（化学工程专业论文）卵黄免疫球蛋白的分离纯化研究.pdf

摘要 在本论文中，采用氯仿甲醇法系统考察了水稀释法的操作参数对卵黄除脂率的影 响，获得了水稀释法的最佳脱脂工艺为：利用去离子水将卵黄溶液稀释6 倍，调节p h 至5 0 ，在2 0 0 c 冷冻8h 后，4 0 c 离心5m i l l ，最小离心力为1 2 0 0 x g ，经上述处理后， 除脂率可达1 0 0 。 利用参数扫描超滤技术对脱脂后的i g y 粗溶液进行了分离和纯化研究。考察的超滤 工艺有两种：( 1 ) 利用1 0 0 k d a 再生纤维素膜进行单步分离。最佳分离工艺条件为：3 0 m mn a c l + 1 0m m 磷酸钠缓冲溶液( p h6 o ) ，搅拌速率6 0 0r p m ，流速1 3 3l m 2 h 。利用 此工艺获得的i g y 纯度为8 5 ，回收率为9 0 ；( 2 ) 利用1 0 0 k d a 聚醚砜膜和1 0 0 k d a 再生纤维素膜进行二级分离。1 0 0 k d a 聚醚砜膜的最佳分离工艺条件为：7 0m mn a c i + 1 0m m 磷酸钠缓冲溶液( p h 8 o ) ，搅拌速率1 2 0 0r p m ，流速2 6 5l m 2 h ；1 0 0 k d a 再生 纤维素膜的最佳分离工艺为：7 0m mn a c l + 1 0m m 磷酸钠缓冲溶液( p h 4 5 ) ，搅拌速 率6 0 0r p m ，流速1 3 3l m 2 h 。利用此工艺获得的i g y 纯度为9 3 ，回收率为8 5 。 通过等点聚焦、电泳、圆二色光谱、红外光谱和抑菌实验等对超滤获得i g y 进行了 分析和表征，从实验结果可知，i g y 的等电点为p i6 2 ；i g y 分子由两条重链和两条轻链 组成，重链6 8k d a ，轻链2 8l d ) a ，i g y 的分子量约为1 9 2k d a ；其二级结构中p 折叠占 j 4 8 ；活性高于盐析法获得的i g y 产品。 关键词：卵黄免疫球蛋白；膜分离；超滤；蛋白质分离；水稀释法 t h e s t u d yo fi s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fi m m u n o g l o b u l i n f r o mh e n e g gy o l k y a n gj u a n ( c h e m i c a le n g e n e e r i n g ) d i r e c t e db yp r o f e s s o rx u h a l ，l i uj i a n g u o a b s t r a c t i nt h ep r e s e n tw o r k , t h ep a r a m e t e r so fw a t e rd i l u t i o nm e t h o da r eo p t i m i z e dt or e m o v et h e l i p i d s f r o me g gy o l ku s i n gc h l o r o f o r m m e t h a n o lm e a n s t h e o p t i m a lc o n d i t i o n sa r e f o l l o w i n g s ：t h ey o l kc o n t e n ti sm i x e dw i t hs i xv o l u m e so fd i s t i l l e dw a t e r , a d j u s tt h es o l u t i o n p h t o5 0a n df r o z e na t - 2 0 0 co v e r8h t h em i x t u r ei st h a w e da n d c e n t r i f u g e da t4o c ，1 2 0 0 x g f o r5m i n u t e s t h er a t eo fr e m o v e dl i p i d sc o u l da r r i v e10 0 u n d e ro p t i m a lc o n d i t i o n s t w od i f f e r e n tm e m b r a n em e t h o d s w e r es t u d i e dt oi s o l a t ea n d p u n f yi g y ( i m m u n o g l o b u l i nf r o me g gy o t k ) f r o mt h ec r u d ee n z y m es o l u t i o nu s i n gp a r a m e t e rs c a n n i n g u l t r a f i l t r a t i o n o n em e t h o di st h e s i n g l e s t a g eu l t r a f i l t r a t i o nu s i n g 10 0 - k d ar e g e n e r a t e d c e l l u l o s e ( r c ) m e m b r a n e t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n sa r ef o l l o w i n g s ：10m mp h o s p h a t eb u f f e r c o n t a i n i n g3 0m mn a c i ( p h6 o ) ；s t i r r i n gs p e e d , 6 0 0r p m ；p e r m e a t ef l u x ，13 ，3l m 2 h u n d e r t h e s ec o n d i t i o n s ，t h ep u r i t ya n dr e c o v e r yo fi g ya r e8 5 a n d9 0 ，r e s p e c t i v e l y t h eo t h e r m e t h o di st h et w o s t a g eu l t r a f i l t r a t i o nu s i n g10 0 - - l c d ap o l y e t h e r s u l f o n e ( p e s ) m e m b r a n ea n d 10 0 一k d ar cm e m b r a n e t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n sf o r10 0 - k d ap e sm e m b r a n ea r e f o l l o w i n g s ：1 0m mp h o s p h a t eb u f f e rc o n t a i n i n g7 0m mn a c l ( p n8 0 ) ；s t i r r i n gs p e e d ，1 2 0 0 r p m ；p e r m e a t ef l u x ，2 6 5l m 2 h ；t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n sf o r10 0 一k d ar cm e m b r a n ea r e f o l l o w i n g s ：1 0m m p h o s p h a t eb u f f e rc o n t a i n i n g7 0m mn a c l h4 5 ) ；s t i 仃i n gs p e e d ，6 0 0 r p m ；p e r m e a t ef l u x ，13 3l m 2 h u n d e rt h eo p t i m i z e dt w o - s t a g ec o n d i t i o n s ，t h ep u r i t ya n d r e c o v e r yo fi g ya r e9 3 a n d8 5 ，r e s p e c t i v e l y t h ef i n a lu l t r a f i l t r a t i o np r o d u c t , i g ya r ec h a r a c t e r i z e da n da n a l y z e db yi e f , s d s - p a g e ， c d ，f t i ta n dd l s o nt h eb a s i so fe x p e r i m e n t a lr e s u l t s ，t h ef o l l o w i n gi n f o r m a t i o ni s o b t a i n e d ：t h ei g ym o l e c u l a ri sc o n s i s t e do ft w oi d e n t i c a lh e a v yc h a i n s ( 6 8k d a ) a n dt w o i d e n t i c a ll i g h tc h a i n s ( 2 8k d a ) t h e r e f o r e ，t h em o l e c u l a rw e i g h to fi g yi sa b o u t19 0k d a t h e i s o e l e c t r i cp o i n to fi g yi sa b o u t6 2a n dt h e r ea r e4 8 o f1 3 - s h e e ti ni g ys e c o n d a r ys t r u c t u r e t h eu l t r a f i l t r a t i o np r o d u c ti g yh a sah i g h e ra c t i v i t yt h a nt h a tf r o m s o d i u ms u l p h a t e p r e c i p i t a t i o nm e t h o d k e yw o r d s ：i m m u n o g 【o b u l i ny m e m b r a n es e p a r a t i o n ；u l t r a f i l t r a t i o n ；p r o t e i nf r a c t i o n a t i o n ； w a t e rd i l u t i o nm e t h o d 关于学位论文的独创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在指导教师指导下独立进行研究工作所取得的成 果，论文中有关资料和数据是实事求是的。尽我所知，除文中已经加以标注和致谢外，本 论文不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得中国石油大学 ( 华东) 或其它教育机构的学位或学历证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对研究 所做的任何贡献均己在论文中作出了明确的说明。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文作者签名：葺之蝤日期：压哆年占月u 曰 学位论文使用授权书 本人完全同意中国石油大学( 华东) 有权使用本学位论文( 包括但不限于其印刷 版和电子版) ，使用方式包括但不限于：保留学位论文，按规定向国家有关部门( 机 构) 送交学位论文，以学术交流为目的赠送和交换学位论文，允许学位论文被查阅、 借阅和复印，将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，采用影印、缩 印或其他复制手段保存学位论文。 保密学位论文在解密后的使用授权同上。 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期：砷年6 月够日 日期：呷年石月v 日 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 第一章前言弟一早日ui 1 1 免疫球蛋白 免疫球蛋i 刍( i m m u n o g l o b u l i n ) 是一类具有抗体活性的糖蛋白，主要存在于动物的血 浆中，也见于其他体液、组织液及外分泌液中，是机体受抗原( 如病原体) 刺激后产生的， 其主要作用是与抗原起免疫反应，生成抗原抗体复合物，从而阻断病原体对机体的危 害，使病原体失去致病作用。所以，免疫球蛋白在动物的免疫和生理调节过程中起着重 要作用，是动物体内免疫系统最为关键的物质之一。 免疫球蛋白的分子量较大，通常由1 0 0 0 个以上的氨基酸连接而成，其基本结构由 四肽链组成( 如图1 1 ) ，即两条相同的重链( h 链) 和两条相同的轻链( l 链) 通过二硫键连 接形成“y 字型对称性结构。 2 】2 f s b 段 抗磁缝念蓐缝 图1 - 1 免疫球蛋白的结构图 变区 f i g l 。1 t h es t r u c t u r e o fi m m u n o g l u b u l i n 依据抗原性的不同，免疫球蛋白可分为免疫球蛋白g ( i g g ) 、免疫球蛋白a ( i g a ) 、 免疫球蛋白d ( i g d ) 、免疫球蛋白e ( i g e ) 和免疫球蛋白m ( i g m ) 五大类。其中，i g g 占总 免疫球蛋白的7 5 ，是初级免疫应答中最持久、最重要的抗体，在抗感染中起到主力军 的作用，它不仅能够促进单核巨噬细胞的吞噬作用( 调理作用) ，中和细菌毒素的毒性( 中 和毒素) ，还可以与病毒抗原结合使病毒失去感染宿主细胞的能力( 中和病毒) 。i g g 仅以 第一章前言 单体形式存在，也是唯一能通过胎盘的免疫球蛋白，在自然被动免疫中起重要作用。 近年来，国内外的科技人员利用动物血清已经研制出了针对不同抗原的免疫球蛋 白，这些抗原包括人和动物某些疾病的病原体以及细胞、激素等。由于哺乳动物与人类 之间的物种系发生学距离较近，容易发生交叉血清反应，此外，从血液中提取免疫球蛋 白还受到产量的限制。所以，寻找一种能够大量获得、安全性高、廉价易得的抗体来源 成为关注的焦点。 1 8 9 3 年，k l e m p e r e r i l 】发现母鸡的抗体是从血清传递到鸡卵黄中的，授予鸡胚胎或 雏鸡的被动免疫性。19 6 3 年w a r n e r 与s z e n b e r g 2 发现鸡的腔上囊与产生抗体免疫球蛋 白相关。1 9 6 9 年l e s l i e 与c l e m 3 1 指出鸟类、爬行动物和两栖动物的卵黄中仅含有免疫 球蛋白i g g 一种成分，其分子量比血液中的i g m 、i g e 等小，并首次将卵黄中的i g g 命 名为i g y ( i m m u n o g l o b u l i ni ny o l k ) 。 随着免疫学和生物化学检测技术的迅速发展，实验用抗体的制备及纯化己成为一个 重要的问题。与哺乳动物抗体i g g 相比，i g y 具有许多突出而重要的优点，这些优点使 i g y 可广泛应用于免疫检测、生化检测及口服防治某些疾病，如抗组织蛋白酶d 抗体 4 1 、 抗弱免疫原r n a 多聚酶i i 的抗体【5 】、抗蛇毒抗体网、抗致肠病的大肠杆菌抗体7 1 等。所 以，从卵黄中获取大量特异抗体i g y 已越来越受到人们的重视，研究卵黄免疫球蛋白的 分离纯化工艺，寻找一种简便、高效、经济的提取方法，具有重要的应用价值。 1 2 卵黄免疫球蛋白 1 2 1 卵黄免疫球蛋白的的概述 卵黄免疫球蛋i 刍( i g y ) 是指卵黄中存在的主要免疫球蛋白，当用某种抗原免疫母鸡 时，母鸡产生免疫反应，在卵黄成熟期，血液中的免疫球蛋白i g g 选择性的转移到卵黄 中，形成卵黄免疫球蛋白( i g d ，i g y 在仔鸡孵育过程中和孵育后对仔鸡起保护作用。 i g y 的性质与哺乳动物的i g g 类似，其分子量约1 8 0k d a ，由两条相同的轻链和两 条相同的重链组成，其中，轻链的分子量约2 2k d a ，重链分子量约6 7k d a ，等电点接 近6 2 。i g y 与i g g 在结构上存在一定的差异，i g y 的重链含有4 个不变区和一个可变区， 没有铰链区。i g g 的重链含有三个不变区和一个可变区，且含有铰链区。 由于鸡与哺乳动物物种系发生学的距离较远，i g y 与哺乳动物血液中的i g g 相比有很 多优点：( 1 ) 从母鸡产下的蛋中很容易获得i g y 抗体，一枚鸡蛋可得1 0 0 2 5 0m gi g y 【5 l ， 这相当于每2 3 个星期从一只家兔的血清中提取抗体的- i t s , 明；( 2 ) i g y 不与血清中的类风 2 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 湿因子结合【1 0 】；( 3 ) 不激活哺乳动物补体系统【1 1 1 ；( 4 ) 不与f c 受体结合【1 2 1 ，可避免在免 疫检验过程中产生假阴性或假阳性结果【1 3 】；( 5 ) 产生有效免疫反应所需抗原量小，尤其 是高度保守的哺乳动物对种系发生学距离较远的禽类通常有较强的免疫原性；( 6 ) i g y 的 性质稳定，在p h4 0 1 2 ，温度低于7 5 0 c 下，i g y 活性几乎不受影响；( 7 ) 从卵黄中提 玟i g y 还可以避免对动物的伤害，其成本低，产量高，适合大规模的生产。 虽i g y 技术已被公认为是从哺乳动物血液中获取抗体的最佳替代手段。然而，该技 术至今却未能获得大规模的推广和应用，其主要原因在于i g y 的分离纯化较为困难。卵 黄中脂肪含量高达3 0 5 ，且大部分蛋白与脂肪结合形成脂蛋白【1 5 】。所以，提取i g y 首 先需要解决的问题就是去除卵黄中的脂肪。 1 2 2 卵黄脱脂工艺 鸡蛋中脂质与蛋白质之比约为2 ：l ，其中大部分脂类和蛋白质相结合以脂蛋白的形 式存在。这些脂蛋白多数存在于蛋黄颗粒中，一部分与卵黄球蛋白( 包括i g y ) 同时存在 于蛋黄浆状液中。因此，i g y 的提纯最重要的一步是去除脂肪和脂蛋白吲。早先i g y 主 用于免疫学研究和临床试验等方面，初步脱脂分离常用一些有机试剂，如氯仿、丙酮、 丙烷乙醇等，试剂用量大，成本昂贵。八十年代后随口服被动免疫的日益受消费者重 视，需要大规模生产i g y ，于是一些新的分离方法被开发出来1 1 3 1 。 i 2 2 1 水稀释法 水稀释法是由心t a 和n a l 【a i 【1 q 于1 9 9 2 年首次提出，主要用于蛋黄液中亲水性部分和 疏水性部分的分离。即将蛋黄液稀释一定倍数，调节溶液p h 值，混匀静置后离心分离或 长时间静置分离。后来，s v e n d s e n 1 7 1 以及m a y ad e v i 1 8 1 对水稀释法做了进一步改进，将 稀释后的卵黄溶液进行冻融和离心处理，使卵黄脱脂率大为提高。 水稀释法的优点：( 1 ) 简单、快速，脱脂效率高，且生产成本低；( 2 ) 易于放大， 适于规模化生产；( 3 ) 不添加化学试剂，不损害i g y 活性，安全性高，不会影响脂类的进 一步利用。水稀释法的缺点是由于对卵黄液的大量稀释，导致i g y 浓度降低，粗酶液体 积变大，增加了后续分离纯化的难度和工作量。 1 2 2 2 有机溶剂抽提法 根据相似相容性原理可知，脂肪易溶于有机溶剂中，有机溶剂还可使脂蛋白变性， 有利于除去脂类。常采用氯仿、辛酸等有机溶剂进行分离。 h a m a d a 1 9 】使用的氯仿抽提法为：一定体积的鸡卵黄溶于相同体积的盐溶液中，再 3 第一章前言 与2 倍体积的氯仿在2 0 0 c 下混合3 0r a i n ，离心后分为两层，下层沉淀为去除的脂蛋白， 上层清液即水溶性组分( w s f ) 。n t a k a r u t i m a n a 2 0 1 使用的方法略有不同：首先将鸡卵黄 1 5m l 溶于4 0m l t r i s h c l 缓冲溶液( t b s ) 中，搅拌1 0m i l l 后加入4 0m l 氯仿，充分混匀后 4 0 c 放置2 4h 。离心后分为三层：最上层为水相，1 1 1 w s f ；最下层为有机相，将被弃去； 中间层为半固体层，重新溶解于t b s 中，离心后可得到更多的w s f 。m c l a r e n r 2 1 1 用辛酸 分离i g y ，鸡卵黄用2 倍的磷酸盐缓冲溶液( p b s ) 稀释，用醋酸调节p h 至4 6 ，缓慢加入辛 酸至终浓度为6 ，室温下混匀离心后，分为两层，上层为亮黄色油层，下层为含有i g y 的清液。 有机溶剂抽提法省时简便，除脂的效果比较理想，但是不可避免的存在有机物的残 留，影响产品的品质，这种方法还会影响抗体活性、干扰免疫检测反应。 1 2 2 3 天然胶法 一些天然胶如卡拉胶和黄原胶可用于卵黄抗体分离。虽然天然胶法沉淀卵黄脂蛋白 的机理还尚不清楚，但是实验结果表明天然存在的酸性胶去除脂蛋白的效果明显。一般 认为天然胶去脂的机理是通过电荷作用以离子键的形式结合形成沉淀，将脂肪去除。 h a t t a t m 用黄原胶( x a nt h a n ) 提取i g y ，将卵黄溶于相同体积的双蒸水中，再与4 倍于 卵黄体积的黄原胶充分混合，离心，得到的上清液中即含有i g y 的水溶性蛋白，蛋白回 收率1 8 1 ，除脂率9 9 3 。h a t t a 还使用另一种生物制剂n 角叉藻胶，将鸡卵黄与9 倍于 其体积的0 1 ( w v ) x - 角叉藻胶充分混合，离心后除脂率9 9 7 ，w f s 中的蛋白回收率为 2 0 2 。使用生物制剂的优点在于方便、安全，除脂效率高，但缺点是成本较高。 1 2 2 4 非离子型去污剂分离法 非离子去污剂是蛋白质的非变性剂，这类去污剂具有两亲性结构，疏水基是具有活 泼氢原子的疏水化合物，其机理是作用在界面上的表面活性剂分子，降低了界面自由能， 改变污垢与基质的界面性质，通过吸附层电荷相斥或吸附层的铺展压，使污垢从基质上 移去。 s r i r a m 2 3 1 比较了几种去污剂包括阴离子、阳离子和非离子型去污剂，与其他去污剂 比较，用溴化十六烷基三甲铵进行分离，脂类的残留量不足3 ，蛋白回收率7 0 7 5 ， 而用去污剂十二烷基磺酸钠分离残留量最高，为1 4 3 5 ，用非离子型去污剂辛苯聚醇 8 分离时，脂肪残留量较少，蛋白回收率可达8 5 9 0 。s t a l b e r g 矧用非离子型去污剂 t x 1 0 0 分离，蛋白回收率可达9 7 ，脂类残留不足6 5 。但是去污剂成本高，有毒性， 不利于在食品和医药上应用。 4 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 1 2 2 5 超临界气体提取法 上述几种方法都是将卵黄稀释，而超临界气体提取法是通过喷雾干燥获得卵黄粉 末。所得卵黄粉末通过超临界提取法去除脂类，其基本原理是在高压下使二氧化碳液化， 通过分子间的相互作用和扩散作用将卵黄中的脂溶性物质溶解在其中，并随气流带走。 将卵黄粉末装入超临界气体抽提装置中，通入3 0 0k g c m 2 、4 0 0 c 的减压条件下，被抽提 的杂质与超临界气体分开而进入分离室，即得到除去脂肪的卵黄粉末。将去脂的卵黄粉 末溶于2 0 倍磷酸缓冲液中，搅拌，离心，即得w s f 。 1 2 2 6 酶解法 脂蛋白在酶的作用下分解为水溶性的蛋白质和肽，使得反应混合物变的澄清。 r i i c h i r 0 1 2 5 】将5 0m g 的蛋黄粉溶于5m l ，o 1m 的磷酸缓冲溶液中， j i l x 2m g 的复合酶 n e w l a s ef ，调节p n 为4 o - 4 5 ，反应温度为4 5 5 0 0 c ，搅拌速率为6 0r p m ，在这些条件下， 2 3h 后脂肪( 卵黄油) 漂浮在在反应混合物的表层，去除上层漂浮物可获得澄清的包含 i g y 雕j 蛋白质溶液。 1 2 3i g y 分离工艺 鸡卵黄经脱脂处理后，可得到二个水溶性蛋白的混合溶液，以该溶液为原料分离提 纯i g y 的方法主要有无机物沉淀法、高分子有机聚合物沉淀法和有机溶剂沉淀法。 1 2 3 1 无机物沉淀法 该法是蛋白质提取的经典方法，最常用的试剂是硫酸铵或硫酸钠，在高盐环境中i g y 能被沉淀下来。j e n s e n i u s e 2 6 j 在使用硫酸葡聚糖和冻融法除脂后，i g y 回收率为7 0 8 0 ， 以2 0 硫酸钠盐析，i g y 的回收率为5 0 一7 0 ，若进一步去杂质则可用1 4 硫酸钠再盐析， i g y 几乎无损失。a k i t a 1 6 】将稀释的蛋黄溶液用1 9 的硫酸钠盐析，沉淀加水溶解再用1 4 的硫酸钠盐析，i g y 的纯度为9 4 ，得率为9 8m g m l 。v i e i r a t 2 7 1 使用氯化镁等无机物和 磷钨酸共同作用沉淀提取i g y ，效果也很明显。 无机物沉淀法的优点是方法比较简便，所用药品价格低廉；缺点是因为盐度较高需 要进行脱盐处理，而且高盐浓度会影响抗体的活性，这种方法也不利于工业放大。 1 2 3 2 高分子有机聚合物沉淀法 常用的试剂有聚7 , - - 醇( p e g ) 6 0 0 0 沉淀。 p e g 是非离子型水溶性聚合物，高浓度不引起蛋白质变性，且沉淀时间比硫酸钠短， 效果更佳，不影响离心处理。将卵黄液用缓冲液稀释，不同学者【2 0 1 使用的缓冲液各有 5 第一章前言 不同，有磷酸盐缓冲液( p b s ) 、三羟甲基氨基甲烷( t d s ) 缓冲液( t b s ) 、氯化钠溶液等，稀 释液中加入一定比例的硫酸葡聚糖或p e g 6 0 0 0 ( 3 5m g m l ) 沉淀，去除脂蛋白，上清液中 即含有i g y ，i g y t 均产量为4 9 m g m l 蛋黄，纯度8 9 。p o l s o n 【2 7 1 使用氯仿和1 2 的 p e g 6 0 0 0 相结合的方法提取i g y ，比单纯使用p e g 相比，i g y 产量提高了2 7 5 倍。 高分子有机聚合物沉淀法比水稀释法得到的i g y 少，纯度也比较低，并且溶剂残留 在抗体中，影响抗体在食品及医药上的应用。 1 2 3 3 有机溶剂沉淀法 常用冰乙醇进行分级沉淀，由于乙醇可以食用，因此该法比较安全，但是能耗较高， 成本大。向水稀释后的水溶性组份中加入预冷冰乙醇至终浓度6 0 ，4 0 c 静置沉淀，离 心，沉淀用3 0m m n a c l 溶解，过滤去除脂蛋白，然后再用终浓度分别为3 0 、2 5 的冷 乙醇沉淀离心，可获得纯度达9 9 以上的i g y 。 此外，还可以采用多种沉淀方法联合来分离提取蛋黄抗体。p o l s o n 2 8 1 使用氯仿和1 2 的p e g 6 0 0 0 相结合的方法提取i g y 。f i s c h e r 报道应用硫酸葡聚糖与其他方法联合使用提 i i 又i g y l 2 9 。1 9 9 8 年a l m e i d a 采用硫酸钠和辛酸正负联合沉淀法提取具被窍蝮蛇毒免疫过的 鸡卵黄i g y 【3 1 】。l e m a m y l 3 2 1 采用p e g 8 0 0 0 和硫酸铵联合沉淀提取i g y 。 1 2 3 4 电泳 电泳就是在电场作用下各种胶体颗粒的迁移，具有不同电荷密度的生物大分子将以 不同的速度连移，从而得以分离。g e e t 3 3 】在g r a d i f l o w 仪上用介体电泳纯化i g y ，是将电 泳分离技术与膜过滤分离技术相结合，利用分子的大小和其所带的电荷性质不同，对复 杂的生物溶液进行纯化、浓缩和盐析。i g y 的产率超过8 0 ，纯度与层析纯化的纯度接 近。 1 2 3 5 超滤 k i m 和n a k a i 1 q 使用a m i c o n 超滤系统在n a c l 的存在下直接从w s f q b 分离i g y ，得到 的i g y 的纯度和回收率分别为7 4 9 9 和8 0 一8 5 。超滤法具有一步浓缩、除盐、分离 和纯化蛋白的优点，并且易于工业放大。 1 2 4i g v 精制 经初步分离提取得到的i g y 粗品其纯度还无法达到注射或免疫检测的要求，必须进 一步纯化，从而获得高纯度的i g y 产品。蛋白质纯化一般采用层析的方法，纯化i g y 采用 的主要层析方法包括： 6 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 1 2 4 1 凝胶层析 用多聚物通过交联形成的具有三维网状结构的颗粒填充层析柱，在颗粒间存在大量 的间隙，只有直径小于颗粒网孔孔径的分子能够进入凝胶颗粒内部，无法进入凝胶颗粒 内部的分子将从间隙中通过。不同的溶质因在层析柱中的保留时间不同而得以分离。 m a y a 1 8 1 先将稀释的卵黄冻融后离心得到水溶性蛋白溶液，用1 0m m ，p h7 8 的p b s 平衡b i o g e lp 1 5 0 柱，将2m l 水溶性蛋白溶液加入柱中，用紫外测定在2 8 0n l t l 处蛋白的 吸收并在出峰时收集蛋白组分。当第一个峰出现时开始收集组分，冻干得到纯度达9 0 的i g y 。凝胶过滤的方法得到产物的纯度较高，但是回收率比较低，操作费时。 1 2 4 2 离子交换层析 待分离物质在特定条件下与离子交换剂带相反电荷，因而能够与之结合，而其他分 子在此条件下所带电荷的种类、数量及电荷的分布不同，与离子交换剂的结合程度的也 不同，因此物质将以由强到弱的顺序被洗脱下来，从而达到分离的目的。 h a t t a 2 2 用d e a e s e p h a c e l 柱层析纯化，用2 0m mp h8 0 磷酸缓冲液平衡及洗脱蛋白， 得到的i g y 纯度j , 盘9 8 3 ，产率为7 3 。m c c a n n e l 和n a k a i 3 4 伟j d e a e 离子交换层析分离 i g y ，纯度j e - 生9 8 。我国学者陈天豹【3 5 】使用d e a et o y o p e a l6 5 0m 阴离子交换柱分离纯化， 得到了电泳纯i g y ，总蛋白回收率达9 3 以上。 离子交换层析的优点是：保持i g y 活性不损失，提高了活性蛋白的回收率，易于工 业化；缺点是由于i g y q 7 群的存在，使得该法不能同时实现高纯度和高回收率。特异性 不强。 1 2 4 3 亲和层析 它是利用生物大分子和配体间的特异性生物亲和力，对样品进行分离。配体被固定 在固相载体上，当含有亲和生物分子的样品液流过时，与此配体具有亲和性的特定生物 分子就从样品液中被吸附到层析柱上，从而与其他杂质分离。 ( 1 ) 嗜硫性亲和层析 嗜硫层析介质上配基的砜硫醚基团在一定浓度的盐存在下，可与抗体表面的位点 相互作用，对其具有显著的亲和吸附特性。h a l l s e n 【3 6 1 使用亲硫作用层析纯化i g y ，亲硫 层析的吸附剂中含有2 巯基乙醇与二乙烯砜反应的活性支持物，称t 胶，能在高盐环境 下选择性地结合i g y 。这样的胶对i g y 吸附作用强，i g y 回收率为9 9 。 嗜硫层析在各种血清免疫球蛋白及i g y 的纯化方面显示出其选择性强、活性回收率 7 第一章前言 高、易于工业化放大等优点，已成功用于重组单链抗体片段与f a b 片段的分离，具有极 高的应用价值。 ( 2 ) 固相金属离子亲和层析 最常用的金属离子有c u 2 + 、n i 2 + 、c 0 2 。、z n 2 + 以及f e ”。研究表明，f e 3 + 与磷酸化氨 基酸有很强的亲和力。g r e e n e 3 7 】等用固相金属离子亲和层析纯化i g y ，用亚氨乙酰乙酸 ( i d a ) 活化的琼脂糖6 b 装柱，然后用f e c l 3 6 h 2 0 将柱转化成i d a - f e ”的形式，用5 0m m 2 一 磺基乙烷( m e s ) 平衡，i g y 提取液经i d a - f e 柱纯化，i g y 部分得到4 个洗脱峰，i g y 分成4 个亚群。 ( 3 ) 合成配体亲和层析 由于i g y 具有不与蛋白a 和蛋白g 结合的特性，所以进行亲和层析就需要寻求合适的 配体。v e r d o l i v a 3 8 1 将t g l 9 3 1 8 ( 从重组多肽文库中筛选合成的人工特异性配体，为蛋白a 的类似物，可结合免疫球蛋白的稳定区) 固定于e m p h s z e 基质上用于i g y 的纯化。每毫升 载体可获得6 5m gi g y ，纯度大于9 0 。d o n gd e x i a n l 3 9 1 从7 0 0 种合成配体库中选出一种高 效结合i g y 的l i g a n d 8 6 ，每毫升载体可获得7 4 8m gi g y ，一步纯化i g y n - i 达9 2 1 ，i g y 的回收率为7 8 2 。 合成配体亲和层析虽然简化了免疫球蛋白的分离过程，但其制备和使用成本较高， 不易于工业化生产。 ( 4 ) 免疫亲和层析 抗原和抗体的作用具有高度专一性，且其结合的亲和力极强，利用抗原和抗体反应 的亲和层析具有抗原特异性，目前已用于多种特异性i g y 的纯化。m a r t i n l 4 0 1 将重组蛋白 抗原结合于n i - n t a 柱上，用免疫亲和层析对i g y 进行纯化，效果良好。c h e n 用溶菌酶交 联的琼脂糖凝胶柱进行免疫亲和层析，获得抗溶菌酶特异性卵黄抗体。 还可以采用多种层析技术纯化i g y ，使i g y 的纯度更高。h a s s l 4 1 1 等对p e g 法分离获 得的卵黄抗体采用疏水层析和凝胶过滤两步法纯化，其产物纯度较高，但是收率较低。 y a n g 4 2 等利用d e a e 葡聚糖凝胶a 5 0 离子交换层析纯化i g y ，用t i s - h c l 缓冲液( 含0 1 5 m o l ln a c l ) 洗脱，再经s h e p h a d e xg 2 0 0 凝胶过滤，得到的i g y 纯度达9 9 。龙钟儿【4 3 】等 也使用该法纯化抗轮状病毒i g y 。 8 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 1 3 超滤及其在生物分离中的应用 1 3 1 膜技术的概述 在一定的流体相中，有一薄层凝聚相物质，把流体相分割成两部分，这一薄层物质 称为膜。膜本身是均匀的一相或是有两相以上凝聚物质所构成的复合体。膜分离过程以 选择性透过膜为分离介质，当膜两侧存在某种推动力( 如压力差、浓度差、电位差等) 时，原料侧组分选择性的透过膜，以达到分离、提纯的目的。 1 3 1 1膜的发展 膜现象最早是在1 7 8 4 年a b b en o l l c t 发现水会自发地扩散穿过猪膀胱而进入酒精 中；1 8 5 4 年g r a h a 发现了透析现象( d i a l y s i s ) ，1 8 5 6 年m a t t e u c e i 和c i m a 观察到天然膜 是各向异性的这一特征后，人们开始重视膜的研究，同期d u b r u n f a n t 应用天然膜制成 第一个膜渗透器并成功地进行了糖蜜与盐类的分离；1 8 6 4 年t r a u b e 成功制得了第一张 人造膜一亚铁氰化铜膜；2 0 世纪3 0 年代不同孔径的硝酸纤维超滤膜出现；1 9 6 0 年l o e b 和s o r i r a j a n 制得了不对称反渗透膜；2 0 世纪7 0 年代研制出纳米膜。 1 3 1 2 膜的分类 由于膜的种类和功能很多，分类的方法有多种：( 1 ) 根据膜断面的各种物理结构和 化学性质可将膜分为对称膜、非对称膜、复合膜、荷电膜、液膜、微孔膜和动态膜；( 2 ) 根据膜内平均孔径、推动力和传递机制分为微滤膜、超滤膜、反渗透膜、纳滤膜和电渗 析膜；( 3 ) 根据膜的结构可以分为多孔膜和致密膜；( 4 ) 根据材料来源，可分为天然膜 和合成膜，合成膜又分为无机材料膜和有机高分子膜。 1 3 1 3 常见的膜分离过程 目前，膜技术在工业上应用最广泛的是微滤( m f ) 、超滤) 、纳滤( n f ) 和反渗透 ( r o ) 。微滤是以静压差为推动力，利用筛网状过滤介质膜的“筛分”作用进行分离，截留 孔径为0 0 5 1 0g m ，应用范围主要是从气相和液相中截留酵母、细菌以及其他污染物， 可代替巴氏杀菌和化学防腐剂；超滤膜孔大小1 - 2 0 0i l r n ，通常用截留分子量来表示在表 面被截留分子的限度，主要应用在浓缩、脱盐、脱除大分子杂质以及分级分离和纯化； 纳滤膜孔径为1 2n m ，用于分离溶液中分子量为2 0 0 1 0 0 0d a 的小分子物质，主要应用 于各种氨基酸、抗生素、低聚糖等的浓缩、精制等方面；反渗透推动力为压力差，主要 应用于海水淡化、苦咸水淡化、纯水生产等，涉及市政、电力、化工、医药等行业。 1 3 1 4 膜分离设备 9 第一章前言 ( 1 ) 板框式组件 板框式膜组件由平板式膜制成，这类膜器件的结构与常用的板框压滤机类似，由导 流板、膜、支承板交替重叠组成，如图1 2 ，其中支承板相当于过滤板，它的两侧表面 有窄缝。其内胞有供透过液通过的通道，支承板的表面与膜相贴，对膜起支撑作用。导 流板相当于滤框，但与板框压滤机不同，由导流板导流流过膜面，透过液通过膜，经支 撑板面上的窄缝流人支撑板的内腔，然后从支撑板外侧的出口流出。料液沿导流板上的 流道与孔道一层层往上流，从膜器上部的出口流出，即为过程的浓缩液。导流板面上设 有不同形状的流道，以使料液在膜面上流动时保持一定的流速与湍动，没有死角，减少 浓差极化和防止微粒、胶体等的沉积。 p e r m e a b l e m e m b r a , 薯 h e a tm e a l w h e f n 叩 图l - 2 板框式膜组件 f i g l - 2p l a t e - f r a m em e m b r a n em o d u l e 板框式膜组件的优点：组装方便，膜的清洗更换比较容易，料液流通截面较大，不 易堵塞，同一设备可视生产需要而组装不同数量的膜。 板框式膜组件的缺点：需密封的边界线长，为保证膜两侧的密封，对板框及其起密 封作用的部件的加工精度要求高。每块板上料液的流程短，通过板面一次的透过液相对 量少，所以为了使料液达到一定的浓缩度，需经过板面多次，或者料液需多次循环。 ( 2 ) 卷式膜组件 卷式膜组件也是用平板膜制成的，其结构与螺旋板式换热器类似。支撑材料插入三 边密封的信封状膜袋，袋口与中心集水管相接，然后衬上起导流作用的料液隔网，两者 一起在中心管外缠绕成筒，装入耐压的圆筒中即构成膜组件。使用时料液沿隔网流动， 与膜接触，透过液透过膜，沿膜袋内的多孔支撑流向中心管，然后由中心管导出，如图 1 3 。 1 0 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 目前卷式膜组件应用比较广泛、与板框式柱比、卷式膜组件的设备比较紧凑、单位 体积内的膜面积大。其缺点是清洗不方便，膜有损坏，不易更换，尤其是易堵塞，因而 限制了其发展。近年来，预处理技术的发展克服了这一困难，因此卷式膜组件的应用将 更为扩大。 啊 图1 - 3 卷式膜组件 f i g l - 3s p i r a lw o u n dm e m b r a n em o d u l e ( 3 ) 管式膜组件 管式膜组件由管式膜制成，它的结构原理与管式换热器类似，管内与管外分别走料 ： 液与透过液，如图1 4 。管式膜的排列形式有列管、排管或盘管等。管式膜分为外压和 内压两种。外压即为膜在支撑管的外侧，因外压管需有耐高压的外壳，应用较少；膜在 管内侧的则为内压管式膜。亦有内、外压结合的套管式管式膜组件。 管式膜组件的缺点是单位体积膜组件的膜面积少，一般仅为3 3 3 3 0m 2 m 3 ，除特殊 场合外，一般不被使用。 第一章前言 酬幽蛳血 图l - 4 管式膜组件 f i g l - 4 t u b u l a rm e m b r a n em o d u l e ( 4 ) 中空纤维膜组件 中空纤维膜组件的结构与管式膜类似，即将管式膜由中空纤维膜代替。它由很多根 纤维( 几十万至数百万根) 组成，众多中空纤维与中心进料管捆在一起，一端用环氧树脂 密封固定，另一端用环氧树脂固定，料液进人中心管，并经中心管上下孔均匀地流入管 内，透过液沿纤维管内从左端流出，浓缩液从中空纤维间隙流出后，沿纤维束与外壳间 的环隙从右端流出，如图1 5 。 这类膜组件的特点是设备紧凑，单位设备体积内的膜面积大( 高达 1 6 0 0 0 3 0 0 0 0m 2 m 3 ) 。因中空纤维内径小，阻力大，易堵塞，所以料液走管间，渗透液 ：。 。 走管内透过液侧流动损失大，压降可达数个大气压，而现代膜分离技术又特别适用于 热敏性物质的处理，在食品加工领域有其独特的适用性。整个分离过程在密闭系统中进 行，无需加热，避免和减轻了热和氧对食品风味和营养成分的影响，而且只需加压输送 和反复循环，能耗低，速度快，精度高，费用约为蒸发浓缩和冷冻浓缩的坦1 5 ，还具 有冷杀菌潜势。因而现代膜分离技术近年来在食品工业中展现了广阔前景，日益受到重 视，应用越来越广泛。膜污染难除去，因此对料液处理要求高。 1 2 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 r e s i d u e l r e s i d u e f 图1 - 5 中空纤维膜组件 f i g l - 5 h o l l o wf i b r em e m b r a n em o d u l e 1 3 2 超滤 1 3 2 1 超滤的概述 超滤起源于1 7 8 4 年，s c h m i d t 用棉花胶膜或璐膜分滤溶液，当施加一定的压力时， 溶液透过膜，而蛋白质、胶体等物质则被截留下来；1 8 9 6 年，m a r t i n 制出了第一张人工 超滤膜；7 0 年代和8 0 年代是高速发展期，9 0 年代开始进入工业化生产和应用阶段。 超滤是以压力为推动力，用于溶质的浓缩和分级。超滤不同于反渗透主要用于脱盐 及相似的操作，还有更广泛的