葡聚糖凝胶G说明书.pdf

南京森贝伽生物科技有限公司南京森贝伽生物科技有限公司 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 不同规格型号的葡聚糖用英文字母 G 表示 G 后面的阿拉伯数为凝胶得水值的 10 倍 例如 G 25 为每克凝胶膨胀时吸水 2 5 克 同样 G 200 为每克干胶吸水 20 克 交联葡聚糖凝胶的种类有 G 10 G 15 G 25 G 50 G 75 G 100 G 150 和 G 200 因此 G 反映 凝胶的交联程度 膨胀程度及分布范围 实验 实验 葡聚糖凝胶层析葡聚糖凝胶层析 实验目实验目的的 1 掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理 2 学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术 实验原理实验原理 凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤 是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分 离技术 这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法 层析的固定 相载体是凝胶颗粒 目前应用较广的是 具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶 Sephadex 和琼 脂糖凝胶 Sepharose 葡聚糖凝胶层析 是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱 各个组分由于分子量不相同 在 凝胶柱上受到的阻滞作用不同 而在层析柱中以不同的速度移动 分子量大于允许进入凝胶 网孔范围的物质完全被凝胶排阻 不能进入凝胶颗粒内部 阻滞作用小 随着溶剂在凝胶颗 粒之间流动 因此流程短 而先流出层析柱 分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内 阻滞作用大 流程延长 而最后从层析柱中流出 若被分离物的分子量介于完全排阻和完全 进入网孔物质的分子量之间 则在两者之间从柱中流出 由此就可以达到分离目的 本实验以葡聚糖凝胶 G 25 作为固定相载体 来分离蓝色葡聚糖 2000 和溴酚蓝 蓝色葡 聚糖 2000 分子量接近 2 10 6 而溴酚蓝分子量为 670 二者分子量相差较大 前者完全 排阻 而后者则可完全进入凝胶颗粒网孔内 二者通过层析柱的时间不同而分开 实验材料实验材料 1 实验器材 层析柱 1 20cm 附有一小段乳胶管及螺旋夹 洗脱液瓶 带下口的三角瓶 250m1 试管 及试管架 量筒 10m1 721 型分光光度计 2 实验试剂 1 Tris 醋酸缓冲液 pH7 0 南京森贝伽生物科技有限公司南京森贝伽生物科技有限公司 取 0 0lmol L Tris 溶液 含 0 1mol L KCl 900ml 用浓醋酸调 pH 至 7 0 加蒸馏水至 1000m1 2 溴酚蓝溶液 称取溴酚蓝 10 毫克 溶于 5 毫升乙醇中 充分搅拌使其溶解 然后逐滴加入 Tris 醋酸缓 冲液 pH7 0 至溶液呈深蓝色 3 蓝色葡聚糖 2000 溶液 称取蓝色葡聚糖 2000 10 毫克 溶于 2 毫升 Tris 醋酸缓 冲液 pH7 0 中即成 4 样品溶液 取溴酚蓝溶液 0 1 毫升 蓝色葡聚糖 2000 溶液 0 5 毫升混匀后为上柱样 品溶液 5 葡聚糖凝胶 G 25 Sephadex G 25 实验操作实验操作 1 实验凝胶的制备 商品凝胶是干燥的颗粒 使用时需经溶胀处理 称取 4 克葡聚糖凝胶 G 25 加 50 毫升蒸馏水 搅拌均匀 在室温溶胀 6 小时 或沸水浴溶胀 2 小时 一般采 用后一种方法 再用倾泻法除去凝胶上层水及细小颗粒 用蒸馏水反复洗涤几次 再以缓冲 溶液 pH7 0 的 Tris 醋酸溶液 洗涤 2 3 次 使 pH 和离子强度达到平衡 最后抽去溶液及 凝胶颗粒内部气泡 凝胶可保存在缓冲液内 2 装柱 将层析柱洗净 垂直固定在铁支架上 选择有薄膜端作为层析柱下口 将下口接上 乳胶管并用螺旋夹夹紧 层析柱中加入洗脱液 打开下口螺旋夹 让溶液流出 排除残留气 泡 最后保留约 2 厘米高度的洗脱液 拧紧螺旋夹 将凝胶轻轻搅动均匀 用玻璃棒沿层析 柱内壁缓缓注入柱中 待凝胶沉积到柱床下已超过 l 厘米时 打开下口螺旋夹 继续装柱至 柱床高度达到 8 厘米 关闭出口 装柱过程中严禁产生气泡 尽可能一次装完 避免出现分 层 再用洗脱液平衡 l 至 2 个柱床体积 凝胶面上始终保持有一定的洗脱液 平衡后 拧紧 下端螺旋夹 3 加样品 打开螺旋夹使柱面上的洗脱液流出 直至床面与液面刚好平齐为止 关闭下端出 口 取溴酚蓝及蓝色葡聚糖 2000 混合液 0 3 毫升 小心地加于凝胶表面上 切勿搅动层 析柱床表面 打开下端出口 使样品溶液进入凝胶内 并开始收集流出液 当样品溶液恰好 流至与凝胶表面平齐时 关闭下端出口 用少量洗脱液清洗层析柱加样区 共洗涤三次 每 次清洗液应完全进入凝胶柱内后 再进行下一次洗涤 最后在凝胶表面上加入洗脱液 保持 高度为 3 4cm 4 4 洗脱与收集 连接好凝胶柱层析系统 调节洗脱液流速为每分钟洗脱与收集 连接好凝胶柱层析系统 调节洗脱液流速为每分钟 1 1 毫升 进行洗脱 仔毫升 进行洗脱 仔 细观察样品在层析柱内的分离现象 收集洗脱液 每收集细观察样品在层析柱内的分离现象 收集洗脱液 每收集 3 3 毫升即换一支收集管毫升即换一支收集管 试管预先试管预先 编号编号 收集约 收集约 2020 管左右 样品即可完全被洗脱下来 将各收集管中的洗脱液分别用管左右 样品即可完全被洗脱下来 将各收集管中的洗脱液分别用 721721 型分光光度计在波长型分光光度计在波长 540nm540nm 处测定其光密度 处测定其光密度 5 凝胶回收处理方法 将样品完全洗脱下来后 继续用三倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶后 将柱下口放在小烧杯中 慢慢打开 再将上口慢慢松开 使凝胶全部回收至小烧杯中 备用 南京森贝伽生物科技有限公司南京森贝伽生物科技有限公司 实验 实验 凝胶柱色谱分离蛋白质凝胶柱色谱分离蛋白质 实验原理 凝胶色谱是利用某些凝胶对于不同组分因分子大小不同而阻滞作用不同的差异而进行分离 的技术 当溶液在色谱柱内流过时 各种物质分子在柱内同时进行向下的移动和不定向的分 子扩散运动 大分子物质由于分子直径大 难于进入凝胶颗粒的微孔 只能在凝胶颗粒的间隙中随流动相 快速向下移动 而小分子物质能够扩散进入凝胶颗粒的微孔中 因此在流动过程中不断地进 出于胶粒的微孔 这样就使小分子物质向下移动的速度落后于大分子物质 从而使溶液中的 各组分按分子量从大到小的顺序先后流出色谱柱 达到分离纯化的目的 实验用品 1 材料 葡聚糖凝胶 Sephadex G 100