DNA甲基化检测技术.ppt

DNA甲基化检测之甲基化特异性HRM检测技术 Methylation sensitivehighresolutionmelting 内容提示 DNA甲基化的定义及生物学意义MS HRM检测的原理MS HRM检测的方法及步骤MS HRM检测结果分析 DNA甲基化的定义在甲基转移酶的催化下 DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基基团的化学修饰现象 DNA甲基化的形式 DNA甲基化主要形成5 mC和少量的N6 甲基嘌呤 N6 mA 及7 甲基鸟嘌呤 7 mG CpG岛 CpGIsland 在基因组的某些区域中 通常是基因的启动子区域 5 端非翻译区和第一个外显子区 CpG序列密度非常高 超过均值5倍以上 成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区 称之为CpG岛 CpGIslands CGIs 正常结构基因组中70 90 的独立CpG都被甲基化 未甲基化的CpG成簇地聚集形成CpG岛主要位于结构基因的启动子和第一外显子区域 约有60 以上基因的启动子含有CpG岛 是结构基因启动子的核心序列和转录起始点 CpGisland的功能 通过甲基化与去甲基化 调控下游基因的表达 基因表达的调控开关 DNA甲基化的生物学意义 1 转录抑制基因启动子区的甲基化可影响转录激活因子和其识别序列的结合 DNA甲基化的生物学意义 2 影响基因表达直接抑制基因表达或甲基化的CpG双核苷酸序列可被甲基结合蛋白家族识别 而后者可通过吸引补充组蛋白去乙酞化酶和组蛋白甲基化转移酶等组蛋白修饰蛋白质来改变染色质的活性 以间接方式影响基因表达 3 损伤与修复一方面参与凋亡和修复的基因受DNA甲基化调控 另一方面异常甲基化往往会导致DNA的多种损伤 此外 甲基化还可能直接参与DNA损伤的识别和修复过程 4 其他 甲基化还参与DNA的复制和包装及DNA片段的转座等 基因组甲基化的特点 可逆性 许多甲基化位点可以根据细胞活性的要求重新甲基化或去甲基化 组织特异性 不同的组织细胞具有不同的甲基化模式 为基因表达设定程序 异常的甲基化可分为高甲基化和低甲基化 前者指正常组织中不发生甲基化的位点被甲基化 后者是指在正常组织中发生甲基化的位点去甲基化 DNA甲基化与肿瘤的关系 肿瘤细胞的特征 癌基因低甲基化 被激活 抑癌基因高甲基化 被沉默甲基化水平与肿瘤生物学特性密切相关 DNA甲基化水平越低 染色体越容易发生功能异常 肿瘤的浸润能力就越高 临床分期也愈晚 常见易被甲基化的抑癌基因与修复基因及其作用 DNA甲基化与肿瘤的关系MGMT基因在许多肿瘤中被认为是抗肿瘤药物治疗的预测标记 MGMT启动子肿瘤特异性甲基化 可以抑制MGMT蛋白的活性 从而使得肿瘤细胞对烷化类的抗肿瘤药物敏感 因而被广泛用于肿瘤化疗治疗 Figure Kaplan MeierEstimatesofOverallSurvival AccordingtoMGMTPromoterMethylationStatus DNA甲基化的检测方法 DNA甲基化的检测方法MS HRM检测技术目前 甲基化检测的方法很多 例如甲基化特异性PCR Northern印迹法 Western印迹法 免疫细胞化学等 这些检测方法由于需要花费大量时间 成本高等等 在临床推广应用时均存在一定的困难 最新报道了一种基于熔解曲线的高分辨率熔解 HighResolutionMelt HRM 的新方法 为甲基化的检测带来了新的曙光 用HRM方法检测MGMT启动子区域内的甲基化状态 可检测低达0 1 的甲基化程度 并且可以根据已知甲基化程度的标准曲线对未知样品的甲基化百分比进行测定 MS HRM检测技术原理采用重亚硫酸盐处理DNA模板后 在非CpG岛位置设计一对针对经亚硫酸氢钠处理后DNA链的引物 这对引物中间包含有意义的甲基化CpG岛 一旦这些CpG岛发生甲基化 胞嘧啶不发生变化 而未甲基化的胞嘧啶转变成胸腺嘧啶 样品中的GC含量发生了变化 最终被转化成了熔解曲线Tm值之间的差异 CpG位点在小的扩增片段内的相对位置也会对熔解峰的形状产生影响 因此 根据Tm值和熔解峰的形状可以检测出样本的甲基化位点和甲基化程度 MS HRM检测方法及步骤引物设计 引物需包含 个CpG二核苷酸序列 CpG二核苷酸序列应尽量靠近引物的 端 引物的Tm值应尽量接近 最好控制在 内 引物的 端应包含有 个或多个T碱基 从而确保只有经过重亚硫酸盐修饰的DNA模板得到扩增 引物不能有二聚体存在 扩增子的长度尽量控制在100bp左右 MS HRM检测方法及步骤引物设计 MS HRM检测方法及步骤2 DNA样本的准备 可使用新鲜组织或石蜡组织样本 一般不使用血液样本 3 仪器选择 一般可进行HRM分析的仪器均可 如LightCycler480 Roche RotorGene6000 CorbettResearch AppliedBiosystems7500FASTreal timePCRsystem AppliedBiosystems LightScannerSystemandtheHR 1instrument IdahoTechnologies MS HRM检测方法及步骤4 DNA样本的甲基化修饰 可使用FFPETissueKit QIAGEN 对DNA甲基化修饰及回收 3 PCR扩增 上样体系PCR HRM反应程序 MS HRM检测方法及步骤上样体系 MS HRM检测方法及步骤b PCR HRM反应程序 MS HRM检测结果分析 MGMT甲基化检测的标准曲线图 MS HRM检测结果分析 MS HRM检测结果分析 Figure1 TheeffectofthePCRannealingtemperatureonthesensitivityoftheATMMS HRMassay Thedilutionsofmethylatedandunmethylatedtemplatesareindicatedasfollows 100 methylated red 10 methylated blue 1 methylated greenand0 1 methylated brownandunmethylated black MS HRM检测结果分析 Figure4 TheMS HRMassayforBNIP3methylation ResultsoftheBNIP3 MS HRMassayforfiveclinicalsamplescomparedtothedi