地黄根区土壤水提取物对地黄保护酶活性和膜质过氧化的影响.doc

地黄根区土壤水提取物对地黄保护酶活性和膜质过氧化的影响2 试验材料和方法2.1试验材料供试地黄品种为河南焦作市广泛种植的温85-5。以其无性块根（称“种栽”）作为再繁材料，生产上称做“倒栽留种”。2.2试验方法本研究于2007年3月中旬在福建农林大学可控温室中施行砂培盆栽试验，采用外源添加地黄根区土壤水浸提液（简称“DHW”）的方法进行模拟连作。根据试验前期筛选的生物测试浓度，选择-1g/mL、0.2 g/mL、1 g/mL、2 g/mL 四个水浸提液浓度，进行平行处理，根据种栽数量设置n3次重复，每盆砂量为2000mL，砂厚度为7cm，每盆移栽经过草木灰消毒处理并已长出幼芽的3cm长且粗细均匀的地黄根段，定植5株。按Hoagland营养液配方进行全营养培养，定期添加，直至地黄叶片开始充分展开（两周后），此时，配合营养液的添加量，按上述浓度梯度一次性添加地黄根区土水浸提浓缩液，分别于处理两周后进行光合作用指标、生理生化指标的测定以及形态指标观察。2.3取样方法本试验于地黄苗期进行，取样方法是将地黄分为地上部叶片和地下部新生成的须根系两部分，分别进行相关指标的测定，并按照实验要求留样备份。2.4 实验项目按照实验安排分别依次进行丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的测定以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(peroxidase，POD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、吲哚乙酸氧化酶（IAAO）等抗性相关酶活性的测定。2.4.2相关酶活性及MDA含量测定分别取标记地黄叶片1.0g或和新生根系1.0g，采用1600型紫外-可见分光光度计进行下列项目的测定。（1）根系活力（根系脱氢酶活性）的测定采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法测定地黄根系活力，测定485nm处OD值，以TTC还原量表示根系活力（g/ghFW）。（2）POD活性的测定参照张志良等的方法测定64。470nm处比色。以每分钟内OD470变化值表示酶活性大小（OD/gminFW）。（3）SOD活性的测定参照朱广廉等的方法62。测定560nm处OD值,以每分钟抑制NBT光氧化还原50%的酶用量为一个酶活性单位（U/gFW）。（4）CAT活性的测定用过氧化氢还原法测定63，测定液于240nm处比色，以每分钟内OD240变化值表示酶活性大小（U/gminFW）。（5）MDA含量的测定参照朱广廉等的方法62。测定OD532、OD600和OD450值，按公式C（umol/L）= 6.45（OD532- OD600）-0.56OD450计算MDA含量（nmol/gFW）。（6）IAAO活性的测定采用2，4-二氯苯酚比色法分别测定地黄叶片和新生根系中吲哚乙酸氧化酶的活性241。实验中采用吲哚乙酸试剂B作为显色剂，在530nm波长下比色，查标准曲线，计算被酶分解破坏的吲哚乙酸量，以每mL酶液在1h内分解破坏吲哚乙酸量（ug）表示酶活力的大小ug（IAA）/gh。（7）PAL活性的测定参照多诸多方法并改进，取材料0.5g，加入5mL预冷0.2mol/LH3BO4（内含54 mmol/L巯基乙醇，pH8.8），在冰浴中研磨成匀浆，4下12000g离心30min，上清液即为粗酶液；取此上清液0.5mL，0.2mol/LH3BO40.5mL，50mmol/L的L-苯丙氨酸（用0.2molH3BO4缓冲液配制）0.5mL，以0.5mL 0.2mol/LH3BO4代替L-苯丙氨酸设置空白对照，37暗反应12h后，测定OD290，以每小时OD290值每0.01的变化所需酶量为一个PAL酶活性单位（U/ghFW）。3 结果与分析3.3 地黄根区土壤水提取物（DHW）对地黄保护酶活性和膜质过氧化的影响3.3.1 DHW对POD活性的影响POD(过氧化物酶)的作用一方面可以催化过氧化氢及某些酚类物质的分解，使活性氧的产生和消除处于平衡状态，从而保护细胞免受伤害;另一方面它参与叶绿素的降解。活性氧的产生能引起膜脂过氧化，使质膜透性增强，POD酶活性强说明膜脂过氧化、膜透性增加，植物生长受到胁迫，从而抑制生长。由图3可以看出，DHW处理后地黄幼苗根系POD先升高（183.4%），后又降低（155.1%和136.7%），但高于对照，叶片中POD活性均低于根系，但与对照相比则呈现随着DHW浓度的加大而逐渐生高的趋势（106.8%、131.1%和148%）。试验中发现1g/mL和2g/mLDHW处理，在7天后可观察到幼苗生长受到抑制，与对照相比，叶片表现缺绿症状，三周后发现，高浓度DHW处理的幼苗，叶片卷曲，基部叶片有枯死的现象，这可能是添加的DHW浓度过高所致。图不同浓度土壤水提取物对过氧化物酶活性的影响Figure1.Effects of various concentration of soil extractors on POD activity of Radix Rehmanniae3.2.3 DHW对SOD活性的影响氧自由基属于活性氧的一种，具有很强的氧化能力，可引发膜脂过氧化作用，破坏膜的完整性。而SOD能催化超氧自由基，产生歧化反应，生成分子氧和过氧化氢，保护膜的完整性。SOD酶活性高或升高，说明植物对逆境的存在一定的抵御能力。本实验发现，所设不同浓度的DHW与对照相比先促进SOD酶的活性（112.6%），后又降低（77.2%，64.2%），甚至低于对照（图4）。这说明在一定处理时间内，地黄幼苗可以启动自身防御机制，但超出一定范围后，可能会引起不利的反应，如导致抗氧化系统的紊乱，酶活性降低，甚至失活。图不同浓度土壤水提取物对超氧化物歧化酶活性的影响Figure1.Effects of various concentration of soil extractors on SOD activity of Radix Rehmanniae3.2.4 DHW对CAT活性的影响SOD在清除超氧化物阴离子自由基的过程中，形成对细胞有危害作用的H2O2，CAT具有清除反应中的H2O2的作用，与上述两种酶一起，保护膜系统免受自由基的危害。不同浓度的DHW处理后，CAT表现随浓度的增加先升高后降低（131%、115.9%、75.7%，图4）。说明低浓度的DHW在短时间内可促进幼苗对自身的积极保护作用，表现出活性升高，随处理时间的延长及处理浓度的增大，幼苗的逆境胁迫程度加大，化感强度加大，最终消弱抵抗能力，表现出CAT活性的降低。图不同浓度土壤水提取物对过氧化氢酶活性的影响Figure1.Effects of various concentration of soil extractors on CAT activity of Radix Rehmanniae3.2.5 DHW对膜质过氧化的影响对受体植物而言，毒性化感物质处理造成了一种逆境。对这种逆境的响应程度与受体植物的防御能力有关。一般说来，逆境胁迫使体内产生自由基，使膜质过氧化并导致细胞膜受到伤害。丙二醛（MDA）是自由基启动的膜质过氧化产物之一，其含量常作为膜质过氧化程度的指标。在本实验中DHW的处理浓度越高和处理时间越长，幼苗叶片中的MDA含量越高（110.4%、149.9%和179.5%），且远远高于对照（图6）。说明DHW处理后，组织内剩余活性氧增多，质膜受到自由基的伤害，导致了幼苗体内膜质过氧化水平提高，而且这种伤害随浓度增大和处理时间的延长而加剧，与保护酶的变化相吻合。图不同浓度土壤水提取物对地黄膜质过氧化的影响Figure1.Effects of various concentration of soil extractors on MDA content of Radix Rehmanniae3.2.6 DHW对IAAO活性的影响化感物质可对植物体内生长调节系统产生影响，改变其内源激素的平衡。如通过影响吲哚乙酸氧化酶（IAAO）的活性，可调节体内吲哚乙酸（IAA）的水平，从而影响受体植物的生长发育。IAAO活性升高，可促进IAA的分解；反之则IAA合成增加并积累，二者之间存在消长平衡关系。本实验中随着DHW处理浓度的增加，地黄叶片中IAAO活性不断升高，各处理与对照之间均存在显著差异（105.4%、113.8%、150.7%，图7）。说明DHW处理可引起地黄体内IAAO活性的增强，这将不利于IAA的合成与积累，从而阻碍地黄幼苗的正常生长。图不同浓度土壤水提取物对吲哚乙酸氧化酶活性的影响Figure1.Effects of various concentration of soil extractors on IAAO activity of Radix Rehmanniae3.2.7 DHW对PAL活性的影响苯丙氨酸解氨酶（PAL）是植物次生代谢途径苯丙烷代谢途径中的关键酶和限速酶。其催化L-苯丙氨酸的脱氨反应，释放氨而形成反式肉桂酸，该酶在植物的次生物质（如木质素，黄酮类物质等）的代谢中起重要作用，与植物的抗病性有一定关系。植物在感病初期时此酶活性会被诱导并高度表达。本试验同时测定了地黄幼苗根系和叶片的PAL活性变化，其活性均表现为随着水浸液浓度的加大先升高（叶片111.5%；根系111.3%），后又降低（叶片89.9%；根系82%），显示了PAL酶活性随水浸液处理浓度的不同的变化趋势。PAL酶活性容易受到环境的诱导从而表现抗性，因为此酶活性的升高，伴随着木质素等抗病次生物质的合成和积累，本试验中，高浓度水浸液处理PAL酶活性降低，并低于对照（叶片76.7%；根系73%），则表明地黄幼苗的抗病能力降低，植物次生代谢受阻。图不同浓度土壤水提取物对本丙氨酸解氨酶活性的影响Figure1.Effects of various concentration of soil extractors on PAL of activity Radix Rehmanniae4 结论与讨论根系是植物接触化感物质最早的器官，根系结构的变化直接反映自毒物质对植物生长发育的影响。本研究发现，随着提取物浓度的增加和处理时间的延长，地黄幼苗根系严重腐烂，可能是处理强度过大的结果。根系组织还原TTC的能力是呼吸电子传递链活性的一种表现，其脱氢酶活性的强弱直接影响根系的吸收功能，是判断根系活性强弱的一个重要的生理指标。化感物质 (自毒物质)对植物的伤害是多方面的，其中化感物质作用下植物体内积累的活性氧对细胞膜的伤害尤为严重，能直接或间接导致植物体内氧代谢平衡的改变，不能被及时清除的活性氧使细胞内出现氧化胁迫，进而引起生物大分子的氧化损伤和生物膜完整性的破坏。本研究中，低浓度水浸液处理，地黄叶片中POD、SOD、CAT活性均表现增强，但随着浓度的增加SOD、POD活性均下降，并低于对照，与此同时丙二醛含量也在增加，说明膜质过氧化增加。由此可见，当自毒作用发生时，地黄幼苗启动其防御系统，表现为通过增加抗氧化酶活性而增强其积极防御的能力。但随着化感物质浓度的不断增加和处理时间的延长，一些抗氧化酶系的功能受阻，活性降低，造成地黄对化感物质的抵御能力下降，进而造成地黄对水分和养分吸收的生理障碍，最终导致地黄的合成与代谢过程发生异常和紊乱，因此出现自毒症状，这可能是化感作用研究中供体与受体之间存在他毒、解毒与自毒机制的体现。吲哚乙酸氧化酶是一种含铁的氧化酶，它在植物体内调节着吲哚乙酸的水平。一些化感物质可以通过刺激或抑制吲哚乙酸氧化酶活性而加速吲哚乙酸的分解或者促进其合成。林文雄等对水稻化感作用的研究表明，供试水稻叶片浸提液提高了受体杂草的吲哚乙酸氧化酶活性，从而降低了吲哚乙酸的水平，影响杂草的生长，并指出香草酸、丁香酸等化感物质可刺激吲哚乙酸氧化酶的活性。本试验中也得出了随着水浸液浓度的加大，吲哚乙酸氧化酶活性逐渐增强的结果，这可能是提取液中存在着相类似作用的化感物质，使得吲哚乙酸水平降低，导致地黄幼苗生长受阻，这与本研究前期生物测试中IAA随着甲醇提取物浓度的增加其含量逐渐降低的结果相一致，可见地黄根区土壤水提取液和甲醇提取液都存在这种具有相似作用的自毒物质。在植物抗病反应的次生代谢中，苯丙烷类代谢是重要的代谢途径之一，可形成包括植保素、木质素和酚类化合物等抗病次生物质。苯丙氨酸解氨酶 (Phenylalanine ammonia-lyase，PAL)是这一途径的关键酶和限速酶，由多种因素(如病原物侵染等)诱导调控。20世纪60年代初，人们发现感染病原菌的植物PAL活性有所增强。随后在不同的植物-病原物互作中发现这一现象，而伴随着PAL活性升高则有木质素的积累及酚类物质和植保素等次生抗病物质的合成