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一种快速高效的基于改进重叠延伸PCR的多点基因突变方法摘要本文将展示一种快速，有效的方法来进行定点突变的重叠聚合酶链式反应（OE - PCR）技术为基础延伸的改进版本。对于这种方法，我们将其称为(M)OE-PCR（重叠延伸PCR）法，方法有五个步骤：（1）由高保真Pfu DNA聚合酶PCR扩增来合成我们感兴趣的个体DNA片段（平均20 - bp的重叠相邻片段）（2）两两混合（每两个相邻的片段混合，以实现没有引物的OE - PCR），（3）预延伸（用没有引物的OE - PCR将以上teams混合来获得完整长度的重组DNA）， （4）从步骤3中得到的有最外层引物的PCR和模板DNA来完成全部目标DNA的合成（5）post-extension（在72摄氏度下实现PCR的10次annealing和延伸）。该方法快速，简便，无差错。它提供了一个有效的选择，特别是针对DNA的多点突变，以及它理论上可以应用于任何DNA片段的修改。使用MOE- PCR方法，我们已经成功同时获得了具有八个稀有密码子优化的sam1基因。简介定点特定的DNA突变在基因工程中是一种非常重要的工具。改变DNA序列能促进对DNA ，RNA或蛋白质编码的DNA序列结构与功能关系的研究。通过Higuchi等人（1988）的描述，多种方法已经在DNA序列中预定点的特定碱基变化上得到实现（Higuchi et al. 1988; Warrens et al. 1997; Chiuet al. 2004;Allemandou et al. 2003; Rabhi et al. 2004;Tyagi et al. 2004; Li et al. 2004; Kirsch and Joly 1998;Kegler-Ebo et al. 1994; Zoller and Smith 1982 )，这其中功能最强大的方法是重叠延伸聚合酶链式反应（的OE - PCR）技术。在某些情况下，最好在基因中介绍多种不同的在一个特定的或几个不同位置的替换，以确定的这些结果对蛋白的功能的改变或优化这些变化。然而，传统的OE - PCR技术只可以一次引进一个点突变;并且当一些目标同时进行时效率大幅下降。我们已经开发出一种快速，高效，高逼真度，允许在DNA片段上生成多个定点突变的改良（M）OE-PCR。该方法已成功在基因（编号850877）实现eight rare codons，并且没有检测到非期望的诱变。结果我们成功地应用MOE-PCR将 eight codon-substitutions 引入到样本1的DNA中。经过一轮的重组和延伸，我们获得了所需大小的DNA（图1）。DNA克隆到载体和分析序列中;和所有的稀有密码子进行了优化没有额外的突变。(Supple-mentary Material, Appendix 1).讨论和定点基因突变做对比，MOE-PCR(图2)有许多明显的优点，其中一条就是，当实施多点突变的时，MOE-PCR需要相对较少的PCR循环。就目前的研究来讲，实施了8点突变和总共255次循环的PCR反应，包括180次的片段合成（每个片段循环30次），15次的两两混合，20次的预延伸，30次的PCR延伸和10次的post-extension。如果使用OE-PCR，eight-codon （带有6个片段）的优化至少需要540次，因为3个片段（包括 一个完整长度的DNA）需要在每轮PCR反应中合成。并且整个过程一般需要6（每轮30次）轮。另外，只有7个片段需要再MOE-PCR中净化，因为在步骤2,3,和4之后没有净化过程，同时如果实施了OE-PCR，每一步之后都有净化的必要并且作为一个整体的18个片段也将被分别净化。此外，为了确保高效、无差错的延伸，PCR的每一个过程都必须进行优化，所以对OR-PCR而言，21个过程优化是必要的，而MOE-PCR只需要9个（(预延伸, post-extension过程固定为94变性，72退火，延伸)。综上所述，MOE-PCR是更高效和节约时间的方法。通过比较，预延伸的必要性得到了验证，因为没有这一步，只有分散的部分通过电脉冲被获得。通过对第一步中用Vector NT software 合成DNA片段的比较分析，结果告诉我们每两个片段（辅助材料，附录2）间有明显的特性。结论就是，当全部的片段被直接混合起来的时候，多重片段会打断每个片段间的正确重叠。 为了避免这种麻烦，我们实施了两两混合。当只有两个片段要被混合和重叠延伸时，反应成分往往很简单并且几乎没用中断。更重要的是，相邻片段间较长的一段在结束前会有利于下一步的重叠延伸。在预延伸中，由于新延伸的片段间产生了长期的重叠区域，退火和延伸过程需要更高的温度（72摄氏度），这是对Pfu DNA聚合酶最佳温度。同时，较高的温度也降低了任何不匹配的可能性。我们还测试了在PCR可能重组后，没有引物的PCR的必要性，而当直接添加到混合物片段时这是不可能的（不含步骤2，3）。这一结果能提供一些想法，因为理论上这些片段重叠延伸和有引物的PCR能在一个反应系统里同时发生并且这两者没有重大的差异，除了有的在没有引物的PCR后产生的完整长度的模板。因此，除了重叠的片段，准备全长模板可能对PCR很重要。虽然不能确定，引物对模板基因的干扰可能是造成这种结果的关键。由于引物与模板的比例在PCR系统中是106，这意味着每个分子的DNA片段被106个引物所笼罩，引物造成的空间性的阻塞会阻碍片段结束的退火过程，从而抑制了完整长度模板的生成。当多个步骤的有多个DNA片段重叠延伸实施时尤其如此。此外，在步骤2,3之后，完整长度的模板已经准备好得到目标DNA的指数延伸，同时这个模板需要被重组并且在没有引物的PCR过程中积累了初步的次数。这可能是被提及的另一种因素在后还需要post-extension获得重组脱氧DNA;只有分散的部分不需要post-extension来获得（这部分数据没有显示）。采用PCR重组后，既存在残余和不完全伸展DNA片段；并且该片段已被最小化，因为这些大量的片段annealing 来完整单链DNA（变性过程中产生）几乎不会给生成目标双链DNA的机会。因此，不同的双链DNA不能被检测到，即使理论上可以。这就是这个案例尤其是当多个原始片段被用来重组的时候。 在post-extension过程中，72摄氏度被用来annealing和延伸，这比两个引物的annealing的温度都要高。在72时，通过片段的重叠和延伸来重组的DNA应当伴随着DNA片段的减少来减少生成的全长DNA，但是由引物合成的新的DNA片段是可以避免的。上述步骤的条件进行了优化，所有的反应过程反复证明了这个循环。 综上所述，我们已经证明了MOE-PCR方法可以快速、高效的生成