饲料酶制剂企业标准.doc

饲料酶制剂标准引 言本标准是针对以微生物发酵法生产、含有二种或二种以上主要功效酶成分、经配置而成的饲料用复合酶制剂。目前市场上的饲料用复合酶制剂酶活力单位定义不同，因此在本标准中酶活力的表示除自定义的外，还将其换算成国际单位，便于科研、生产、销售和使用单位的使用。1 范围本标准规定了来源于黑曲霉的饲料用复合酶制剂的术语和定义、产品分类、要求、试验方法、检验规则和标志、标签、包装、运输、贮存条件。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 191-2000 包装、储运、图示标志GB/T 5917-1986配合饲料粉碎粒度测定方法GB/T 6435-1986饲料水分的测定方法GB 10648 饲料标签GB/T 130791999饲料中总砷的测定GB/T 130801991 饲料中铅的测定方法GB/T 130821991 饲料中镉的测定方法GB/T 13091-2000 饲料中沙门氏菌的检测方法GB/T 174801998饲料中黄曲霉毒素B1的测定GB/T 18869-2002 饲料中大肠菌群的测定QB/T 1803工业用酶制剂通用试验方法NYT 722-2003 饲料用酶制剂通则GB/T6388 运输包装收发货标志QB/T1804 工业酶制剂 通用检验规则和标志，包装，运输，贮存QB/T1805.3 工业用蛋白酶制剂QB/1502-1992 食品添加剂果胶酶制剂国家技术监督局(1995)第43号令定量包装商品计量监督规定3术语和定义下列术语、定义适用于本标准。3.1饲料用酶制剂 Enzymatic Preparation for Feed饲料用酶制剂是通过产酶微生物发酵工程或含酶动、植物组织提取技术生产加工而成，具有一种或几种底物清楚的酶催化活性，有助于改善动物对饲料营养成分的消化、吸收等，并有生物学评定依据，符合安全性要求，作饲料添加剂用的酶制剂产品。3.2饲料用复合酶制剂 通过黑曲霉固态发酵产生的产品中含有二种或二种以上主要功效酶成分，对饲料中多种成分具有酶催化作用的饲料用酶制剂。3.3酶活单位: 根据作用底物的不同，对饲料用复合酶中相关酶种的酶活单位作如下定义。3.3.1酸性蛋白酶按部颁法以酪蛋白为底物（Merck公司生产，Hammastein法制备），在pH2.3，40反应10分钟后，用Folin法测定蛋白酶活力，以每分钟生产1g或1M酪氨酸所需酶量为一个单位。分别以U/g 和IU/g表示。3.3.2半纤维素酶：以木聚糖为底物（Sigma公司生产，燕麦木聚糖），在pH5，40反应30分钟后，用DNS法测定木糖生成量，以每分钟产生1g或1M木糖所需之酶量为一木聚糖酶活力单位。分别以U/g 和IU/g表示。3.3.3果胶酶活性：以果胶（Sigma，桔皮果胶）为底物，在pH3.5，50反应30分钟后，DNS法测定生成的半乳糖醛酸量，以每小时生成1g或1M半乳糖醛酸所需酶量为一个单位。分别以U/g 和IU/g表示。3.3.4纤维素CMC酶按部颁法以CMC钠（上海试剂厂生产）为底物，在pH4.8，50反应30分钟后，用DNS试剂测定生成的还原糖量，以每小时生成1g或1M葡萄糖所需酶量作为一个纤维素酶活单位。分别以U/g 和IU/g表示。3.3.5糖化酶活性：以可溶性淀粉（菱湖淀粉厂生产）为底物40，pH4.5反应30分钟后，用碘量法测定生成的还原糖量，以每小时生成1g或1M葡萄糖所需酶量为一个单位。分别以U/g 和IU/g表示。3.3.6 -葡聚糖酶在40、pH5.0的条件下，每分钟内从浓度为1.0%（w/v）的葡聚糖（SigmaG6513）溶液中降解释放出1g或1M葡萄糖所需要的酶量为一个酶活单位，分别以U/g 和IU/g表示。4饲料用复合酶制剂的安全性由黑曲霉发酵生产获得的饲料用复合酶，采用的产酶菌种是我国农业部105号公告公布的允许使用的饲料级微生物菌种，同时也是符合食品添加剂使用的发酵菌株。5要求5.1感官指标微黄色粉末、色泽均匀、无异味、无发霉变质、结块。5.2酶活力指标饲料用复合酶产品中的酶系及酶活力指标应符合表1规定。表1. 产品酶系及酶活力酶系酶活酸性蛋白酶糖化酶果胶酶半纤维素酶纤维素酶葡聚糖酶U/g10000180000012000075000720000180000IU/g6010000600500400010005.3卫生指标卫生指标应符合表2的规定。表2饲料用复合酶制剂的卫生指标砷，mg/kg,（以As 计）5.0铅，mg/kg,（以 Pb计）10.0镉，mg/kg,（以 Cd计）0.5沙门氏菌，不得检出大肠菌群，MPN/100g3000黄曲霉毒素B1, mg/kg0.05注： 不得检出国家明令禁止的药物和物质。5.4粒度孔径0.325mm（60目筛）分析筛筛上物，不大于20%。5.5水分不大于10%。5.6净含量按国家技术监督局（1995）第43号令执行。6试验方法6.1感官要求取样品适量，进行感官检验，观察、嗅闻或触摸。6.2酶活力6.2.1酸性蛋白酶按附录A测定。6.2.2半纤维素酶按附录B测定。6.2.3-葡聚糖酶活力按附录C测定。6.2.4纤维素CMC酶活力按附录D测定。6.2.5糖化酶活力按附录E测定。6.2.6果胶酶活力按附录F测定。6.3砷（As）按GB/T13079-1999执行。6.4铅（Pb）按GB/T 13080-1991执行。6.5镉（Cd）按GB/T13082-1991执行。6.6沙门氏菌按GB/T 13091-2000执行。6.7大肠菌群按GB/T 18869-2002执行。6.8黄曲霉毒素B1按GB/T 17480-1998执行。6.9水分按GB/T 6435-1986执行。6.10粒度按GB/T 5917-1986执行。6.11净含量用适宜感量的衡器进行检验。7检验规则7.1组批的定义生产厂以每一班次生产且经包装的、具有同样工艺条件、同一产品名称、批号、规格和同样质量证明书的产品为一个组批。7.2取样方法从每批产品的包装中随机抽取。用清洁适用的取样工具伸入所取样品的四分之三深处，用交叉法取出足够量的样品，将采得的样品充分混合均匀按四分法缩分至250g，平分装入两个清洁、干燥具有密闭性和避光性的具塞样品瓶中，贴上标签，注明生产厂名称、产品名称、批号、取样日期等。7.3检验分类产品分为出厂检验和型式检验。7.3.1出厂检验7.3.1.1出厂检验项目感官指标、酶活力、水分、粒度、净重。7.3.1.2判定方法对抽取的样品按出厂检验项目进行检验，如果检验结果中有任何一项指标不合格时，应重新取样进行复检，取样范围或样品数量为第一次取样量的两倍，复检结果中仍有指标不合格，则整批产品判为不合格，不能出库。7.3.1.3判定结论每批产品应由生产厂质量检验部门进行出厂检验，只有检验合格后方可签发合格证出厂。7.3.2型式检验7.3.2.1型式检验项目型式检验的样品必须从出厂检验合格产品中随机抽取。型式检验项目为本标准“5要求”中各项指标。7.3.2.2型式检验的范围有下列情况之一时，应进行型式检验：a).审发生产许可证、产品批准文号时；b).产品的原辅材料、工艺过程及主要设备有较大变化时；c).停产6个月以上，恢复生产时；d).出厂检验结果与上次型式检验有较大差异时；e).当用户对产品质量有较大异议时。7.3.2.3判定方法对抽取的样品按型式检验项目进行检验，如果检验结果中有任何一项指标不合格时，应重新取样进行复检，但卫生指标如有一项不合格时，即判为不合格产品，不得复检。复检的取样范围或样品数量是第一次取样的两倍。复检结果仍有指标不合格，则判为不合格产品。8标志、标签8.1标志产品的外包装应有产品名称、生产厂家、规格、注册商标、生产许可证号、产品批准文号、净重、防潮防晒标志，同时还应注明“饲料添加剂”字样，并采用鲜明的饲料标签，符合GB/T 191-2000规定。8.2标签按GB 10648执行。9包装、运输、贮存9.1包装产品的包装需具备：密封、防水、避光、一定的强度要求和一定的包装规格等。9.2运输产品含有生物活性物质，光线、温度、湿度易引起失活。运输工具必须清洁、干燥，有防雨防晒设施，搬运装卸小心较放。不得与有毒有害及其它污染物品混装混运。9.3贮存产品需于阴凉、干燥、避光处贮存。贮存仓库需保持清洁、阴凉、干燥、通风，防受热、受潮。不得与有毒有害及其它污染物品混贮。9.4保质期产品原包装需注明保质期。在本标准规定条件下，保质期为6个月。附录A（规范性附录）酸性蛋白酶活力的测定方法A.1原理蛋白酶在一定的温度和pH条件下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比。通过在680nm测定其吸光度，可得到酶解产生的酚基氨基酸的量，计算出蛋白酶活力，以此代表蛋白酶的总酶活力。A.2酶活单位定义在（400.2）、pH2.5条件下，在1min内水解酪蛋白底物，产生相当于1微克或1微摩尔的酪氨酸的酶量，为1个酶活单位。A.3试剂和溶液 除非另有规定外，试验中所用试剂均为分析纯，所用水为蒸馏水或去离子水。A.3.11 mol/L及0.1 mol/L盐酸 (HCl)溶液取浓盐酸85ml，加水稀释并定容至1000 ml，即为1mol/L盐酸溶液；取100ml 1mol/L盐酸溶液，定容至1000 ml，即为0.1 mol/L盐酸溶液。A.3.21mg/ml L-酪氨酸标准贮备溶液精确称取预先于105干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，用20ml 左右1mol/L盐酸l溶解后，再用蒸馏水定容至100ml，即为1mg/ml酪氨酸标准溶液。A.3.3L-酪氨酸标准使用溶液吸取1mg/ml酪氨酸标准溶液10.0 ml用0.1 mol/L盐酸定容至100 ml,即得到100 g/ml L-酪氨酸标准液。分别吸取100g/ml L-酪氨酸标准液 0ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0 ml于10ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，制成每ml分别含L-酪氨酸0g、10g、20g、30g、40g、50g、60 g的标准使用溶液。A.3.40.4 mol/L 碳酸钠（Na2CO3）溶液称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。A.3.5福林（Folin）试剂于2000ml磨口回流装置中加入钨酸钠(Na2WO4.2H2O)100g、钼酸钠(Na2MoO4.2H2O)25g、蒸馏水700ml、85%磷酸50ml、浓盐酸100ml。小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风厨中加入硫酸锂（ Li2SO4）50g，加蒸馏水50ml和数滴浓（99%）溴水，再微沸15min，以除去多余的溴（冷后仍有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却后加蒸馏水定容至1000ml。混匀、过滤。试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。使用时，以1份原Folin试剂与2份蒸馏水混匀，制成稀Folin试剂。A.3.6乳酸缓冲液(pH=2.5)甲液：称取80%90%乳酸10.6 g，加水稀释并定容至1000ml。乙液：称取70%乳酸钠16 g，加水稀释并定容至1000ml。使用液：取甲液2份，加乙液1份，再准确稀释1倍。用pH计校正pH至2.5。A.3.71.0%酪素溶液称取酪素1.0000g，先用少量（3ml-4ml）浓乳酸湿润后，再加入乳酸缓冲液约80ml,在沸水浴中边加热边搅拌直至完全溶解。冷却后转入100ml容量瓶中，用相应缓冲液定容至刻度。此溶液在4冰箱贮存，有效期为3天。A.3.80.4 mol/L三氯乙酸(CCl3-COOH)溶液(沉淀试剂)称取三氯乙酸65.4g，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。A.4仪器和设备 除普通实验室仪器外，还应有：A.4.1恒温水浴锅(400.2)。A.4.2分光光度计A.4.3酸度计精度0.01pH 。A.4.4分析天平感量0.1mg。A.4.5秒表或定时钟。A.5测定步骤A.5.1标准曲线绘制按表A.1，分别吸取标准酪氨酸标准使用溶液、0.4mol/L碳酸钠溶液和稀Folin试剂于各管中（每管号平行作3个样），混匀。将标准管同时置于40水浴，反应20min，取出，迅速冷却至室温，用10mm比色杯，以空白管（0号管）调仪器零点，在分光光度计波长680nm处测吸光度。以酪氨酸量为横座标，以吸光度为纵座标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。当吸光度为1时的酪氨酸量（g）即为比色常数K值。线性回归系数（r）应在0.9990以上时方可使用（否则须重做）。对每个新配制的Folin试剂制作新的标准曲线。 表A.1酪氨酸标准曲线管号标准酪氨酸使用溶液0.4mol/L碳酸钠溶液(ml)稀Folin试剂(ml)浓度（g/ml）吸取量（ml）001.05.01.01101.05.01.02201.05.01.03301.05.01.04401.05.01.05501.05.0 1.06601.05.01.0A.5.2样品的测定A.5.2.1待测酶液的制备固体酶：根据样品酶活大小，称取2g10g固体酶样，精确至0.1mg，加入40200ml蒸馏水，溶解后置40水浴浸提30min，用滤纸过滤，再根据样品酶活性大小，二次稀释至适宜浓度（使供试样液与空白液的吸光度之差落在0.2-0.4之间，下同）。A.5.2.2测定程序取三支15150mm试管（一支空白管，二支样品管）。分别向三支试管中准确加入稀释好的待测酶液1.0ml 。将三支试管放入（400.2）水浴中预热5min，同时将测定底物（1%酪素溶液）置同一温度水浴中预热5min。分别向二支样品管中加入1.0ml 1%酪素溶液，准确计时，反应10min，取出。迅速、准确向三支试管中加入2ml TCL（沉淀试剂），于空白管中加入1.0ml1%酪氨酸溶液，摇匀。将三支试管继续置（400.2）水浴中放置10min，取出，迅速冷却至室温。三支试管中反应液用滤纸（Whatman1号滤纸或新华1号滤纸）过滤。另取三支18180mm的试管（一支空白，二支样品管）分别吸取上述相应的滤出液1.0ml，0.4mol/L碳酸钠溶液5.0ml，稀Foiln试剂1.0ml，摇匀，置（400.2）水浴中放置20min，取出，迅速冷却至室温。以空白管（对照）调仪器零点，在分光光度计波长680nm下，用10mm比色杯，分别测二支样品管中样液的吸光度，取平均值。通过查标准曲线或用线性回归方程求出生成的酪氨酸的含量。A.6酶活力计算按照下式(A.1)计算样品蛋白酶活力： AKV4NX1 (A.1) 1W10 式中：X1蛋白酶活力，u/g；A样品与空白的的吸光度差K比色常数；V样品提取时加入水的量（ml）；4酶反应体系总体积（ml）；N样品二次稀释时的稀释倍数；1参与反应的酶量（ml）；W样品重量（g/ml）；10反应时间（min）。 A.7精密度同一试样两次测试结果的绝对差值，不得超过算术平均值的10%。附录B（规范性附录）半纤维素酶活力的测定方法B.1原理半纤维素酶在一定的温度和pH条件下，催化木聚糖水解生成二糖、木糖等还原糖。在碱性、煮沸条件下，能将3,5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙黄色的氨基化合物，其颜色的深浅与还原糖（以木糖计）含量成正比。通过其在540nm测其吸光度，可得到还原糖生成量，计算出木聚糖酶的酶活力。以此代表木聚糖酶的总酶活力。B.2酶活单位定义见3.3.2。B.3试剂和溶液除非另有规定，试验中所用试剂均为分析纯，所用水为蒸馏水或去离子水。B.3.11%（W/V）木聚糖底物 精确称取燕麦木聚糖(xylan from Oat spelts, 美国Sigma公司)1.0000 g，溶于80ml蒸馏水中，水浴加热至溶解，冷却后转入100 ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。此溶液在4冰箱贮存，有效期为3天。B.3.2磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液: 甲液：称取磷酸氢二钠35.61 g, 用蒸馏水溶解，并定容至1000ml。 乙液：称取柠檬酸21.01 g，用蒸馏水溶解，并定容至1000ml。. 缓冲溶液：取甲液515ml，加乙液485ml混合均匀，用pH计校正至pH为（5.0 0.05）,备用。B.3.33,5二硝基水杨酸（DNS）试剂: 取酒石酸钾钠182g，溶于500ml蒸馏水中，加热。于热溶液中依次加入3,5-二硝基水杨酸6.3g， 氢氧化钠 10g，苯酚5g，无水亚硫酸钠5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至1000ml，混匀，过滤，贮于棕色试剂瓶中，于暗处放置1周后使用。 :注：在黑色或棕色瓶中于室温下贮存，该试剂最多稳定6个月。B.3.41%(W/V)木糖标准贮备溶液称取预先于（1032）下干燥至恒重的木糖1.0000 g，用蒸馏水溶解后定容至100 ml，即为1%浓度的木糖标准溶液。B.3.5木糖标准使用溶液分别吸取1%木糖标准贮备溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml置50ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，制成每ml分别含木糖200g、400g、600g、800g、1000g 、1200 g的标准使用溶液。B.4仪器和设备 除普通实验室仪器外，还应有：B.4.1恒温水浴锅(400.2) 。B.4.2分光光度计B.4.3酸度计精度0.01pH 。B.4.4分析天平感量0.1mg。B.4.5秒表或定时钟。B.5测定步骤B.5.1标准曲线的制作按表B.1，分别吸取标准木糖使用溶液、缓冲液和DNS试剂于各管中（每管号平平行3个样），混匀。将标准管同时置于沸水浴中，反应7min，取出，迅速冷却至室温，准确加入蒸馏水10ml，混匀。用10mm比色杯，以空白管（0号管）调仪器零点，在分光光度计波长550nm处测吸光度。以木糖量为横座标，以吸光度为纵座标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。线性回归系数（r）应在0.9990以上时方可使用（否则须重做）。对每个新配制的DNS溶液制作新的标准曲线。表B.1木糖标准曲线管号标准木糖使用溶液磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(ml)DNS试剂吸取量(ml)浓度（g/ml）吸取量（ml）000.501.53.012000.501.53.024000.501.53.036000.501.53.048000.501.53.0510000.501.5 3.0612000.501.53.0B.5.2样品的测定B.5.2.1待测酶液的制备固体酶：根据样品酶活大小，称取2g10g固体酶样，精确至0.1mg，加入40200ml蒸馏水，溶解后置40水浴浸提30min，用滤纸过滤，再根据样品酶活性大小，二次稀释至适宜浓度（使供试样液与空白液的吸光度之差落在0.2-0.4之间，下同）。B.5.2.2操作程序取三支18180mm试管（一支空白管。二支样品管）。分别向三支试管中准确加入稀释好的待测酶液0.50ml 。分别向三支试管中准确加入pH 5.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（B.2.2）1.0ml。将三支试管放入（400.2）水浴中预热5min，同时将测定底物（1%木聚糖溶液）置同一温度水浴中预热5min。分别向二支样品管中加入0.5ml1%木聚糖溶液，向空白管中加入3ml DNS试剂，准确计时，反应10min，取出。迅速、准确向二支样品管中加入3ml DNS试剂，于空白管中加入0.5ml1%木聚糖溶液，摇匀。将三支试管同时放入沸水浴中，待水浴中水重新沸腾时开始准确计时，反应7min，取出，迅速冷却至室温。向三支试管中各加入10ml蒸馏水，混匀。以空白管（对照液）调仪器零点，在分光光度计波长540nm下，用10mm比色杯，分别测二支样品管中样液的吸光度，取平均值。通过查标准曲线或用线性回归方程求出还原糖的含量。B.6酶活力计算按照下式（B.1）计算样品的木聚糖酶的活力：AVNX1 (B.1) 0.5W10 式中：X1木聚糖酶活力，u/g；A根据吸光度在标准曲线上查得（或从回归方程计算出）的还原糖生成量，g；V样品提取时加入水的量（ml）；N样品二次稀释时的稀释倍数；0.5参与反应的酶量（ml）；W样品重量（g）；10反应时间（min）。B.7精密度同一试样两次测试结果的绝对差值，不得超过算术平均值的10%。附录C（规范性附录）-葡聚糖酶活力的测定方法C.1原理葡聚糖酶在一定的温度和pH条件下，催化葡聚糖水解生成分子量较小的低聚糖、葡萄糖等还原糖。在碱性、煮沸条件下，能将3,5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙黄色的氨基化合物，其颜色的深浅与还原糖（以葡萄糖计）含量成正比。通过其在550nm测其吸光度，可得到还原糖生成量，计算出葡聚糖酶的酶活力。以此代表葡聚糖酶的酶活力。C.2酶活单位定义见3.3.6。C.3试剂和溶液除非另有规定，试验中所用试剂均为分析纯，所用水为蒸馏水或去离子水。C.3.11%（W/V）葡聚糖底物精确称取葡聚糖(-glucan,from barley,Sigma 公司产)1.0000 g，溶于80ml蒸馏水中，水浴加热至溶解，冷却后转入100 ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。此溶液在4oC冰箱贮存，有效期为3天。C.3.2磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液: 甲液：称取磷酸氢二钠35.61 g, 用蒸馏水溶解，并定容至1000ml。 乙液：称取柠檬酸21.01 g，用蒸馏水溶解，并定容至1000ml。. 缓冲溶液：取甲液515ml，加乙液485ml混合均匀，用pH计校正至pH为（5.0 0.05）,备用。C.3.33,5二硝基水杨酸（DNS）试剂: 取酒石酸钾钠182g，溶于500ml蒸馏水中，加热。于热溶液中依次加入3,5-二硝基水杨酸6.3g， 氢氧化钠 10g，苯酚5g，无水亚硫酸钠5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至1000ml，混匀，过滤，贮于棕色试剂瓶中，于暗处放置1周后使用。 :注：在黑色或棕色瓶中于室温下贮存，该试剂最多稳定6个月。C.3.41%(W/V)葡萄糖标准贮备溶液称取预先于（1032）下干燥至恒重的葡萄糖1.0000 g，用蒸馏水溶解后定容至100 ml，即为1%浓度的葡萄糖标准溶液。C.3.5葡萄糖标准使用溶液分别吸取1%葡萄糖标准贮备溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml置50ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，制成每ml分别含葡萄糖200g、400g、600g、800g、1000g 、1200 g的标准使用溶液。C.4仪器和设备 除普通实验室仪器外，还应有：C.4.1恒温水浴锅(400.2) oC。C.4.2分光光度计C.4.3酸度计精度0.01pH 。C.4.4分析天平感量0.1mg。C.4.5秒表或定时钟。C.5测定步骤C.5.1标准曲线的制作按表C.1，分别吸取标准葡萄糖使用溶液、缓冲液和DNS试剂于各管中（每管号平平行3个样），混匀。将标准管同时置于沸水浴中，反应7min，取出，迅速冷却至室温，准确加入蒸馏水10ml，混匀。用10mm比色杯，以空白管（对照液）调仪器零点，在分光光度计波长550nm处测吸光度。以葡萄糖量为横座标，以吸光度为纵座标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。线性回归系数（r）应在0.9990以上时方可使用（否则须重做）。对每个新配制的DNS溶液制作新的标准曲线。表C.1葡萄糖标准曲线管号标准葡萄糖使用溶液磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(ml)DNS试剂吸取量(ml)浓度（g/ml）吸取量（ml）000.501.53.012000.501.53.024000.501.53.036000.501.53.048000.501.53.0510000.501.5 3.0612000.501.53.0C.5.2样品的测定C.5.2.1待测酶液的制备固体酶：根据样品酶活大小，称取2g10g固体酶样，精确至0.1mg，加入40200ml蒸馏水，溶解后置40水浴浸提30min，用滤纸过滤，再根据样品酶活性大小，二次稀释至适宜浓度（使供试样液与空白液的吸光度之差落在0.2-0.4之间，下同）。C.5.2.2操作程序取三支18180mm试管（一支空白管。二支样品管）。分别向三支试管中准确加入稀释好的待测酶液0.50ml 。分别向三支试管中准确加入pH 5.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（B.2.2）1.0ml。将三支试管放入（400.2）水浴中预热5min，同时将测定底物（1%葡聚糖溶液）置同一温度水浴中预热5min。分别向二支样品管中加入0.5ml1%葡聚糖溶液，向空白管中加入3ml DNS试剂，准确计时，反应10min，取出。迅速、准确向二支样品管中加入3ml DNS试剂，于空白管中加入0.5ml1%葡聚糖溶液，摇匀。将三支试管同时放入沸水浴中，待水浴中水重新沸腾时开始准确计时，反应7min，取出，迅速冷却至室温。向三支试管中各加入10ml蒸馏水，混匀。以空白管（对照液）调仪器零点，在分光光度计波长550nm下，用10mm比色杯，分别测二支样品管中样液的吸光度，取平均值。通过查标准曲线或用线性回归方程求出还原糖的含量。C.6酶活力计算按照下式（C.1）计算样品的葡聚糖酶的活力：AVNX1 (C.1) 0.5W10 式中：X1葡聚糖酶活力，u/g；A根据吸光度在标准曲线上查得（或从回归方程计算出）的还原糖生成量，g；V样品提取时加入水的量（ml）；N样品二次稀释时的稀释倍数；0.5参与反应的酶量（ml）；W样品重量（g）；10反应时间（min）。C.7精密度同一试样两次测试结果的绝对差值，不得超过算术平均值的10%。附录D（规范性附录）纤维素（CMC）酶活力的测定方法D.1原理纤维素酶在一定的温度和pH条件下，将纤维素底物（CMC，羧甲基纤维素钠）水解，释放出还原糖。在碱性、煮沸条件下，能将3,5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙黄色的氨基化合物，其颜色的深浅与还原糖（以葡萄糖计）含量成正比。通过其在550nm测其吸光度，可得到还原糖生成量，计算出CMC酶的活力。D.2酶活单位定义见3.3.4。D.3试剂和溶液除非另有规定，试验中所用试剂均为分析纯，所用水为蒸馏水或去离子水。D.3.1羧甲基纤维素钠（CMCNa）中国医药公司上海化学试剂公司产，分析纯，在25，2%水溶液粘度300800厘泊尔。D.3.2磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液: 甲液：称取磷酸氢二钠35.61 g, 用蒸馏水溶解，并定容至1000ml。 乙液：称取柠檬酸21.01 g，用蒸馏水溶解，并定容至1000ml。.缓冲溶液：取甲液414ml，加乙液586ml混合均匀，用pH计校正至pH为（4.8 0.05）,备用。D.3.31%羧甲基纤维素钠（CMCNa）溶液称取1g羧甲基纤维素钠，精确至1mg，缓缓加入pH为4.8 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液80ml，水浴加热至全部溶解。冷却后用2MHCL或NaOH调节溶液的pH到（4.8 0.05），搅拌均匀，定容至100ml，再用二层纱布过滤。此溶液在4C冰箱贮存，有效期为3天。D.3.43,5二硝基水杨酸（DNS）试剂: 取酒石酸钾钠182g，溶于500ml蒸馏水中，加热。于热溶液中依次加入3,5-二硝基水杨酸6.3g， 氢氧化钠 10g，苯酚5g，无水亚硫酸钠5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至1000ml，混匀，过滤，贮于棕色试剂瓶中，于暗处放置1周后使用。 :注：在黑色或棕色瓶中于室温下贮存，该试剂最多稳定6个月。D.3.51%(W/V)葡萄糖标准贮备溶液称取预先于（1032）下干燥至恒重的葡萄糖1.0000 g，用蒸馏水溶解后定容至100 ml，即为1%浓度的葡萄糖标准溶液。D.3.6 葡萄糖标准使用溶液分别吸取1%葡萄糖标准贮备溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml置50ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，制成每ml分别含葡萄糖200g、400g、600g、800g、1000g 、1200 g的标准使用溶液。D.4仪器和设备 除普通实验室仪器外，还应有：D.4.1恒温水浴锅(500.2) 。D.3.2 分光光度计D.4.2酸度计精度0.01pH 。D.4.3分析天平感量0.1mg。D.4.4秒表或定时钟。D.5测定步骤D.5.1标准曲线的制作按表D.1，分别吸取标准葡萄糖使用溶液、缓冲液和DNS试剂于各管中（每管号平平行3个样），混匀。将标准管同时置于沸水浴中，反应7min，取出，迅速冷却至室温，准确加入蒸馏水10ml，混匀。用10mm比色杯，以空白管（对照液）调仪器零点，在分光光度计波长550nm处测吸光度。以葡萄糖量为横座标，以吸光度为纵座标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。线性回归系数（r）应在0.9990以上时方可使用（否则须重做）。对每个新配制的DNS溶液制作新的标准曲线。表D.1葡萄糖标准曲线管号标准葡萄糖使用溶液磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(ml)DNS试剂吸取量(ml)浓度（g/ml）吸取量（ml）000.501.53.012000.501.53.024000.501.53.036000.501.53.048000.501.53.0510000.501.5 3.0612000.501.53.0D.5.2样品的测定D.5.2.1待测酶液的制备固体酶：根据样品酶活大小，称取2g10g固体酶样，精确至0.1mg，加入40200ml蒸馏水，溶解后置50水浴浸提30min，用滤纸过滤，再根据样品酶活性大小，二次稀释至适宜浓度（使供试样液与空白液的吸光度之差落在0.2-0.4之间，下同）。D.5.2.2操作程序取三支18180mm试管（一支空白管。二支样品管）。分别向三支试管中准确加入稀释好的待测酶液0.50ml 。将三支试管放入（400.2）oC水浴中预热5min，同时将测定底物（1%羧甲基纤维素钠溶液）置同一温度水浴中预热5min。分别向二支样品管中加入1.5ml1%羧甲基纤维素钠溶液，向空白管中加入3mlDNS试剂，准确计时，反应10min，取出。迅速、准确向二支样品管中加入3ml DNS试剂，于空白管中加入1.5ml1%羧甲基纤维素钠溶液，摇匀。将三支试管同时放入沸水浴中，待水浴中的水重新沸腾时开始准确计时，反应7min，取出，迅速冷却至室温。向三支试管中各加入10ml蒸馏水，混匀。以空白管（对照液）调仪器零点，在分光光度计波长550nm下，用10mm比色杯，分别测二支样品管中样液的吸光度，取平均值。通过查标准曲线或用线性回归方程求出还原糖的含量。D.6酶活力计算按照下式（D.1）计算样品的纤维素CMC酶的活力：AVNX1 (D.1) 0.5W10 式中：X1纤维素CMC酶活力，U/g；A根据吸光度在标准曲线上查得（或从回归方程计算出）的还原糖生成量，g；V样品提取时加入水的量（ml）；N样品二次稀释时的稀释倍数；0.5参与反应的酶量（ml）；W样品重量（g）；10反应时间（min）。D.7精密度同一试样两次测试结果的绝对差值，不得超过算术平均值的10%。附录E糖化酶活力的试验方法E .1 原理糖化酶催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原末端开始，分解1，4葡萄糖苷键，生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算出酶活力。E .2 定义见3.3.5。 E .3仪器和设备a）恒温水浴（400.2）。b）秒表。C）比色管50ml。D）移液管、滴定管等。E .4 试剂和溶液E .41 乙酸乙酸钠缓冲液（pH4.5） 称取乙酸钠（CH3COONa.3H2O）6.7g溶于水中，加冰乙酸（CH3COOH）2.6ml，用水定容至1000ml，配好后用pH计校正。E.42 硫代硫酸钠标准溶液c（Na2S2O3）0.05mol/La）配制：称取硫代硫酸钠（Na2S2O3。5H2O）12.4g和碳酸钠0.1g溶于煮沸后冷却的蒸馏水中，定容至1000ml，贮于棕色瓶中密闭保存，配制后放置1星期标定使用。b） 标定：称取预先在100105烘过2h的分析纯碘酸钾（KIO3）3.567g，溶于1000ml蒸馏水中，即成0.1mol/L碘酸钾溶液。然后吸取10ml于150ml三角瓶中，加0.5g碘化钾（KI），溶解后加1 mol/L H2SO4 2ml，用待标定的0.05mol/L Na2S2O3溶液滴定至淡黄色时，加1淀粉指示剂23滴，继续滴定至无色为终点。 碘酸钾溶液摩尔数10 Na2S2O3溶液浓度（mol/L） 消耗 Na2S2O3的ml数E .43 碘溶液c（1/2I2）0.1mol/La）配制：称取碘化钾（KI）36g溶解在100ml蒸馏水中，再加入碘（I2）12.691g溶解稀释至1000ml，贮于棕色瓶。 b）标定：用已标定的0.05mol/L Na2S3O3溶液来标定碘溶液。 吸取10ml待标定的碘液放入250ml碘量瓶中，以0.05mol/L Na2S3O3溶液滴定至淡黄色时，加入1淀粉指示剂23滴，继续滴定至无色为终点。 碘溶液浓度（mol/L） 0.05消耗Na2S3O3的ml数 10E44 氢氧化钠溶液c（NaOH）0.1mol/L 称取4gNaOH溶解定容至1000ml。E45 20氢氧化钠溶液 称取20gNaOHa溶解定容至100ml。E46 硫酸溶液c（1/H2SO4）2mol/L 量取浓硫酸（相对密度为1.84）5.6ml，缓缓注入80ml水中，冷却后定容至100ml。E47 1淀粉指标剂 将2淀粉溶液稀释1倍。E48 20g/L可溶性淀粉溶液 称取绝干可溶性淀粉2g，然后用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入已沸的蒸馏水中，加热煮沸至透明，冷却后定容至100ml，此溶液需当天配制。 注：采用浙江菱湖食品化工联合公司生产的专供酶制剂行业用的可溶性淀粉。E .5 试验方法E51 待测酶液制备 称取定量酶粉(见表1)精确至0.0009g，先用少量的缓冲溶液(4.1)溶解，用玻璃棒捣研，将上清液小心倾人容量瓶中，沉渣部分再加少量缓冲液，如此捣研34次，最后全部移人容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀，通过4层纱布过滤，滤液供测定用。 表1 酶活力稀释倍数表酶 活 力稀 释 倍 数称 量定 容（ml）50 0003331.5050080 0005002.001 000100 0005002.001 000E52 测定a) 于甲、乙两支50ml具塞比色管中，分别加入可溶性淀粉溶液25ml及缓冲液5ml，摇匀后于40恒温水浴中预热5min。在甲管（样品）加入酶样2ml，立即摇匀，在此温度下准确反应30min，立即各加20NaOH溶液0.2ml摇匀，将两管取出迅速冷却，并于乙管中（空白）中补加待测酶样2.00ml。 b) 吸取上述反应液与空白液5.0ml，分别置于碘量瓶中，准确加入碘溶液10.0ml，再加0.1molL NaOH溶液15.00m1，摇匀，密塞，于暗处反应15min，取出，加2molL H2SO4 2.0ml，立即用Na2S203标准液滴定，直至蓝色刚好消失为其终点。E53 计算 X = (V0一V) c90.0532251/2n2579.9(V0一V) cn式中 : X样品的酶活力（Ug） Vo空白消耗Na2S203标准溶液的体积（m1） V样品消耗Na2S203标准溶液的体积（ml） C - Na2S203标准溶液的浓度（molL） 90.05与1.00ml Na2S203标准溶液c（1/2 Na2S203） 1.000molL 相当的以克表示的葡萄糖的质量 32.2反应液的总体积（ml） 5 吸取反应液的体积（ml） 1/2吸取酶液2.00ml，以1.00ml计 n 样品稀释倍数 2反应30min换算成1h的酶活力系数附录F（资料性附录）果胶酶活性：F.1原理果胶酶能将聚半乳糖醛酸降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中果胶酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中果胶酶的活力。F.2酶活定义见3.3.3F.3.试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。F.3.1葡糖糖溶液，c（C6H12O6）为10.0mg/ml：称取无水葡萄糖1.000g，加水溶解，定容至100ml。F.3.2 乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L：吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解，定容至100ml。F.3.3 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L： 称取三水乙酸钠1.36g。加水溶解，定容至100ml。F.3.4 氢氧化钠溶液，c（NaOH）为200g/L：