β-AP对衰老模型大鼠开场行为及学习记忆能力的影响--上海软隆.doc

-AP对衰老模型大鼠开场行为及学习记忆能力的影响摘要:用D-半乳糖(D-gal) 建立衰老动物模型且海马内微注射AP ,检测各组大鼠开场行为、Y-迷宫分辨学习和一次性被动回避反应的变化的方法,研究-淀粉样蛋白(AP) 对衰老大鼠开场行为及学习记忆能力的影响. 结果是D-gal + NS 组、D-gal +AP 组大鼠在新异环境中自发活动和探究行为减少,学习记忆减退,与NS + NS 组比较有显著性差异( P 0. 05 , P 0. 01) . 该文得出的结论是AP 与D-gal 联合使用可导致脑老化程度加重,学习记忆能力显著减弱.关键词:-淀粉样蛋白; 开场行为; 学习记忆; 衰老-淀粉样蛋白(-amyloid protein ,AP) 是老年性痴呆患者的大脑中特有的一种蛋白,它在老年性痴呆的发病机理中的作用已引起人们的重视. 生化研究表明,-淀粉样蛋白是老年性痴呆患者脑海马和皮层老年斑(SP) 的主要成分,它与AD 的病理形成过程关系密切. 已有报道AP 对正常大鼠海马神经元的毒害作用1 ,2 ,但有关AP 对衰老大鼠的作用,国内外均未见报道,本实验试图在D-半乳糖所致衰老动物模型基础上进行海马内注射AP ,观察其对大鼠开场行为和空间分辨学习以及记忆保持能力的影响.1 材料与方法1. 1 动物和试剂雄性健康SD 大鼠,体重100120 g,AP 为Sigma 公司产品(AP1 -40 ,Lot NO.76H49611) ,D-半乳糖(D-gal) 为上海试剂二厂产品.1. 2 分组和模型建立将大鼠随机分成4 组: 生理盐水NS + NS组; NS +AP 组; D-gal + NS 组; D- gal +AP组. 、组动物腹腔注射D-半乳糖:50 mgkg - 1d - 1 ,连续注射6 周建立衰老动物模型3 ; 、组动物腹腔注射等量生理盐水. 于第4 周进行双侧海马内注射AP , 每侧注射1L (4g/L) ;对照组注射等量生理盐水. 海马定位注射方法:大鼠腹腔注射4 %戊巴比妥钠(40 mg. kg - 1) 麻醉,立体定位仪(日本NARISHIGE SN - 3 型) 上固定,坐标按照图谱4 ,以前囱定位:AP = - 3. 5 mm ,ML = 2. 0mm ,H = 2. 7 mm ,钻开颅骨,用微量进样器垂直进针,每侧注射时间为5min ,留针5min ,缓慢起针,局部消毒后缝合皮肤,肌注抗生素抗感染.1. 3 行为学检测连续腹腔内注射6 周后进行.1. 3. 1 开场行为(open field) 5 :将动物置于圆形开场检测箱底中央的格内,记录其在3 min 跑动(locomotion) 穿过的格数,后肢站立( rearing) 次数、梳理(groo ming) 次数及粪便颗粒数. 比较不同组间大鼠在新异环境中自发行为和探究行为表现的差异.1. 3. 2 Y - 迷宫分辨学习( Y-maze discri minationlearning) 能力检测6 :Y-迷宫为三等分辐射式反射箱. 以大鼠被电击后逃至安全区为一次正确反应,连续10 次测试中有9 次(90 %) 正确反应,定为学会标准. 记录每个大鼠达到学会标准的训练次数. 所有检测过程均由计算机完成.1. 3. 3 一次性被动回避反应(one- t rial passiveavoidance response) 5 :根据大鼠趋暗习性,记录其在通道上的停留时间,即步入潜伏期(step- through latency , STL) ;动物进入暗箱后立即给予电击(0. 3 mA ,5 s) ;24 h 后检测大鼠的STL. 以STL 作为记忆保持的指标,STL越长表明对电击的记忆保持越好. 检测以240 s 为限.本实验数据用( X S .X ( X 表示,组间差异用t检验;一次性被动回避反应采用Mann-whitney 非参数检验.2 结果2. 1 不同组大鼠开场行为观察结果见表1，统计处理表明,在开场行为诸参数中,D-gal +AP 组动物与NS + NS 组比较粪便颗粒数有显著性差异( P 0. 05) ,而跑动格数则极明显减少( P 0. 01) ,前者在新异环境中自发活动和探究反应明显下降,紧张恐惧状态也降低. D-gal + NS组动物跑动格数与NS + NS 组比较也有显著性差异( P 0. 05) . NS + NS 组与NS +AP 组之间虽无显著性差异,但其跑动格数、站立次数均有下降趋势,说明AP 单独使用对大鼠在新异环境中的自发活动及探究行为也有一定影响.表1 -淀粉样蛋白对大鼠开场行为的影响组别 n 跑动格数 后肢站立次数 粪便颗粒数NS + NS 10 86. 6 7. 5 23. 6 2. 3 4. 0 1. 9NS +AP 9 73. 8 9. 6 20. 3 3. 1 3. 1 2. 0D-gal + NS 9 69. 3 9. 8* 18. 8 1. 9 3. 0 1. 6D-gal +AP 9 46. 7 5. 8* 15. 7 2. 2 1. 3 0. 2*P 0. 05 , *P 0. 01 vs NS + NS group ,P 0. 05) ,D-gal + NS 组与NS + NS组比较有显著性差异( P 0. 05) ,而D-gal +PA 组与NS + NS 组比较,达到学会标准所需训练次数极明显增加( P 0. 01) ,说明D- gal 所致衰老模型大鼠的分辨学习能力显著降低,而在衰老动物模型上海马内注射AP 更使学习能力极显著下降.2. 3 一次性被动回避反应从表2 可见D-gal +AP 组记忆保持能力明显下降,电击后24 hSTL 显著缩短,与NS + NS 组和D- gal + NS 组比较有显著性差异( P 0. 05) . 其他组之间比较,差异无显著性,但记忆保持能力呈逐渐降低趋势.表2 -淀粉样蛋白对大鼠步入行为的影响STL (s)组别 电击前 电击后24 h中位数 四分位数 中位数 四分位数NS + NS 24 10 - 35 216 73 - 240NS +AP 25 10 - 29 152 15 - 240D-gal + NS 23 20 - 34 188 55 - 240D-gal +AP 33 22 77 108* 58 - 240*P 0. 05 vs NS + NS group. P 0. 05 vs D-gal + NS group.3 讨论有研究报道,对大鼠连续注射D-半乳糖引起拟衰老效应7 ,可导致动物学习记忆能力下降,脑内超氧阴离子自由基水平增高, 超氧化物歧化酶(SOD) 活性降低,丙二醛和脂褐素含量升高. 这说明D-半乳糖诱发的自由基蓄积引起的脂质过氧化损伤,是产生拟衰老变化的原因,这必然也会引起衰老性脑功能的衰退.AP 是老年性痴呆患者最早出现的典型的病理学特征. 一些学者认为,AP 可引起学习记忆减退、认知障碍等8 ,是AD 各种病理和临床表现的始发因素. AP 具有沉积作用和神经毒性,较高浓度的AP 能引起神经退化和死亡1 ;AP 的神经毒性作用可以增强或加大各种伤害性刺激的细胞损伤效应,此外它还具有直接的细胞毒性9 . 但Morimoto报道,在大鼠海马神经元,单独注射AP 不能产生特定的神经毒性作用,仅能引起少量的神经元变性10 . 无论在体外培养细胞,还是在体内研究中,AP 是否具有神经毒性作用还存在着争议,其原因可能是所用AP 的浓度不同所致11 . 本研究结果表明海马内单独注射AP 不能引起明显的行为学变化,但在衰老动物模型基础上经AP 处理后,可导致动物自发活动及学习记忆行为明显降低,说明D-半乳糖和AP 有叠加效应. 学习记忆是脑的高级功能,学