（生物化学与分子生物学专业论文）bicp0激活bivltr机制的探讨.pdf

摘要 b i c p 0 蛋白为牛疱疹病毒匹基因神所编码的多肽，由6 7 6 个氨基酸残基 组成，与 蚤v 的i a ，o 高度同源，具有富含半胱氨酸和组氨酸的锌指环结构，介 导b i c p 0 同多种蛋白间的相互作用，调节转录、r n a 加工和细胞分裂等过程。 b h v - i 超感染b i v 后，使细胞产生一些细胞因子( 作为对疱疹病毒入侵的应答) ， 这些细胞因子能够促进b 的表达。进一步研究发现，这种激活功能同b l 1 r 上的n f - x b 和a p - 1 效应元件相关。转染抑制实验发现，b i c i 对b i v l l r 上的 n f - x b 位点的激活经由经典的n b x b 信号途径。即，b i a ) 。的介入导致激酶 1 a k l 、【k 的相继活化，琢k 再磷酸化n b x b 的抑制蛋白i 旭n ，进而i x b n 蛋白被泛素化，最终被溶酶体识别降解，释放出游离的n f - x b 二聚体蛋白入核， 结合到效应元件上发挥功能。此外，b i c p o 对b i vl 1 r 的激活还借助了a p _ 1 信 号途径，特异的化学阻断剂p d 9 8 0 5 9 抑制m a p k k 的活性，s p 6 0 0 1 2 5 抑制p 的活性，它们的抑制实验表明，b i c p 0 能够激活m a p k k 和i n k ，活化的j n k 磷酸化a p - 1 二聚体的组成蛋白c - j u n ，激活a p - 1 二聚体复合物，活化的a p - 1 入 核激活靶基因的转录。此外，b i c i ，0 开启的n f - x b 和a p - i 信号途径间存在协同 作用关系，并且b i a ) o 对b i vl 1 r 的这种作用关系具有细胞特异性，需要某些 特定的细胞因子参与。同时，n f - x b 和a p - 1 效应元件对不同反转录病毒l 1 r 的 启动活性也有不同影响，其可在一定程度上被b i v 、b f v 、j d v 等反转录病毒的 反式激活因子激活，表明病毒可以千涉宿主主要的信号通路以实现自身的生存。 关键词：b i c p 0 ，长末端重复序列( u r ) ，n f - x b 信号途径， a p - 1 信号途径，超感染作用 a b s t r a c t t h ep r o t e i nb i c p oe n c o d e d b y t h e eg e n ea 0o fb h v - 1 ，w h i c h i sf o r m e do f6 7 6 r e s i d e n t s ，i sh o m o l o g o u sw i t ht h ei c p 0o fh s v - 1 i tc o n t a i n saz i n cr i n gf i l l g e rw i t ht h e a l t a n g e m e n to fc y s t e i n ea n d h i s t i d i n er e s i d u e s 洫i t sa m i n o - t e m i n u s w h i c hi sb e l i e v e dt 0 a d i a t ep r o t e i n - p r o t e i ni n t e r a c t i o n 、t r a n s c r i p t i o n 、r n a p r o c e s sa n d c e l lp r o l i f e m f i o m b in s u p e f i n f e c t i o n c a u s e st h ec e l l si n f e c t e dw i t hb i vp r o d u c es e v e r a l c y t o k i n e s ( r e s p o n s e st oh e 叩sv i r u si n f e c t i o n ) ，w h i c hi n 咖e n h a n c e t h ee x p r e s s i o no fb i va n d r e l e a s ei tf r o m h t e n c y o r q u i e s c e n c et o 耻i n f e c t i o n f u r t h e rs t u d y s h o w e dt h a tb i c p 0 a c t i v a t e st h eb i v l t rb ym o d u l a t i n gn f - x ba n da p - 1 f r o mt h e e x p e r i m e n to f a c t i v a t e di n n b i t i o nb y51 1 i i i _ 觚t r e p r e s s i v ep l a s m i d s ，w e f o u n dt h a tb i g p 0a c t i v a t e s b i v l t r t 1 1 r o u g hc l a s s i c a ln f - x bp a t h w a y t h et r a n s c r i p t i o nf i c t 。rn f - x b s p s 0 ) i s n o r m a l l ys e q u e s t e r e d i nt h ec y t o p l a s m b y v i m l eo fk sa s s o c i a t i o nw i t h i n h i b i t o rix ba t h es t i m 血o fb i c p oc a nl e a dt ot h ea c t i v a t i o no ft a k i 、i e ka n ds u b s e q u e n t l y p h 0 s p h o 班d o n o ft h es e r i n er e s 话u e s3 2a n d3 6i nix b 8 t h ep 1 0 s f d l 争ix b ai s t h e nu b i q u k i n a t e db ye 3a n dd e g r 址db yt h e2 6 sp r o t e a s o m e t h ef r e e dn f - x b c o m p l e xe n t e r sn u c l e u sa n d a c t i v a t e st r a n s c r i p t i o n f r o mt h ee x p e r i m e n to fp d 9 8 0 5 9 a n ds p 6 0 0 1 2 5 ，w ef o u n dt h a tb i c p 0a c 衲t c $ b i v l t rd l m 咄a p - 1 p a t h v c a ) t o o b i a p oc a l ll e a dt ot h ea c t i v a t i o no fm a p k ka 血hj n k ，t h e nj l , m p h o s p h o r y l a t ec - j u n t h er e s u l ti st h a ta p - 1 c o m p l e x a c l ：i v a t e sa n dw o r k sb yi n t e r a c t i o nw i t ht r e f u r t h e r m o r e ，t h e r ei sac o o p e r a t i o nb e t w e e nn f - x ba n da p - 1p ：i t l l w a 笋t h ea c t i v a t i o n n e e d ss p e c 硷c y t o k i n e s t h ee l e m e n t so fn f - x ba n da p - 1c a ni n f l u e n c et h eb a s i c a c t i v a t i o no fd i f f e r e n tr e t r o v i r u sl t r t r a n s a c t i v a t o ro fb i v 、b f va n dj o yc a r l a c t i v a t et h e mp a r t i a l l y a l lt h e s es h o wv i r u si sa b l e1 ：os u r v i v eb y i n t e d e r i n gt h em a i n s i g n a lp a t h w a y o fh o s tc e l l s k e y w o d s b i c p 0 ，l t kn f - x b , a p - 1 ，s u p e r i n f e c t i o n 2 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文引言 一日l 皇 ，1日 平衡与变化是我们这个世界的根本。任何事物要维系自身的发展，都必须遵循这一 原则，病毒尽管十分微小，却也不例外。享有“超级癌症”和“世纪瘟疫”之称的艾滋 病毒，即人免疫缺陷病毒( h u m a n i m m u n o d e f i c i e n e y v i r u s ，h ) ，便是此间高手。 人免疫缺陷病毒，在分类学上属于反转录病毒科慢病毒属中的灵长类慢病毒群，能 够引起导致全身免疫系统严重损害的传染性疾病。如果病毒变得太过致命，就会威胁到 它唯一能够繁殖的生存环境宿主，故此，病毒与宿主间存在着平衡问题。h i v 病毒 采用了潜伏机制以躲过宿主的免疫体系和其他抗病毒体系，这期间，在血液中只有非常 低水平的h i v - 1 病毒可以检出，雨大多数感染细胞中，h i v - t 原病毒并不表达，从最初 感染到发病可以经历多年，当然，平衡态也非常态，也存在变化。a i d s ( a c q 血d i m m u n o d e f i c i e n c ys y n d r o m e ，获得性免疫缺陷综合症) 病人就有极高感染异源病毒的机 会，尤以疱疹病毒为甚。流行病学研究表明，疱疹病毒的感染能够激活v - 1 的表达， 最终导致病毒大量复制，病人免疫系统崩溃，直至死亡。那么，平衡如何被打破? 病毒 怎样被激活? 成为大家关注的焦点。因此，深入研究病毒与病毒、病毒与宿主细胞的相 互作用，尤其是病毒复制对细胞基因表达的影响，不仅是分子病毒学的重要内容，也是 阐明病毒复制与致病机理的关键，也可为以后的临床治疗提供依据。 1 。反转录病毒 1 1反转录病毒的发现简史 反转录病毒是一个大的姐病毒家族，病毒颗粒直径8 0 1 0 0 n m ，表面具有包膜， 内部含两条相同的正链r n a 基因组，两条m 妊单链逯过5 端非共价结合，形成二聚体。 反转录病毒最重要的特征是：病毒进入宿主细胞后，基因组时妊在反转录酶作用下反 转录成线状双链d n a ，然后该双链d n a 整合进宿主基因组，进而完成病毒的复制、表 达、释放成熟的病毒颗粒。 上个世纪初，人们发现了第一种反转录病毒劳氏肉瘤病毒( r o u ss a r c o m av i r u s ， r s v ) ，引起鸡肿瘤的持续发生，并根据其发现者p e y t o n r o u s 命名。六十年过去了，人 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文引言 们对反转录病毒的了解很少。直到人自血病病毒的发现，反转录病毒才引起人们的注意。 1 9 8 1 年，引起全球恐慌的反转录病毒h 开始蔓延。反转录病毒也随之成为最重要的 病毒之一，反转录病毒的研究从此突飞猛进，成为最热门的研究方向之一。反转录病毒 的研究推动了整个分子生物学研究，分子病毒学的研究也由此逐步走向顶峰。反转录酶 的发现在分子生物学界具有里程碑的作用，它不但对传统的中心法则是一个巨大的挑 战，让人们重新审视了中心法则，也向我们展示了自然界的神奇和多样。反转录酶成为 生物工程中不可替代的工具。关于细胞生长、分化的知识许多来自对致瘤反转录病毒的 研究。反转录病毒载体也如火如荼的发展起来了，成为基因治疗中最有前途的工具之一。 1 2反转录病毒的分类 根据其基因组结构，反转录病毒被粗略的分为两大类：1 复杂反转录病毒2 简单反 转录病毒。所有的反转录病毒都含有3 个主要编码区：嬲( g r o u ps p e d f i ca n t i g e n ) 基因、 ( p o 蜘n e 娜e ) 基因和e n v e l o p e ) 基因。简单反转录病毒只含有以上编码区，复杂反 转录病毒则含有其它非结构蛋白。 根据病毒的进化关系，反转录病毒又进一步被分成七个属( 见表i ) 。除了慢病毒和 泡沫病毒，其他五个属均可导致肿瘤的发生，又被称为致瘤病毒。在致瘤病毒中，除牛 白血病一人嗜t 细胞反转录病毒属外，均属简单反转录病毒。牛白血病一人嗜t 细胞反 转录病毒属，慢病毒属和泡沫病毒属为复杂反转录病毒，基因组编码多种辅助蛋白。 4 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文引言 表1 反转录病毒的分类+ t a b k1c h s s i f i c a t i o no f r e t r o v i r u s 属代表病毒病毒颗粒形态 基因组结构 1 鸡肉瘤病毒劳氏肉瘤病毒球型核心g 型方式出芽简单型 2 哺乳动物b 型鼠乳汁肿瘤病毒球型核心b 型方式出芽简单型 病毒属 3 鼠白血病病毒属莫洛尼鼠类白血病痛毒球型核心c 型方式出芽简单型 4 牛白血病一人嗜t 细人嗜t 细胞白血病病毒球型核心复杂型 胞反转录病毒属 5 d - 型病毒属m a s o n - p f i z e r 猴病毒圆柱型核心d 型方式出芽简单型 6 慢病毒属人免疫缺陷病毒圆锥形核心复杂型 7 泡沫病毒属人泡沫病毒球型核心复杂型 * 引自艾滋病毒及其相关病毒 2 病毒间的相互作用 2 1h s v - 1 与h r v l l 的相互关系 潜伏感染是多种病毒所采取的平衡自身和宿主关系的常见策略。瑚病毒经过吸附、 脱衣壳、反转录，最后整合到宿主基因组上，并在其中建立永久的潜伏感染，此后原病 毒c d n 俳为受感染细胞基因组的一部分，可充当转录的模板并随细胞的分裂而传至子 细胞。然而，由于各种因素的制约，整合后的h v 原病毒可能不被表达或只有很低的转 录水平，直至被激活后，才由潜伏性感染转变为生产性感染。 h i v - 1 病毒感染的细胞中，大多数虽携带有原病毒d n a , 却检测不出病毒的转录本， 根据这段长的潜伏期( 通常称为临床潜伏期) 以及高比例的潜伏感染细胞，推测该疾病 的进展有可能受细胞外共因子的影响。因为a i d s 病人有极高的异源病毒的机会性感染， 尤以疱疹病毒为甚。流行病学研究表明，疱疹病毒的感染能够激活h v l l 的表达。 异源病毒感染影响h i v - 1 生活周期的机制至少有三种。第一种是赢接的，即疱疹病 毒基因产物直接作用于h i v - 1 原病毒的复制和转录。第二种机制是间接的，即疱疹病毒 感染后，使细胞产生一些细胞因子( 作为对疱疹病毒入侵的应答) ，这些细胞因子能够 促进h i v - 1 的表达。第三种机制是病毒抗原引起1 细胞的激活，从而导致t 细胞数目的增 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文引言 加。研究表明，激活的t 细胞不仅有利于h i v 的有效感染，而且还有利于潜伏态h i v - i 原 病毒的表达。最后一种机制较少见，因为疱疹病毒的感染改变了h i v - 1 的细胞嗜性，从 而导致先前不被h i v - i 感染的细胞也被感染。 虽然，h i v - 1 和h s v 同时感染同一个体的情况较少，但是硒v _ 1 仍是研究慢病毒与疱 疹病毒关系的最有价值的模型。 2 2b r v - - 与b i - i v - i 间的相互作用 2 2 1b 病毒 2 2 1 1b r v 病毒发现简史 牛免疫缺陷病毒( b o v i n ei m m u n o d e f i c i e n c y v i r e s ) 简称b i v ，最早发现于美国。b 是 继马传染性贫血病毒( e 掣i n ei n f e c d o ma n e m i av i r u s ，e i a v ) 和羊一维斯纳病毒( v j s n a _ m 如d i v i r u s ) 之后发现的第三种慢病毒。 6 0 年代末，旨在寻找引起牛白血病淋巴肉瘤的病原微生物的广泛研究导致了三种 在形态学和生物学方面各不相同的牛反转录病毒的发现。这三种病毒的共同特点是感染 细胞后可以引起细胞融合，导致形成巨大的多核细胞，即合胞体( s y n c y d a ) ，其中的两种 分别是泡沫病毒亚科的牛泡沫病毒( b o v i n ef o a m y v i n l s ，简称b f v ) 和致瘤病毒亚科的牛白 血病病毒( b o v i n el e u k e m i a v i r u s ，简称b l v ) 。第三种病毒与羊维斯纳病毒十分相似，因而 当时定名为牛类维斯纳病毒。 由于牛维斯纳病毒似乎并不是当时人们努力寻找的地方性b l 、，淋巴肉瘤的病原 体，因而被低温保藏起来，一直没有得到进一步的研究。直至r j s o 年代后期，发现h v 可 以引起a i d s ，给世界以很大震惊。而i - i v - i 是反转录病毒科慢病毒属的一员，因此对b r v 以及整个慢病毒属的研究再度兴起。于是，又重新开始研究被搁置了1 5 年之久的牛维斯 纳病毒。1 9 8 7 年，g o n d a 等人对这一病毒进行了详细研究，发现这一病毒无论是在形态 学、免疫学还是遗传学上都与h i v - 1 和猴免疫缺陷病毒( s i m i a n m m u n o d e f i c i e n c y v i n l s ，简 称s l v ) 十分相似，因此，在其病理学尚不清楚的情况下重新定名为牛免疫缺陷病毒，即 b i v 。 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文引言 2 2 1 z b r v 的生活周期 b 是一种外源性病毒，其复制周期与h i v - 1 2 乏其他反转录病毒相似( 图1 ) 。 图lb 的生活周期 f i g1t h el i f ec y c l eo f b i v + 引自艾滋病毒及其相关病毒 感染过程始于游离病毒通过外膜糖蛋白特异性地吸附到宿主细胞表面的某种受体 上，通过病毒外膜与细胞膜的直接融合进入细胞。这一过程中的细胞受体尚未搞清，穿 膜的机制也有待深入研究。病毒进入细胞后，基因组r n a 和成熟的耐基因产物就从病 毒核心释放到细胞质中，在病毒反转录酶( r e v e r s i bt r a n s c r i p t a s e ，r t ) 和核酸酶的作用下， 将病毒单链r n a 反转录成双链原病毒d n a 。原病毒d n a 与整合酶( i m e g r a s e ，i n ) 一 起被转运到细胞核中，在整合酶的催化下整合到宿主基因组上，随细胞的分裂而复制， 即保持转录沉默状态。在各种细胞和外源性因子的作用下，开始从蚰l 活跃转录。这 种细胞介导的表达被病毒自身编码的t a t 蛋白显著激活。在细胞拼接系统和另一个病毒 编码的蛋白r e v 的作用下，原病毒基因组全长m r n a 被剪切并拼接成片段转运到细胞 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 引言 质中，利用细胞的核糖体进行翻译和加工，产生各种结构基因和辅助基因产物。在出芽 过程中，病毒结构蛋白g a g 、p o l 和e n v 在细胞质膜下与全长基因组r n a 组装成病毒颗 粒，以出芽方式从宿主细胞中释放出来。此时，病毒表面蛋白fs u r f a c ep r o t e i n , s u ) 和穿 膜蛋白( t r a n s m e m b f a n e p r o t e i n , t m ) 插k n o b 膜中。释放后，g a g 前体蛋白在蛋白酶 f p m t e i n a s e ，p r ) 的作用下，剪切成各功能单位，同时病毒变成成熟的有感染力的颗粒。 成熟的病毒颗粒可以开始新的感染周期。 2 2 1 3b i v i 掏l t r b i v 复制的调节依赖于病毒和细胞反式作用因子与其i 亦的相互作用。b i v i 腮与 其它反转录病毒i 脉一样，包括u 3 k 、r 区和u 5 区，其长度分别为3 8 4 b p 、11 1 b p 和9 4 b p ( 图 2 1 。b i vit r 具有典型的真核启动子特点，可以调节基因表达，并具有某些细胞转录因 子结合位点( 如n f _ kb 、s p l 、a p - 1 和a p - 4 ，f 立点) 。u 3 区含有转录起始、增强和终止信 号。转录起始点位于u 3 一瞄合处的+ 1 位的胸腺嘧啶t 处( q r 、他) t 9 9 0 ) 。眍含有w 皿序 列，是b i v 反式激活因子t a t 蛋白的靶序列，两者的相互作用可以显著提高b i v 基因的表 达水平。 图2b i v l t r 的结构图4 f i g u n ：2 t h es a l l c t l l r eo f b r v i t r + 引自艾滋病毒及其相关病毒 通过计算机序列分析，在u 3 区找到了许多潜在的转录因子结合位点，与同族的一致 序列只有一个核苷酸的差异。有趣的是，a p - 3 位点与推测的反转录病毒核心增强子( r c e ) 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 引言 序列连在一起，所以这一位点被称为a p 3 r c e 。此外，一个c a a t b o x 位于删q 也上 游，并与之紧密相连。 f o r g 等人通过缺失分析对u 3 区各转录因子结合位点作了深入研究，发现分别缺失 g r e ( 糖皮质激素效应元件) 、c a a tb o x 、a t f q 也、a p - 4 、a p - 1 均导致基础转录水平 的下降( 无1 t 牡激活) ，即它们均起正调节作用。其中，s p l 或a p - 3 r c e 的缺失效应与细 胞系相关。在( 也1 1 1 细胞中，缺失均导致转录水平上升；而在b l a g 2 0 和e r e p 细胞中却 有所不同：s p t 酗j 缺失不影响转录水平，a p - 3 1 r c e 的缺失则导致转录水平的下降( f o n g , 1 9 9 5 ) 。 b i v l t r u 3 区中的转录因子结合位点的结构组成与h i v - 1 以及其它慢病毒的相似程 度有限。例如，b 只有一个a p 4 和a p - l 位点，而f i v ( s p a r g e r ，1 9 9 2 ) 承1 维斯纳病毒e s e ， 1 9 8 9 ) 贝j 有2 个或者更多。b w r 有一个拷贝的s p l 和n f _ kb 位点，且距丑、t a b o x 相对较 远。而h r v - i 有靠得很近的3 个s p l 和2 个n r * b ，它们距t a t a b o x 都很近。转录因子结 合序列在i 职数量和位置的不同，将会影响病毒复制的速度和致病性。利用i 愿报告质 粒对这些位点进行缺失分析发现，有的序列对病毒的转录极为重要，其中核心增强子区 则是启动子功能绝对必需的。每一特殊的转录因子结合序列在促进基因表达方面相对依 赖于所用的细胞系的种属或组织起源。因此，i l r 与不同转录因子的结合实现病毒在靶 组织中的瞬时和差别表达。 2 2 2b 与b h v 1 二者的关系 对h i v 的研究证实，多种瘸毒可以作为珈感染中的潜在的共因子，其中包括d n a 病毒( 如疱疹病毒中的i - s v 、c m v 、e b v 、h h v - 6 ) ，也有慰妊病毒( 如h f v ) 。大量的实 验证据表明，蛐与这些病毒之间有相互作用。舡清流行病学发现b i v 与其他病毒的交 叉感染普遍存在，如b i 、b v d b 、b h v - i 常在牛群中发生交叉感染，并给养牛业带来 重大的经济损失。推测b 可能与 丑v - l 一样，可以因与其它病毒的超感染而激活。 b h v - 1 属疱疹病毒科的疱疹病毒亚科( m p h a h e r p e s w i m s a n a e ) ，可引起牛的呼吸系统 疾病、流产、结膜炎，是养牛业的重要病害之一。在成熟病毒颗粒中，b i - - - w - 1 基因组是 1 3 8 k b 的线性双链d n a ，分成u ( 1 0 5 幽) 、u s ( 1 1 5 k b ) 两个区。u s 两侧为i r s ( 1 1 曲) 和 9 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文b l言 n 峪( 1 l k b ) 。在细胞中作为模板的b h v - i 基因组则是环状分子，复制得到的d n 肭首尾 相连的多连体，经切割后得到单位长度的b h v - 1 基因组d n a 。 b h v - 1 基因表达分为三个时期：早早期( i m m e d i a t ee a r 蜘i e ) 、早期( e a r l y , e ) 和晚 期( 1 a t e ，l ) 。病毒感染开始至感染后2 h 为早早期，该时期不依赖于新合成的病毒蛋白， 主要合成用于核酸代谢的病毒蛋白。晚期由5 h 延至细胞完全裂解，该时期内合成病毒结 构蛋白、复制病毒d 2 姐、组装病毒颗粒。 1 9 9 2 年，g e n g 等首次报道b h u l 可激活b i v 。不同剂量的b h v - 1 超感染可使b 感染 的e b l 细胞上清中的r 舌性提高，且提高程度与b h v - 1 的感染量成正比，暗示b h v - 1 的 存在使b 表达增加( g e n g ，1 9 9 2 ) 。 在强v 激活h i v 的研究中已经证明， b v 早早期基因产物i c p 0 和i c p 4 介导了这种激 活作用。为证明b h v - 1 激活b i v 是否与b i a o 、b i c p 4 相关，梁臣等通过克隆和转染等方 法分析了它们对咖憩功能的影响( 梁臣等，1 9 9 5 ) 。发现：含有完整的b i c p 0 和b i ( 卫4 的p 6 0 1 片段能低水平激活b i 胁t 的表达( 1 7 倍) ，由于b i c p 0 与b i c l p 4 由同一启动子起 始，经不同的剪切产生。为区分二者对b i v l l ：r 的影响，分别构建了b i c p 0 及b i c p 4 表达 质粒p 6 0 1 一d 1 和p 6 0 1 - i ) 2 。转染证实只有b i q ，o 可以激活b i vl t r ( 4 4 倍) ，而当b i c p 0 和 b i c p 4 同时存在时，反而使激活水平降低，说明b i q 哺干扰b 1 0 0 的作用。 3 i c p 0 和b i ( 卫o i c p 0 ( i n f e c t e dc e l lp o l x p e p t k l eo ，感染蛋白多肽0 ) 是t - 玛v - i 在病毒复制早期表达的病 毒多肽，它由i e 基因编码，属于首先被转录的n 组多肽。i c p 0 含有一酸性t 末端结 构域，一个g h c 锌指结构，一个核定位信号，两个位于中部的脯氨酸富含区以及一个 磷酸化位点。其中，最重要的结构是位于n 端的锌指结构域，锌指结构域中分布的半胱 氨酸和组氨酸残基组成了多种锌指d n a 结合区。最初认为i q ) o 是借助于这个区域行使 其d n a 结合功能，但后来的研究发现，无论是分离纯化的指环区域还是完整的i c p 0 蛋白，都不与骨q a 直接作用。i 口0 蛋白的主要结构如图3 所示。 1 0 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 引言 1i u n gn l s u s p 7n d l o 7 7 5 i c p 0 图3i c p o 蛋白结构示意图； f i g u 3 am p o f t h e7 7 5 - r e s i d u ep m 妇i c p os h o w i n gi d e 棚矗e df u n c t i o n a le l e m e n t s 含有7 7 5 个氨基酸残基的蛋白确定的功能元件中，最重要的时n 末端锌指环结构( r i n g ) - 此外， 还含有其它的结构，如，m s 核定位信号，u 批扁特定泛素蛋白酶唧相连所需序列，n d l 0 一有 效定位于n d l 0 区域所需序列。 r i n g i n d 幽t b ez i n c 陆l d 堍r d 昭瞬m 。证n i s d n u c l e a r l o c a l i s a f i o ns i g n a j ；咖一s e q u e n c e s 唧血耐f o r 鼬蛾t h e 出q i l 醯s 础k 严呻e u s p t ；n d l o d s e q u e n c e s i e 删r e d f o r 幽c i e 皿j o c a 血痂n 武 n d l o d o m a i n s s e 田h l r h i sr 唁i o n o f t h e p r o t e i n ma l s or e 删f o r s e l f - m u l f i m e r i s a u o n o f t h e p r o t e i n 。引自r 噼r d e v e r e s t , 2 0 0 0 在f e v - i ( h e r p e ss i m p l e x v i r u s g a p e1 ，单纯疱疹病毒i 型) 生活周期中，i c 2 o 蛋白的 作用非常重要。尽管它并不直接影响病毒的生长，但当它缺失时，病毒不能进行有效地 裂解感染。i c p o 参与调节病毒其它早早期蛋白，早期蛋白和晚期蛋白的表达( 见图4 ) 。 在病毒感染过程中，i e 基因首先转录，它们的产物对于启动后期基因的表达十分必需。 在这个进程中，涉及多种水平的调控，其中重要的就是病毒瑾启动子的开启。v p l 6 是 一种病毒颗粒的成分，在c 端含有一个有活性的转录激活区，在病毒感染过程中，扮演 钥匙的角色。同大多数病毒的转录调控因子相同，v p l 6 通过结合宿主调控蛋白行使功 能。病毒i e 启动子中含有细胞转录因子o c t - 1 的结合位点。v p l 6 结合o c t - 1 及另一细 胞蛋白h c f ，形成三聚体复合物。该复合物有力激活匝基因的表达。基因产物 包括i a l o 、i a 珥和i 2 7 等，许多实验室的研究结果表明， 墨v - 1 的早早期蛋白i c p 4 和i a ) o 能够激活病毒和细胞中很多基因的表达，i a 蛋白的作用范围更加广泛。 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文引言 图4 h s v - 1 感染期闻病毒基因表达顺序图例 f i g u r e4 a s i m p l i f i e ds c h e m e o f t h es e q u e n c eo f v i r a lg e n e e x p r e s s i o nd u r i n gh s v - 1 i n f e c t i o n 当存在于病毒包膜上的v p l 6 同细胞因子o c t - 1 厦正启动子特异蛋白h c f 共同形成三聚体复合物，能激活 i e 基因的表达。随后产生的i ( p 0 蛋白进一步打开各种病毒基因的表达。如，对于早期和晚期启动子的转录非常 重要的立即早期蛋白i c p 4 ，影响晚期基因产物高教表达的立即早期蛋白i c i 2 7 。 v p l 6 p r e s e m 缸t b e 罚m h g l m 咖a c 画r a 苎i eg e n e a 胛d o n w b e n c o 邛e 捌w i t h t h e c e l h t a r f a c t o r s o c t - 1a n d h c fa ts p e c i f xs e q u e n c e e k 咖；- t h e i e p r o m o t e n s u b s 鹎u e m p i 。d 眦南o f i a p 0 卸掣1 e n 琏麟p i e 锚i o n o f a 】1c l a s s e s o f 谪d g e n i e p r o t e i n i c p 4 i s e m i a l f o r t h e t r a m c f i t , t i o a o f e a r l y a n d l a t e p m m o t e r s , a a d i e p l x a e i a i c i 2 7 i s m i d f o r d f l c d e n te x p r e s s i o n o f l a t eg e mp z h + 引自r o g e r d e v e r e 2 0 c 0 b h v - 1 同h s v - i 同属于n 疱疹病毒亚科，它是牛的主要病原，也是b i v 最常见的 共因子之一。b h v - 1 基因组全长1 3 5 3 k b ，所含有的7 0 余个基因按表达时期的差异可分 为立即早期基因、早期基因和晚期基因，分别编码a 、b 、y 三类多肽。其中i e 基因 0 所编码的q 多肽b i c 瑚( b h vi n f e c t e dc e l lp o 髓p 潮eo ) 由6 7 6 个残基组成，与h ；v 的i c p o 高度同源，同样的，也含有富含半胱氨酸和组氨酸的锌指环结构( z i n cr i n g f i n g e r ) ， 介导b i c p o 同多种蛋白间的相互作用，调节转录、r n a 加工和细胞分裂等过程。除中 部的核定位信号n l s 外，b i c p 0 的g 端也含有n d l 0 序列，引导它定位于细胞核中的 n d l o ( n u c l e a r d o m a i n l 0 ) 区域。b i ( 卫l o 在b h v - 1 的复制调节中发挥关键作用，不仅能 激活所有3 类b h v 多肽的合成，而且，充当着b h v - 1 基因表达从早期向晚期转换的“开 关”。 4 细胞信号通路 细胞生存状态的变化伴随着不同基因表达模式的改变。一般来讲，基因表达被细胞 外因子严密控制，例如，激素、生长因子、分化因子、生存因子、死亡因子。涉及细胞 细胞相互作用、病毒和细胞的相互作用和细胞矩阵相互作用。细胞外因子提供的信息 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文引言 被特定的受体接受并通过信号转导途径转入细胞，再借助转录因子诱发基因表达模式的 改变。 4 1n f 墙信号途径 n f - m b ( n u c l e a r f a c t o r - x b ，细胞核因子媚) 是一个属于埭族的二聚体转录因子。 n f - x b r e l 家族成员中包括r e l p 0 6 5 ) 、m 、c - r e l 、n f - x b i ( p 5 0 p 1 0 5 ) 、n f - x b 2 ( p 5 2 p 1 0 0 ) ( g h o s h ，s ，m a y , m j a n dk o p p ，e b ，1 9 9 8 ) 。它们的共同点是都拥有一个保守的l 类似 区域( r h d ) ，该区域参与d n a 结合、蛋白间二聚化及同抑制蛋自i x b 的结合。n f - x b 以 多种同源或异源二聚体形式存在，其中最典型的就是由王i c l a ( p 6 5 ) 和p 5 0 组成的异源二聚 体。 在大部分细胞中，n f - x b 是以一种无活性的细胞质复合物的形式存在，同属于i x b 家族的抑制蛋白结合，这个家族包括i 埔“k b 口、和b c 8 8 。这种结合遮蔽了n f - x b 的 细胞核定位信号，使其以无活性状态停留在细胞质中。 多种刺激可激活n f - x b ，包括病毒和微生物感染、暴露于前炎性因子、促细胞分裂 素、生长因子、应激诱发剂和其它刺激等。其间涉及多条信号转导途径，但大多数途径 均集中到m x ( t h ei x bk i q a s e ，b c b 激酶) 上。i k k 是一种复杂亚基复合物，含有两个催化 亚基( i k k a 、i k k | p ) ，这两个催化亚基可以形成同源或异源二聚体，和一个调节亚基 i k i 互- y ( 或n e m o ) ，i k - k - v 本身并不是激酶，但对于i k k 激酶或其它信号蛋白而言起 一种类似连接蛋白的作用。i k - k - y 的完整性对于n f - x b 多重激活十分必需。i k k 复合物 先形成k * i k k - b 异源二聚体，再同i k _ k - y 相联。该复合物的活性依赖i k k - p 亚基上 丝氨酸的磷酸化，上游激酶、i k k 复合物亚基问的转磷作用及负反馈作用，都能调节i k k 的磷酸化。 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 引言 圈5 n f - x b 信号通路 f i g u r e5 t h en f - x bp a t h w a y n f x b 异源二聚体( p 5 0 r e l a ) 在细胞质中被抑制蛋白i 越屏蔽。当受到外界多种刺激时，信号通 路被激插，并交汇于i g g 复合物，i x b a 被活化的i k k 磷酸化，进而被泛素化，最终被溶酶体降解游 离的n f - x b - - 聚体转入细胞核同血元件结合，激活多种靶基因的转录。 i 心- x bh 眦m d i 巧( p s 0 s a r cs e q u m e r e d i n t h ec y t o p l a s m b y i x b 越西h q 。y 掣呲h q m b 曲 s d m u l 撕o n b y s 廿龄女血如c 吨a g 凹晦o r 2 p u 地t o 埘k 明埘。叮c y t a 畦n 酋，m k o g e mo rac e v e f s ea _ , z 邓o f b a c 七e 血1a n d 面越p a t h 。窖邮k d s t o t h e 鹫由撕o no f s 韬1 “d gc a s c a d e sc 叩阳。吕i 口g o n t h e i k kc o 珂p l 瞄 p h o s p h o 咄f i o a o f i x b a b y a c t i v a t e d i k k i s4s i g n a l f o r i t s u b 删o n a n d p r o t e a s o m e - d e p e n d e m d c g r - d d g 血i f r e e d l q f - z b d i r e c t s u a m b c a z e t o t h e a u c l e u s w h e r e d 唧h 耐t o x b d e m e n t sa n da c f i v a z e t h e t r a n s 商p 血n o f a w i 啊o f g e n e s i n v o l v e d i n t h ec o n t r o l o f c e l l p r o l i f e r a t i o n a n ds u r v i v a l , ；- t h e i n f a m m a z o 甲 a n d h n m u n er e s p o m w e l l a s m ”g 出m 【y g ，i n c h d i n g i k b a i t s d f + 引自mg a b r i d hs a n t o r o , 2 0 0 3 1 4 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 i言 n f - x b i x b 复合物在i k k 的作用下，抑制蛋白i v b “n 端3 2 和3 6 位丝氨酸被磷酸 化，接着，在泛素连接酶作用下，b 毋。2 1 位和2 2 位赖氨酸被泛素化，使i x b a 被2 6 s 溶 酶体识别并降解，释放出n f - x b 。游离的n f - x b 进入细胞核，同启动子上特异的d n 序列5 。g g g a ( t r i o g 3 ( x b 元件) 相结合，发挥效用( 见图5 ) 。在上述机制中，i - x b 同n f 心的结合抑制了n f x b 的活性，使其滞留在细胞质中，不能发挥效力。其活性 既通过i x b 亚基的磷酸化，又通过同其它核转录因子和调节蛋白的结合来完成眦 g a b f i e l hs a n t o r o ，d 神。 4 2a p - 1 信号途径 4 2 1a p 1 蛋白二聚体 a p - i ( a c t i v a t o r p r o t e i n - i ，激活蛋白- 1 ) 是最早得到鉴定的反式作用因子之一，能够同 i l - 2 等许多基因的上游区及s v 4 0 的增强子特异性结合，从而激活转录( 朱玉贤等，1 9 9 7o a p - 1 的结合位点称为1 p a 效应元件( t p ar c p o n s ee l e r n e m ，t r e ) ，细胞经佛波酯类化合 物( 如研a ) 处理后会使a p - i 活性增强，进而激活一系列受a p - 1 调节的基因的表达。 a p - 1 是一种二聚体蛋白复合物，由j 1 l 】n 、f o s 、a t f ( a c j - 血峨t r a n s c r i p t i o nf a c t o