（微生物学专业论文）杀虫抗生素产生菌的选育及理化性质初步研究.pdf

参 广西大学学位论 本人声明 所呈交的学位论文 关知识产权属广西大学所有 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文 的研究内容 除已注明部分外 论文中不包含其他人已经发表过的研究成果 也不包含 本人为获得其它学位而使用过的内容 对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集 体 均已在论文中明确说明并致谢 论文作者签冬 孝 2 0 0 7 年6 月2 2 日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集 保存 使用学位论文的规定 即 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版 并提供目录检索与阅览服务 学校可以采用影印 缩印 数字化或其它复制手段保存论文 在不以赢利为目的的前提下 学校可以公布论文的部分或全部内容 请选择发布时间 口即时发布眨缘密后发布 保密论文需注明 并在解密后遵守此规定 论文作者签名 杏 药导师签名 2 0 0 7 年6 月2 2 日 冬粤j 利用卤虫活性追踪对g x 2 9 菌株产杀虫活性的发酵条件进行研究 发 现其产生杀虫活性最佳培养基为i 号培养基 通过单因素分析及正交实验 发现其最佳产杀虫活性物质的发酵条件为 培养基初始p h 为8 o 接种量 为9 o 发酵温度为2 8 摇床转速为1 8 0 r m i n 摇瓶装液量为 8 0 蝴5 0 n l l 在此发酵条件下发酵1 6 8 h 该茵产生活性物质的杀虫活性最 强 是优化前的1 4 3 倍 利用卤虫活性追踪对其活性物质稳定性进行初步研究 结果表明温度 紫外线对其杀虫活性影响不显著 中性及偏碱性条件下 其杀虫活性稳定 通过中空纤维超滤系统对发酵滤液进行超滤 去杂 消除了萃取过程 中的乳化现象 使发酵滤液活性成分质量得到提高 并初步判定其具有 3 0 0 0 d a 以下活性物质存在 对发酵液活性物质的萃取方法进行初步研究表明 g x 2 9 菌株发酵液 杀虫主要组分为脂溶性 以等体积的乙酸乙酯萃取3 次 其萃取效果最好 i l 杀虫抗生素产生 关键词 杀虫抗生素 筛选模型 鉴定 发酵条件 h 广西大掌司眄b 掌位论文杀虫抗生素产生 r 的鞠 育及理化性质初步研究 b r e e d i n go fi n s e c t i c i d a la n t i b i o t i c sp r o d u c i n g s t r a i na n dp r i m d ws t u d i e so nt h e p h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t y i n s e c t i c i d a la n t i b i o t i c s w h i c hi sf r o mt h ep r o d u c to fm i c r o o r g a n i s m h a s g o o de n v i r o n m e n tc o m p a t i b i l i t ya n d c a nb ed e g r a d e de a s i l y n o w t h es c r e e n i n g o fn e wi n s e c t i c i d a la n t i b i o t i c sh a sb e e no nt h ef o c u so fp e s t i c i d er e s e a r c hf i e l d b yu s i n gb r i n es h r i m pa sp r i m a r ys c r e e n i n ga s s a ya n ds i l k w o r ma ss e c o n d 卜 s c r e e n i n ga s s a y t h es t r a i n o fg x 2 9w h i c hw i t hh i g hi n s e c t i c i d a l a c t i v i t y s u b s t a n c e sw e r es e l e c t e df r o mt h es o i l i tw a si d e n t i f i e da ss t r e p t o m y c e s f u l v i s s i m u sb a s e do np h y s i o l o g i c a l a n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n d16 s r d n a s e q u e n c ea n a l y s i s t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o rp r o d u c i n gi n s e c t i c i d a la c t i v i t y s u b s t a n c e sb ys t r a i ng x 2 9w e r ed e t e r m i n e do nt h eb a s eo ft h es i n g l ef a c t o r e x p e r i m e n t sa n do r t h o g o n a lt e s t t h er e s u l t sa r ca sf o l l o w t h ec u l t u r ef d t r a t e s w h i c hu t i l i z e dn o 1n u t r i t i o n c o m p o n e n t s w i t hi n i t i a lp h 8 0 t h eo p t i m a l v o l u m eo fi n o c u l u m si s9 a n dt h ec u l t i v a t i o nt e m p e r a t u r ei s2 8 c t h eo p t i m a l s h a k i n gs p e e di s 18 0 r m i nw h e n2 5 0 m lf l a s kc o n t a i n s8 0 r a lm e d i u m u n d e r t h e s ec o n d i t i o n st h ei n s e c t i c i d a la c t i v i t yw a sg r e a t e s t j u s t1 4 3t i m e sa sb e f o r e t h ei n s e c t i c i d a ls t a b i l i t yw a sa l s os t u d i e db ym e a n so fb r i n es h r i m p m t i m ew eg e tt h a ts o m ea c t i v i t ys u b s t a n c e sm o l e c u l a rw e i g h tw a ss m a l l e rt h a n 3 0 0 0 d a t h ee x t r a c t i o nm e t h o d so ft h ea c t i v i t ys u b s t a n c ew e r es t u d i e d a n dt h e r e s e a r c hi n d i c a t e st h a tt h ea c t i v i t ys u b s t a n c eo fg x 2 9i sf a t s o l u b l e t h e e x t r a c t i n ge f f e c ti ss u i t a b l ew h e na d d i n ga ne q u a lv o l u m e o fe t h y la c e t a t et ot h e b r o t ha n de x t r a c t i n gt h ei m m i s c i b l ea q u e o u sp o r t i o nf o r3t i m e s k e yw o r d s i n s e c t i c i d a l a n t i b i o t i c s s c r e e n i n ga s s a y c l a s s i f i c a t i o n f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s p h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t y i v 广西大学硕士掌位论文 杀虫抗生素产生 蕾的鞠 育反稿l 化性质初步研究 目录 摘要 i a b s t r a s c t i i i 第一章文献综述 1 1 1 概j 苤 1 1 1 1 农用抗生素的定义及其发展史 1 1 1 2 农用抗生素的分类及特点 4 1 1 3 农用抗生素的作用机制 5 1 1 4 农用抗生素发展相关技术 6 1 1 5 杀虫抗生素概述及筛选方法 7 1 2 本课题研究的意义和内容 1 0 1 2 1 本课题研究的意义 o 1 0 1 2 2 本课题研究的内容 1 1 第二章杀虫抗生素产生菌的筛选和鉴定 1 2 2 1 材料与方法 1 2 2 1 1 样品及处理 1 2 2 1 2 生测供试虫及其来源 1 2 2 1 3 菌株 1 1 2 1 4 主要试剂及培养基配制 1 2 2 1 5 实验方法 1 3 2 2 结果与分析 1 5 2 2 1 杀虫抗生素产生菌的初筛 1 5 2 2 2 杀虫抗生素产生菌复筛 1 6 2 2 3g x 2 9 菌株抑菌效果研究 1 7 2 2 4 菌种分类鉴定 2 0 2 3 小节与讨论 2 6 第三章g x 2 9 产活性物质发酵条件研究 2 7 3 1 材料与方法 2 7 3 1 1 试验材料 2 7 3 1 2 实验方法 2 7 3 2 结果与分析 2 9 3 2 1 培养基筛选 2 9 3 2 2 碳源对发酵滤液杀虫活性的影响 2 9 3 2 3 氮源对发酵滤液杀虫活性的影响 3 0 3 2 4 发酵条件单因素试验 3 1 3 2 5 正交实验 3 4 3 2 6g x 2 9 菌株生长与杀虫活性关系研究 3 6 3 3 小结与讨论 3 7 第四章g x 2 9 活性成分理化性质初步研究 3 8 4 1 材料与方法 k 3 8 i 卜 杀虫抗生素产生1 1 1 的捌l r 反理化性质初步研究 4 1 1 材料 3 8 4 1 2 实验方法 3 8 4 2 结果与分析 4 0 4 2 1g x 2 9 发酵液杀虫活性稳定性 4 0 4 2 2 中空纤维柱超滤纯化 4 2 4 2 3 萃取工艺的确定 4 2 4 3 小结与讨论 4 3 第五章工作总结与展望 4 4 5 1 工作总结小 4 4 5 2 展望 o 4 5 参考文献 4 6 附录 5 2 附录18 种发酵培养基配置方法 5 2 附录2 主要试剂 5 3 附录3 实验中主要仪器设备 5 4 j 1 9 i 谢 j 攻读学位期间发表的学术论文 5 6 n 杀虫抗生景产生 r 的翻l 育及鼍 化性质初步研完 1 1 概述 第一章文献综述 随着世界人口的不断增加及耕地面积日益减少 我们对农作物的单产提出了 更高的要求 化学农药作为防治和抵御病虫草害中快速 有效 经济的重要手段 在全世界一度大面积的广泛应用 其对农业病虫害的防治曾起到功不可没的作 用 但近代它所造成的环境污染也日趋严重 同时大量化学农药的使用也导致了 生物抗药性的产生 这些不仅增加了综合治理的难度 也严重妨碍了农业的可持 续发展进程l 因此 符合环保 高效 低毒 低残留 环境相容性好的生物农 药开发成为当今农药研究的主题 自2 0 世纪9 0 年代以来 全球生物农药的产量每年以1 0 一2 0 的速度递增 目前 全世界生物农药年销售额达8 0 亿美元 大约占全世界农药销售额的2 0 2 1 1 9 9 2 年 世界粮农组织召开生物农药全球大会 提出生物农药要占二十一世 纪农药销售量的6 0 我国政府也已将生物农药列为 中国2 1 世纪议程 的优 先项目 而在这些生物农药品种中 9 0 以上是微生物农药 可见 微生物源农 药将是生物农药发展的主导方向 微生物农药是能够用来杀虫 杀菌 除草以及 调节植物生长等的微生物的活体及其代谢产物 它们是生物防治的物质基础和重 要手段1 3 1 生物农药除活体微生物外 主要是抗生素 它是微生物的次生代谢产物 具 有生物活性半衰期短 不易在植物体内长时间积累 对环境的影响较小等特点 近年来 具有杀虫 抑菌或除草活性的新型抗生素层出不穷1 4 尽管很多抗生素 因为种种原因未能商品化 但它们特殊的化学结构及生理活性使其有可能成为农 药合成的先导化合物 因此引起众多农药科学家极大的兴趣 成为新农药研究和 开发的热点之 5 6 1 1 1 1 农用抗生素的定义及其发展史 抗生素是生物包括微生物 植物 动物在其生命活动过程中所产生的次级代 谢物 能在低微浓度下有选择的抑制或影响其它的生物机能 就其本质来说它是 化学物质 农用抗生素即应用于农业生产的 用于防除病虫草害的抗生素m 只 广西大掌硕士掌位论文 举虫抗生景产生 r 的选 r a 曩化佳质初步研咒 有微生物的天然代谢产物才能称为抗生素 通过化学修饰的只能称为半合成抗生 素 根据天然抗生素的结构完全采用化学合成的方法制造的抗生素 则称为全合 成抗生烈引 抗生素的发展历史是人类长期以来对疾病 微生物及化学知识的了解 精心 观察 比较总结发展起来的 可以说在抗生素发展以前 我国劳动人民早在两千 年前就知道利用豆腐上的霉治疗疮疖等疾病 欧洲 南美 墨西哥等地的人民在 几世纪以前有人用发霉的面包 玉蜀黍 旧鞋来治疗溃疡病 肠感染和创伤等疾 病 人类真正利用抗生素是从发现生物之间的拮抗现象开始的 从1 9 世纪7 0 年 代开始 各国科学工作者相继发现微生物之间的拮抗现象i 叭 1 8 7 7 年 法国科 学家巴斯德 p a s t e u r 发现某些微生物对炭疽菌有抑制作用 他提出可以用一种 微生物抑制另一种微生物的现象来治疗疾病 此后 人们对微生物的代谢不断研 究 找到了许多抗生物质 如曲酸 青霉素酸等 但这些物质都没有临床治疗效 果 到了1 9 2 9 年 英国细菌学家弗莱日 q f l e m i n g 在做实验时发现了点青霉和其 发酵物质青霉素 但是 当时还不能把青霉素从发酵液中提取出来 直到1 9 4 0 年 英国科学家弗洛来 f l o r y 和查 e r n e s tc h a i n 才成功地提取出青霉素 并对其毒 性 生物学特性等方面进行了系统的研究 1 0 l 这样才确立了抗生素在以后发展中 的重要地位 农用抗生素的发展较医用抗生素晚些 早期美国 英国 日本等先后把链霉 素 土霉素 灰黄霉素等医用抗生素用来防治植物病害 同时也筛选到了一批如 放线菌酮 a c t i d i o n e 抗霉素脚i m y c i n 以及一些多烯类抗生素1 1 1 l 1 9 5 8 年 日本s e t s u o 等人研制成功了杀稻瘟菌素 s b l a s t i c i d i n s 1 并于1 9 6 1 年大面积应 用于稻瘟病的防治 基本上取代了有机汞制剂在防治稻瘟病上的应用 杀稻瘟菌 素 s 的发现和工业化 使农抗的开发研究进入了新时期 此后不久就开发了像 春雷霉素 k a s u g a m y c i n 多氧霉素 p o l y o x i n s 有效霉素c v z l i d a m y c i n 等高效低 毒无公害的新型农用抗生素 1 2 l 而且把农用抗生素的开发研究扩展到从微生物中 筛选杀虫 除草 抗病毒和植物生长调节剂等生理活性物质的研究 并筛选到了 四抗菌素 t e t r a n a c t i n 杀螨剂和双丙磷胺 b i a l a p h o s 等除草剂 现在农用抗 生素的研究方兴未艾 日本和西方发达国家正在加紧开发 综上所述 农用抗生素的发展可分为三个阶段 1 3 1 5 1 抗生菌的直接利用 2 广西大掌硕士掌位论文 杀虫抗生素产生 r 的选育a 0 重化性质初步研究 阶段 2 医用抗生素在农业上的利用阶段 3 农业上专用抗生素 农用抗生素 的创制和发展阶段 现在俄 美 日 德 甸 意 印度和丹麦等国 都已把农 用抗生素的研究列入国家重点规划 受到特别重视 我国农用抗生素的研究 开始于2 0 世纪5 0 年代初期 我国植病学家尹萃耘 先生1 9 5 3 年从陕西泾阳的老苜蓿根土中分离到 株放线菌 5 4 0 6 对棉花黄 枯 萎病有一定的防治效果 揭开了我国农用抗生素研究序幕 张志雍 沈其益等用 链霉素浸苗防治柑桔溃疡病 阍 到6 0 年代后期 中国科学院微生物所宋大康等 先生相继筛选出灭瘟素 春雷霉素 多抗霉素产生茵 先后投产 为我国农用抗 生素事业做出重大贡献 1 9 7 0 年国务院下发了 要积极推广微生物农药 的重 要指示 进一步促进了我国农用抗生素的发展 1 9 7 3 年上海农药所筛选出井冈 霉素产生菌 经多次诱变选出高产菌株 全国多家农药厂投产 每年使用面积达 1 亿亩以上 至今仍是防治水稻纹枯病的当家品种 每年应用面积达2 亿多亩次 为我国农用抗生素开发积累了丰富的经验1 1 7 近几年来 我国又筛选出多效霉素 公主岭霉素 抗霉菌素 浏阳霉素 杀蚜素等一批新型农用抗生素 有的己在农 业生产上发挥了积极作用 经济效益十分显著 1 s 1 9 在国内 研究力量较强的单 位有中国科学院微生物研究所 中国农科院原子能研究所 上海农药研究所 吉 林省农科院等单位 到2 0 世纪8 0 年代增加了中国农科院生防所 中国农业大学 中国科学院成都生物研究所 浙江农科院微生物所等十几家单位 到2 0 世纪9 0 年代又增加了一些省级农科院 农大及部分医药行业的研究单位 企业等 如湖 北农科院 西北农业大学 广东省农科院 中国医药科学院医药生物技术研究所 华北制药集团等十几家单位 现在从事农用抗生素研发的科研单位和企业达4 0 多家 随着我国科研体制的改革 研究人员已经认识到农用抗生素的研究 生产 与应用三者并重的重要性 对已形成商品化的品种 除加强高产菌株的研究外 有目的的加强生产过程中的发酵代谢控制 新剂型和产品田间应用技术的研究 进一步降低商品化品种的成本 提高其市场竞争力已成为共识1 2 0 2 1 1 农用抗生素出现虽然时间较短 但无论是在抗生素的品种 产量 质量还是 工艺方面 近三十年来的发展都是很快的 由于对一些病虫害目前尚无很好的药 剂来防治 化学合成农药开发的难度越来越大1 2 羽 人类对环境保护的呼声越来越 高 因此 作为生物防治重要内容的农用抗生素已经成为研究开发热点 3 除草农用抗生素 植物生长调节农用抗生素等 其中杀菌农用抗生素又分为抗细 菌病害抗生素 抗真菌病害抗生素 抗病毒病害抗生素三类 3 按作用机理农用抗生素可分为 抑制细胞壁合成的抗生素 阻碍原生 质膜功能的抗生素 抑制细胞蛋白质合成的抗生素 抑制核酸合成的抗生素等 4 按化学结构农用抗生素可分为 b 内酰胺类抗生素 氨基糖苷类抗生 素 四环类抗生素 大环内酯类抗生素 多肽类抗生素 多醚类抗生素 核苷类 抗生素等 2 4 1 农用抗生素具有以下6 个特剧2 5 捌 1 化学结构较繁杂与一般的化学农药及其它生物农药相比 大多数农 用抗生素的有效成分更为繁杂 2 活性高 选择性强 使用剂量低它可以以极低的剂量浓度对病原微生物 起到良好的抑制作用 3 与环境相容性好大多农用抗生素来自于自然界的微生物次级代谢产 物 它是生物合成的天然物质 在自然界容易降解 在环境中不易积累 残留期 短 对高等动物和非靶标生物影响较小 不致破坏生态平衡 4 毒性差别很大很多农用抗生素对高等动物和非靶标生物的毒性很低 例如 急性经口l d s o 剂量 井冈霉素大于1 0 0 0 0 m g k g 春雷霉素为2 2 0 0 0 m g k g 均 属低毒级 但也有一些农用抗生素的毒性为中毒甚至高毒级的 因此 在农用抗 生素的研究开发中 绝不可忽视毒性和安全性研究 5 生产原料多为可再生性资源通常农用抗生素的生产均采用发酵工程 进行大量生产 所用原料多为农副产品如淀粉 葡萄糖等可再生性资源 资源广 经济 适于大规模的工业生产 而且农用抗生素作为生物农药 同时具有化学农 药的性质 在剂型加工上明显优于其它生物农药 4 广 园r 大掌硕士掌位论文杀虫抗生素产生 r 的麓钉r 及鼍l 化性质初步研究一 6 生产设备通用性强与化学农药不同 农用抗生素所用的发酵设备具有 通用性 只需变换菌种 就可以改变生产品种 1 1 3 农用抗生素的作用机制 农用抗生素主要通过干扰病原微生物的生理生化代谢过程产生抗菌作用 其 主要作用机制主要有以下几种 1 抑制病原菌细胞壁合成敏感细菌细胞壁肽聚糖合成受抑制后细胞壁缺 损 菌体内部高渗 水分不断进入 引起菌体膨胀死亡 青霉素 p e n i c i l l i n 多氧 霉素 p o l y o x i n 等具有这种作用机制f 明 2 抑制细胞膜功能细菌的胞浆膜位于细胞壁内侧 其由类脂质和蛋白质 分子构成的半透膜进行物质交换 合成粘肽 脂多糖及保护菌体内所含物质不被 外露 作用于细胞膜的抗生素主要有两类机制i 硼 其一是破坏细胞膜的超微结构 造成细胞内成分流失 其二是作为特异离子运输载体 多烯类抗生素能选择性地 和真菌细胞质膜中的麦角兹醇结合 导致细胞膜渗透性改变 造成大分子和离子 等细胞内物质的外泄渗漏 使细胞受到损伤而导致细菌死亡 从而起到杀菌作用 多粘菌素等多肽类抗生素分子中的氨基能与细菌胞浆膜中的磷脂结合 导致细胞 膜的脂蛋白结构发生改变而引起细胞内成分外渗 矧 3 抑制或干扰细菌细胞蛋白合成合成蛋白质是细胞生长最基本的活动 蛋白质的合成受到抑制 势必影响微生物的生长 链霉素 春日霉素 杀稻瘟菌 素 嘌呤霉素等抗生素可以结合到细菌核糖体7 0 s 的3 0 s 亚基或5 0 s 亚基上 阻断肽链形成复合物的活动 导致错读或干扰新的氨基酸结合到新的肽链上 作 用于蛋白质生物合成环节的某一部位 产生抑菌甚至杀菌的作用 3 0 1 4 抑制d n a 和r n a 的合成抑制核酸合成的抗生素主要有喹诺酮类 乙胺嘧啶 利福平 磺胺类等 喹诺酮类抗生素是有效的核酸合成抑制剂 其抑 制d n a 螺旋酶 拓扑异构酶i i 阻碍d n a 生物合成 从而导致细菌死亡 利 福霉素抑制r n a 的合成 博莱霉素能引起肿瘤细胞和细菌d n a 的断裂 选择 性抑制d n a 的合成 3 1 5 广西大增明页士掌位能曙 杀虫抗生素产生 r 的选 r 及鼍l 1 性质初步研究 1 1 4 农用抗生素发展相关技术 1 1 4 1 发酵技术 发酵工艺中最为重要的问题之一是培养基的选择 发酵培养基是供菌丝迅速 生长繁殖并大量合成抗生素的营养物质 一般都是复合培养基 一种合适的培养 基应具备下列几个条件 营养适度而充分 浓度适中 适合菌种的生理特性 有 助于菌丝迅速健壮旺盛的生长 繁殖 在培养过程中 p h 值要适当而稳定 糖 氮代谢完全适应高单位发酵抗生素的要求 能在比较短的时间内合成抗生素 在 保障高单位发酵的条件下注意降低成本和消耗 还要依据发酵装置及下游技术工 艺的设计 控制等诸多因素 2 2 3 2 l p h 值也是影响抗生素高产的重要因素 因为p h 值直接影响催化次级代谢 活性酶分子的解离状态 为了维持一个比较稳定的p h 值范围 在培养基中应 加入合适的缓冲物质1 3 5 1 除了影响抗生素高产发酵的碳 氮 p h 外 还应注意适宜的温度及一定的 溶解氧 也要在培养基中加入合成所需的特定的微量元素 前体和促进剂掣矧 1 1 4 2 分离纯化技术 与上游过程相比 目前作为下游过程的生化分离和纯化手段往往步骤繁琐 处理时间长 收率低且重复性差1 3 7 1 纯化技术现在一般称作生物工业下游技术 其生产过程包括以下几个方面 1 预处理和固液分离f 5 j 发酵液预处理和过滤的目的不仅在于分离菌丝 除去杂质 而且还要改变滤液的性质 尽可能使抗生素转入同一相中 以利于后 继各步的操作 保证成品的质量 发酵液预处理的主要方法有热处理法 等电点 法 盐析法等 发酵液与菌丝体及固体杂质分离通常采用过滤或离心的方法 2 提取 初步分离 多数抗生素都存在于发酵液中 可从液体里面直接 提取 如果存在于菌丝体中的抗生素 必须用有机溶剂先将抗生素从菌丝体中浸 提出来 然后提取 一般的提取方法有以下几种 溶酶萃取法 吸附法 离子交 换法 沉淀法 上述几种提取方法可根据抗生素分离的难易程度单独或同时使用 3 精制 高度纯化 抗生素发酵滤液经第一步提取后 得到的通常是浓 6 广声大掌硕士掌位论文杀虫抗生素产生曹的选育及理化性质初步研书 缩液或粗制品 其纯度和最后成品相差很远 尚需进一步精制 得到结晶或无定 形的单一成分的纯品 由于抗生素是一些不太稳定的物质 因而精制方法也受到 一定限制 其常用的方法有色谱法 分子筛法 脱色和去热原质 沉淀 结晶和 重结晶等 3 s 为l l 1 4 3 抗生素的结构分析 根据化学结构 能将一种抗生素和另一种抗生素清楚地区别开来 化学结构 决定抗生素的理化性质 作用机制和抗菌范围 例如对于水溶性碱性氨基糖苷类 或多肽类抗生素 含氨基越多 碱性越强 抗菌谱逐渐移向革兰氏阴性菌 大环 内酯类抗生素对革兰氏阳性 革兰氏阴性球菌和分枝杆菌有活性 有中等毒性和 副作用 多烯大环内酯类抗生素对真菌有广谱活性 而对细菌一般无活性 四环 素类抗生素对细菌有广谱活性 结构上微小的改变常会引起抗菌能力的显著变 化 目前 鉴别一种新的抗生素常用的方法为光谱法和化学鉴定法1 4 0 4 2 1 包括紫 外 可见吸收光谱法 红外吸收光谱法 核磁共振波谱法 色谱分析法 质谱分 析法等 4 3 刖 对于抗生素结构中特殊的官能团可以用化学法鉴定 例如q 萘酚 试验 氯化铁试验 双缩脲反应 茚三酮反应等 通过这些方法鉴定抗生素的化 学结构 对抗生素的工艺生产及结构改造有很大帮助 1 i a 4 抗生素的结构改造 4 5 删 对生物源的生理活性物质进行结构改造获得比天然物质性能更优良的物质 在农药中也有很成功的先例 如除虫菊素的结构改造 合成了一大批化合物 其 中有很多已经实用化 在杀虫剂农药中占有约2 0 的份额 近年来对农用抗生 素的结构改造研究有很大的进展 对农用抗生素的结构改造的优点主要集中在以 下三个方面 1 使农用抗生素活性提高 2 对人畜及寄主植物毒性的降低 3 抗生素的稳定性得到提高 1 1 5 杀虫抗生素概述及筛选方法 世界上利用抗生素防治农业害虫的研究始于2 0 世纪5 0 年代 当时k i d o 等 报道了抗真菌抗生素抗菌素a 具有杀虫和杀螨活性 2 0 世纪6 0 年代后 人们开 7 j 西大掌硕士掌位论文杀虫抗生j 产生 r 的嗣l r 反理 l 宅e t 质初步研究 始有目的的筛选以杀虫为目的的新抗生素 相继筛选到了紫莱霉素 p o r f i r o m y c i n 密旋霉素 p a c t a m y c i n 普拉星隆 p r a s i n o m 及四活菌素 t e t r a n a c t i n 等有实用价值的的杀虫活性物质 进入2 0 世纪8 0 年代以来 杀虫抗生素逐步成 为抗生素研究领域的一个热点 一批新抗生素展现了很好的苗头 如t a k 抵m 等发现的由链霉菌产生的杀虫抗生素a l t e m i c i d i n 4 7 1 h a y a s h i 等发现的由简青霉 产生的杀虫抗生素0 k s r a m i n e l 鸽l 我国学者欧阳谅等发现的新a v e r m e c t i n 类抗生 素梅岭霉素 4 9 j 中国医科院医药生物技术所和日本北里研究所共同开发的杀虫抗 生素j i e t a c i n l 5 0 1 浙江省农科院微生物研究所筛选的杀蚜素 海农科院筛选的韶 关霉素 中国农科院原子能研究所筛选的7 8 杀虫素 山东济宁地区农科所筛选 的杀虫素4 8 上海昆虫研究所筛选的杀虫素4 4 号以及w a t a n a b ek 等人从红藻 中发现的具杀虫活性的抗生素z l a u r c a t i n 等均具有很大的研发潜力 对多个目 的昆虫 特别是锈壁虱 蚜虫 螨类 植病线虫 球虫等有效1 5 近年来 已投 入大规模使用的商品化杀虫抗生素主要有四活菌素 t e t r a n a c t i n 潮霉素 b d d s t o m y c i nb 米尔比霉素 m i l b e m y c i n 阿维菌素 a v e w r m e e t i n 德斯妥 霉素 d e s t o m y c i nb 等 珏 5 鄂 以其为主要成分的复配制剂已达8 0 多个品种 包括 杀螨素 杀虫丁 爱福丁 虫螨克 阿维虫清等 其中阿维菌素最为引人注目 它是m e r c k 公司开发的一种大环内酯类抗生素 原始菌种由日本北里研究所获 得 其作用机理是通过干涉害虫神经生理活动 刺激昆虫产生y 氨基丁酸i 弱 5 7 使害虫中央神经系统的信号不能被运动神经元接受 害虫几小时内迅速麻痹 拒 食 缓动或不动 约2 4 小时死亡 阿维菌素可用于防治小菜蛾 菜青虫 棉铃 虫 红蜘蛛 美洲斑潜蝇 梨木虱及螨类等主要农作物害虫 阿维菌素自2 0 世 纪8 0 年代投放市场以来 目前已成为继井岗霉素 b t 制剂之后 生物农药产业 的又一支柱产品 筛选是研究和开发新农药的第一步 常规筛选方法已难以满足对大量化合物 筛选的需求 为提高生测效率 建立高效的生测模型是非常必要的1 5 s i 实践表明 新型高效农用抗生素的发现是与新的筛选方法的建立紧密相连的 而新的筛选模 型的构建主要源于基础理论的研究成果和新技术的应用1 5 9 击1 1 在农抗研究与应用 的实践中 人们根据有害生物的防治对象 研究和构建了许多的筛选模型 这些 8 观察虫卵或成虫的排出情况 判断试验样品的抗虫效果 早期报道的抗寄生虫抗 生素几乎都是通过这种方法筛选出来的 日本北里研究所的研究人员用寄生虫 n a m a t o s p i r i d e sd u b i u s 感染小鼠后 经一定量的微生物发酵液同饲料混合喂 养感染成虫的小鼠 当检查小鼠粪便时发现了具有高效杀虫效果 由此导致了阿 维菌素的发现 体内筛选的优点是抗生素的有效性和毒性可以同时发现 有利于 迅速确定开发阶段的研究 缺点是过程过于复杂 费时费力 在一定时间内无法 筛选许多样品 而且直接用发酵液进行筛选影响因素也较多 结果判断较困难 该模型用于实验样品的复筛是很好的方法 2 活体筛选模型 线虫模型的体外筛选模型6 5 1 日本北里研究所k o t o g u r o 等人l 叩于1 9 8 8 通 过改良 改变传统中利用自有生活线虫为检定线虫的方法 选用松材线虫人工培 养 浸没试验 根据活线虫能下行穿过日本纸的原理 统计出死活线虫数量 得 出实验样品的致死率 利用该法 他们发现了两种新的抗生素j i e t a c i n a b j i e t a c i n s 是一类氧偶氮复合物 它是第一个被发现有杀虫活性的氧偶氮复合物 其具有强烈的杀原虫和杀虫活性l 明 卤虫 海水虾b r i n e s h r i m p 模型 晦7 0 l 卤虫是一种很小的甲壳动物 过去 常用它来鉴定有机化合物的毒性 人们选用它为杀虫剂的指示生物体 一方面是 有报道它对杀虫剂和杀螨剂十分敏感而且已经用来监测它们的残留物 另一方 面 卤虫卵在干燥条件下能保持数年 而且在2 4 小时内就可以孵化 b l i z z a r d 等人评价了数百种半合成的阿维菌素 结果与传统的测定方法很一致 c o n d e r 等人用这种模型从s t r e p t o m y c e ss p 中发现了一种新型的杀虫剂d i o x a p y r r o l o m y c i n l 7 1 刀 活体筛选模型的优点是 作为筛选的指示虫 躯体上存在着多种的药 9 杀虫抗生素产生 r 的选 r 及习l 化性质初步研究 物作用靶点 因此有利于各种不同作用机理药物的检出 同时筛选方法相对简单 经济 但筛选的选择性较差 故适合与大量样品的初筛 3 药物作用靶点的体外筛选方法 抗生素作用靶点机制的研究 极大地丰富了农抗筛选理论 为人们筛选高效 低毒的农用抗生素提供了依据 它具有灵敏度高 选择性强的特点 例如 杀粉 蝶素对温血动物表现很强的毒性 它主要抑制动物的呼吸链传递系统中辅酶q 的作用 抗霉素也抑制呼吸链中细胞色素b 到细胞色素c 之间的电子传递 因此 它们都表现对动物的高毒性 多烯类抗生素能和动物 真菌细胞质膜中的固醇类 化合物结合而造成细胞膜的泄漏 是一个抗真菌抗生素 但对动物有毒 因此抗 生素作用机制的研究 可以为阐明各种生物间生物化学变化的差别提供依据 从 而利用这些研究成果为我们筛选选择性强安全性高的农药提供理论基础 1 2 本课题研究的意义和内容 1 2 1 本课题研究的意义 农用抗生素的开发研究不仅直接为农作物病虫害的防治提供了新品种 为化 学家开发新的化学农药提供了先导化合物 更重要的是 农用抗生素由于源于生 物尤其是微生物的代谢产物 具有较好的环境相容性和可降解性而不同于化学农 药 就毒理作用而言 农抗的本质是对有害生物的靶点产生作用的 因此又不同 于某些病源真菌通过寄生产生杀灭作用而显得药效迟缓 可以想象 这种环境相 容性好且药效迅速的特殊生物农药 是有害生物综合治理不可缺少的重要手段 近年来 新农药的开发难度不断增大 成本大幅度上升 成功率明显下降 2 0 世纪6 0 年代约3 0 0 0 个化合物可筛得1 爪 矧 而今则数万个化合物方能获得1 个 农用抗生素的研究同样面临着这一问题 开发农用抗生素两个最重要的问题 一是材料 生物源 的选择 二是筛选模型的构建 放线菌是具有巨大使用价值的一类微生物 近十年来从微生物中发现的新活 性物质9 0 2 个 其中放线菌产生 的有6 6 8 个 占7 4 1 7 4 土壤是放线茵的重要 生存场所 土壤中放线菌含量异常丰富 一般1 9 土壤中通常含有1 0 0 0 万个放线 1 0 广西大掌硕士掌位论文 杀虫抗生素产生曹的选育及理化性质初步研究 革 因此开发土壤放线菌一直是研究的热点 我国地大物博 形态区域多样 气 候变化明显 是研究土壤放线菌的最佳区域 因此本论文主要是通过扩大筛选范围对我国不同区域环境下的土样进行广 泛筛选 通过建立快速筛选模型i 的 加 7 5 以期在短期内找到具有较强活性的杀虫抗 生素 并对出发菌株发酵条件 活性物质理化性质进行初步研究 1 2 2 本课题研究的内容 1 建立杀虫抗生素产生菌的快速筛选模型 2 对产杀虫活性物质菌株进行筛选 鉴定 以期找到具有较强活性的杀虫抗生素 3 出发菌株发酵条件优化 4 活性物质理化性质初步研究 杀虫抗生素产生 r 的选育a j 置化性质4 t j 1 a i l l 究 第二章杀虫抗生素产生菌的筛选和鉴定 2 1 材料与方法 2 1 1 样品及处理 从广西 云南 山东 山西 陕西 河南 河北等省份采集不同生态环境的 土样 装入无菌纸袋内带回实验室自然风干过直径为2 m m 筛 置2 5 恒温箱中 保存3 d 干燥后的土样与c a c 0 3 1 0 1 w w 混合 室温下保存备用 2 1 2 生测供试虫及其来源 卤虫 b r i n es h r i m p 卵 无棣金马水产有限公司赠送 使用时提前2 4 小时人 工海水孵化 家蚕 b o m b y xm o r i l i n n a e u s 卵购自广西蚕种有限公司 室内人工饲养 2 1 3 菌株 试验菌株为土壤分离获得的菌株 抑菌试验供试菌有 粘红酵母 r h o d o t o r u l ag l u t i n i s 由本实验室保藏 华丽曲霉c a s p e r g i l l u so r n a t u s 由本实验室保藏 枯草芽孢杆菌 b a c i l l u s s u b t i l i s 由本实验室 大肠杆菌 e s c h e r i c h i ac o l i 由本实验室保藏 稻瘟病菌 m a g n a p o r t h eg r i s e a 由广西大学农学院植病室赠送 2 1 4 主要试剂及培养基配制 人工海水 孵化卤虫卵用 g 1 n a c l2 6 5 m g c l 22 4 5 m g s 0 43 3 1 c a c l 2 1 4 1 n a h c 0 30 2 0 n a b r0 0 8 3 k c l0 7 2 5 筛选分离培养基 g 1 可溶性淀粉2 0 k n 0 31 n a c l0 5 k 2 h p 0 41 广西大掌硕士掌位嵌誓起 m g s 0 4 7 h 2 00 5 f c s 0 40 0 1 高氏一号固体培养基 g 1 m g s 0 4 7 h 2 00 5 f c s 0 40 0 1 2 1 5 实验方法 2 1 5 1 土样稀释液的制备 准确称取土样1 0 9 放入装有9 0 m l 无菌水与小玻珠的2 5 0 m l 三角瓶中 充 分振荡后 再用l m l 无菌枪吸取l f f l 稀释液l m l 移入装有9 m l 无菌水试管中 摇摇匀 让菌液混合均匀即成1 0 之稀释液 以此类推 最后稀释到1 0 5 稀释液 实验所需浓度为1 0 3 1 0 4 和1 0 5 3 个稀释浓度 2 1 5 2 放线菌的分离 纯化及归类 准确移取0 2 m l 土样稀释液涂布于分离培养基平板 2 8 下培养5 7 d 观 察放线菌的菌落大小 形状及所产色素颜色 将成熟的放线菌单菌落分离培养并 转接至高氏一号斜面培养基 备用 2 1 s 3 发酵培养及发酵液预处理 将待测菌株接入高氏一号液体培养基进行发酵培养 2 8 3 0 1 6 0 r m m 震荡培养6 8 d 直至发酵液颜色逐渐加深 菌丝体碎片逐渐增多 停止发酵 将发酵液进行离心抽滤 滤液于4 冰箱保存备用 2 1 5 4 建立筛选模型 1 卤虫初筛 取各待测茵发酵滤液l m l 于2 m le p 管中 每管加入0 1 m l 卤虫液 约1 0 1 5 头卤虫 分别于3 0 1 1 1 j n 6 0 m j n 后肉眼观察并统计卤虫死亡率 每处理3 个重复 设无菌水作对照 对照死亡率控制在5 以内 1 3 广西大学硕士学位 玲文杀虫抗生 y 生 r 的翻 育及习l 化性质初步研究 2 家蚕复筛 干净桑叶用牙签穿刺戳孔置于平皿中 用脱脂棉将浓缩1 0 倍的发酵滤液 l m l 均匀涂抹于桑叶两面 盖上皿盖 室温放置5 h 后将桑叶表面吹干 将禁食 5 h 的3 龄幼蚕1 0 头置于培养皿中 观察试虫的中毒反应并记录2 4 4 8 小时后 的死亡率 每处理3 个重复 设无菌水作对照 对照死亡率 1 0 卤虫卵 2 0 2 4 h 孵化 卤虫初筛 4 0 x 家蚕复筛 图2 1 筛选模型图解 f i g 2 1t h ei l l u s t r a t i o no fs c r e e n i n ga s s a y 2 1 5 5 抑菌活性测试 1 平板对峙法 用打孔器将目的菌株与供试菌的带菌琼脂块移接到同一培养基平板上 相距 3 0 a n 置于培养箱中培养 观察抑菌效果 2 发酵液拮抗对峙法 将培养好的供试菌做适当稀释 取0 1 m l 于相应培养基平板上 用涂棒铺 满整个平板 用等大小的海绵球蘸取经过滤除菌的目的菌株发酵液至饱和吸收状 态 置于平板中央 于培养箱中培养 观察抑菌效果 2 1 5 6 菌种保藏 1 斜面低温保藏 在超净工作台上取菌种试管斜面在培养基平板上划线接种 置2 8 0 培养箱 中培养 观察菌株生长形态 挑选生长较好的茵落用接种环在斜面培养基上划线 1 4 广西大掌硕士掌位论文 杀虫抗a t 景产生 r 的选育及习t 化性质 韧r 步研究 当菌体或孢子生长丰满以后 放入4 冰箱中 或室温下 保藏 2 石蜡油封存法 待保藏的菌种在斜面培养基上生长成熟后 向菌种斜面上倒入一层经湿热灭 菌后1 2 0 烘去水分的石蜡油 用量要高出斜面1 厘米 以橡皮塞代替棉塞封口 然后直立保存在冰箱中或低温干燥处 2 1 5 7 菌株鉴定 1 培养特征及生理生化特征鉴定 按s h i r l i n g 和g o t t l i c b 7 7 1 的方法观察并记录目的菌株的培养特征和生理生化 特性 2 1 6 sr d n a 的p c r 扩增及序列分析 提取待测菌株总d n a 作为模板 采用通用1 0 f 1 5 0 0 r 引物 正向引物 5 a g a g t r t g a t c c t g g 1 c a g 3 反向引物 5 g g t i a c c l l g t t a c g a c t t 3 进行1 6 sr d n a 的p c r 扩增 p c r 扩增条件 9 4 5 m i n 9 0 3 0 s e c 6 0 cl m i n 7 2 31 5 m i n 3 0 个循环 7 2 c5 m i n 7 8 7 9 8 0 扩增产物经纯化后 送上海基康生物技术有限公司测序 将序列在网上提交r d p 数据库 应用b l a s t 程序与数据库中已有的细菌1 6 sr d n a 序列进行相似性比较分析 序列的比较分 析及系统发育树分析采用c l u s t a l w 软件进行 2 2 结果与分析 2 2 1 杀虫抗生素产生菌的初筛 将分离得到的2 4 0 株放线菌菌株发酵培养 发酵滤液进行卤虫活性初步筛选 得到1 8 株可产生杀虫活性的菌株 筛选方法见卤虫初筛方法 初筛结果见表2 1 其中四株菌的杀虫活性最高 分别为 g x 2 9 s x 8 8 s x 8 9 h n 1 0 7 1 5 o o o o o 一 广西大掌硕士学位论文 杀虫抗生素产生曹的选育反理化性质初步研完 2 2 2 杀虫抗生素产生菌复筛 对初筛所得4 株杀虫活性最高菌株进行家蚕毒力测试 4 8 小时后观察记录结果 见表2 2 图2 2 运用统计学最小显著极差法 l s r 法 进彳亍比较 可看出g x 2 9 为比较理想菌株 故作为本实验的出发菌 并对其进行分类学的鉴定 表2 1 初筛结果 t a b l e2 1t h er e s u l to fp r i m a r ys c r e e n i n ga s s a y 菌株编号 平均致死率 平均致死率 一 菌株编号 3 0 m i n 6 0 r a i n3 0 m