示。图1 未经改进的钼蓝法稳定曲线由图1可见,随着时间的变化,吸光值逐渐升高, 110 min还未能达到稳定状态。针对钼蓝法显色不稳定的缺点,本试验通过在反应中添加还原剂、改变反应温度和加热时间等措施对钼蓝法进行改进。结果表明,相同条件下,使用SnCl2-甘油溶液作还原剂时,显色稳定性较差,使用钼酸铵-硫酸-酒石酸氧锑溶液作还原剂时,显色稳定性得到提高,而使用酒石酸氧锑钾-抗坏血酸作还原剂显色稳定性最好。在选用酒石酸氧锑钾-抗坏血酸作还原剂时,改变反应温度和加热时间,其对显色反应的影响结果如图2所示。图2 加热温度及时间对显色反应的影响由图2可知,在加热温度为5060e、加热时间为515 min时,显色反应比较稳定。在50e水浴10 min,冷却至室温后开始计时,得到的吸光度-时间关系曲线见图3。图3 改进后的钼蓝法稳定曲线由图3可见,在该反应条件下显色稳定,且稳定时间可达2 h(图3中仅标出了70 min内的显色情况)。改进后的钼蓝法与钼黄法相比,反应更灵敏,反应的稳定性得到提高。2.2 不同反应体系条件对植酸酶活性测定影响结果2.2.1 柠檬酸缓冲液和乙酸缓冲液对植酸酶活性影响由图4可见,用柠檬酸缓冲液作缓冲体系时,吸光值呈下降趋势;而用乙酸缓冲液作缓冲体系时,吸光值在1 h内都很稳定。所以,测定植酸酶活性时缓冲液应选用乙酸缓冲液。本试验的结果与文献2报道的一致。图4 柠檬酸缓冲液和乙酸缓冲液作反应体系缓冲液的比较Kim TW等3报道,选用pH 5. 50柠檬酸缓冲液提取饲料样品中植酸酶,可提高试验结果的精确度;但从本试验的结果来看,柠檬酸缓冲液的显色稳定性较乙酸缓冲溶液差。万 丹等:饲料中植酸酶活性测定方法探讨/2007年第11期43 因此,用柠檬酸缓冲液作为测定植酸酶活性的提取液是否适宜还有待进一步研究。2.2.2 pH值对植酸酶活性的影响由图5可见,在pH5. 50和pH2. 50处各有一个峰值,这与文献2、4报道的基本一致。还可看出,在pH5. 50时虽然有一个峰值,但吸光值较在pH2. 50时小;所以,测定植酸酶活性选pH2. 50较为适宜。图5 不同pH值对植酸酶活性测定的影响2.2.3 不同浓度的Cu2+、Zn2+、Mn2+对植酸酶活性的影响由图6可见,Cu2+、Zn2+离子对植酸酶活性有明显影响,其中Zn2+对酶活有一定的激活作用, Cu2+对酶活有明显的抑制作用;而Mn2+对植酸酶活性影响不大。造成这一差异的主要原因可能与不同金属离子与酶的反应的类型不同造成的。图6 不同浓度Cu、Zn、Mn离子对植酸酶活性测定的影响 大多数金属阳离子可与底物发生强烈的络合作用而抑制植酸酶的活性,但一些金属离子可以作为电子转移载体,起到酶激活剂的作用5、6,这可能是不同的金属离子对植酸酶活性的影响表现出一定差异性的原因。3 小结(1)本试验对钼蓝法进行了改进。结果表明:用酒石酸氧锑钾-抗坏血酸作还原剂,加热温度为5060e、加热时间为515 min时,可以使钼蓝法的稳定性得到提高,显色时间可以稳定在2 h以上。改进后的钼蓝法同样适用于无机磷的测定。(2)柠檬酸缓冲液作为植酸酶的酶解反应缓冲体系,其显色稳定性较差;而乙酸缓冲液较为稳定。因此选用乙酸缓冲液作为缓冲体系较为适宜。(3)反应体系中不同的pH值对植酸酶活性的测定影响较大,应根据不同的酶源选择相应反应体系的pH值。(4)Cu2+、Zn2+对植酸酶活性有较大影响。因此测定饲料中植酸酶活性时(尤其是预混料),应先屏蔽Cu2+、Zn2+的影响,然后再进行植酸酶活性的测定。参考文献1 刘志伟,黄玉亭,张铁鹰,等.国标法测定植酸酶活性存在问题的探讨J.中国饲料, 2006(18) : 2931.2 尹清强,韩 彪,王国强,等.不同的处理条件对植酸酶活力的影响J.饲料工业, 2005, 26 (5): 4142.3 Kim TW, LeiX G. An ImprovedMethod forRapidDeterminationofPhytaseActivity in Animal FeedJ. JAnim Sc,i 2005, 83: 10621 067.4 谭宝玲,陈 丽,冯建文,等.植酸酶活性测定方法J.广东饲料, 2006, 15(5): 4344.5 于洪恩,刘建平,王晓睿.植酸酶在饲料中的应用J.今日畜牧兽医, 2006(1): 1718.6 艾晓杰,金凌艳.植酸酶使用中应注意的问题J.中国动物保健, 2005(11): 4245.(责任编辑:苏 幔) (上接第36页)3.2 对粪便内菌群的影响动物粪便中的菌群种类基本同肠道内的菌群种类保持一致,但在数量上有一定的差异。关于粪样中菌群的情况研究还很少。本研究中粪样内菌群情况同肠道内情况基本一致,添加了中草药、乳酸杆菌和芽孢杆菌的益生素试验组,大肠杆菌对数值极显著低于金霉素组和对照组(P0.01)。但是,粪样内大肠杆菌的数量明显高于肠道内大肠杆菌的数量,而有益菌群的数量均明显低于肠道内的有益菌群2。产生这一结果的原因可能是由于粪便到达动物大肠后,营养物质被大量消耗,乳酸杆菌等有益菌群的生存环境被改变,生长繁殖受到抑制;而大肠杆菌在动物大肠或直肠内得到大量增殖,数量明显增加3。这只是笔者的猜测,具体原因还有待于进一步研究证实。3.3 对免疫器官指数的影响胸腺、法氏囊和脾脏是禽类最重要的免疫器官,其中胸腺是细胞免疫的中枢器官;法氏囊是禽类特有的体液免疫器官;脾脏则是禽类最大的外周免疫器官,参与全身的细胞免疫和体液免疫。中枢和外周免疫器官的发育状态及机能强弱,直接决定着禽类全身的免疫水平。本研究表明,益生素试验组法氏囊指数、胸腺指数和脾脏指数均高于对照组4。试验证明,益生素能明显促进肉鸡免疫器官的生长发育,提高免疫器官(脾脏、法氏囊、胸腺)指数5。其中,添加含有芽孢杆菌的2组免疫器官指数明显高于添加含有乳酸杆菌以及两者菌混合的3、4组,表明含芽孢杆菌的益生素对肉鸡免疫系统有更明显的促进作用。参考文献1 叶 嗣.