基因工程与分子生物学.doc

基因工程与分子生物学重点1限制性核酸内切酶：凡是识别切割双链的DNA分子内特定核苷酸序列的酶称为限制性核酸内切酶，简称为限制性酶。2限制性核酸内切酶的一般性质：37，pH为7.27.6，用TrisHCl，GlyNaOH两种缓冲液，Mg2+Buffer，5mM，盐浓度，巯基试剂：-ME，DTT，BSA（牛血清白蛋白，稳定酶的作用）；决定生产的特定的DNA片段的大小，识别顺序具有180的旋转对称，识别顺序一般是46个碱基，也有6个以上的，但是没有4个以下的，产生三种不同的切口:形成平头末端（Smal）：连接困难，效率较低；形成5粘性末端（EcoR）：相对而言，5突出尾，3凹末端；形成3粘性末端（Pst）相对而言，3突出尾，5凹末端。3星活性：在非标准条件下（低盐和高pH，高甘油浓度5%），限制酶识别顺序与切割顺序发生改变的现象。4大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）：将Pol1切下一个小片段失去5到3外切酶活性。补平限制酶切割DNA产生3凹槽（5到3合成），用32pdNTP补平3凹端，对DNA片段进行末端标记，对带3突出端的DNA进行末端标记（利用置换活性），在cDNA克隆中，用对和陈那个cDNA的第二条链，在体外诱变中用于从单链模版合成双链DNA，应用Sanger双脱氧末端终止法进行DNA测序，消化限制酶产生的3突出端，应用于PCR技术。5基因工程的工具酶：T7噬菌体DNA聚合酶，修饰的T7噬菌体DNA聚合酶，TaqDNA聚合酶（没有校正功能），大肠杆菌DNA聚合酶，大肠杆菌DNA聚合酶大片段，T4噬菌体DNA聚合酶。6末端转移酶：将相同的核苷酸依次连接到3末端，然后两条DNA通过同源多聚尾巴连接在一起，在表达前将ploy(G)切除，否则影响蛋白质的生物活性。7T4噬菌体多核苷酸激酶：使DNA的5端磷酸化，也可以使DNA的5端去磷酸化。可以发生正向反应，也可发生交换反应。正向反应：5CTGCAG在酶和ATP（ATP具有，磷酸基团，其中可给出）的作用下，生成5pCTGCAG；交换反应：5pCTGACG在酶和ADP的共同作用下，去磷酸化，将DNA链上的磷酸基团给出，生成5CTGCAG和ATP，在酶和被标记的ATP作用下使得DNA再次被磷酸化同时被标记，生成ADP和5*pCTGCAG。8基因工程载体种类：质粒，噬菌体的衍生物，科斯质粒或粘粒，噬菌体质粒，单链DNA噬菌体M13，真核病毒载体，酵母质粒载体，杆状病毒。9质粒：在细菌细胞内作为与宿主染色体有别的复制子而进行复制，并且在细胞分裂时能恒定传递给子代细胞的独立遗传因子。10质粒作为基因工程载体所必备的条件：1）具有较小的分子量和松弛的复制子，2）基因组上有12个筛选标记，便于在平板中区分重组体和非重组体，3）DNA链上有1到几个限制酶的单一识别与切割位点，便于外源DNA的插入，4）具有插入失活（或是插入表达）的筛选标记，便于从平板中直接筛选阳性重组体。11Ti质粒：引起植物形成肿瘤冠瘿瘤的质粒称为诱导肿瘤的质粒。12Ti质粒的优点：宿主范围广泛，Ti质粒能过转化所有的双子叶植物，并将外源基因导入植物细胞；整合到宿主细胞chDNA上的TDNA成了染色体的正常遗传成分，永远居留，代代相传；TDNA上的Opine合成酶基因有一个强大的启动子，能启动外源基因在植物细胞中高效表达。13分子杂交（杂交，hybrdization）：核酸研究中一项最基本的实验技术，它是指在一定条件下互补核酸链复性形成双链的过程。14分子杂交的原理：(一)DNA的变性：指分子有稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象，确切的说是维持双螺旋结果稳定的氢键和疏水键的断裂，DNA变性不涉及到其一级结构的改变；（二）DNA的复性：指变性的两条互补DNA链在适当条件下，全部或部分恢复到天然双螺旋结果的现象，它是变形的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后便可复性，此过程称之为“退火”（annealing）。15Southernblot操作技术：将获取得DNA样品进行琼脂凝胶电泳，将琼脂糖凝胶上的DNA片段按原有的顺序转移到一张硝酸纤维素薄膜上并固定下来，用32P标记的DNA或RNA探针与之杂交，用发射自显影技术确定任何能与探针DNA或RNA杂交的带。16Northernblot操作技术：将获取得RNA样品进行琼脂糖凝胶变性电泳，将琼脂糖凝胶上的RNA按原有顺序转移到一张硝酸纤维素薄膜上并固定下来，用32P标记的DNA或RNA探针与之杂交，用发射自显影技术确定任何能与探针DNA或RNA杂交的带。17Westernblot操作技术：将获取得蛋白质样品进行聚丙烯凝胶电泳，将聚丙酰胺凝胶上的蛋白质带按原有顺序转移到一张硝酸纤维素薄膜上并固定下来，用32P标记的DNA或酶标记的蛋白质探针与之杂交，用发射自显影技术确定任何能与探针DNA或RNA杂交的带。18原位杂交：转为鉴别阳性重组体而设计的DNA杂交法，若受体DNA是从转化的菌落释放，则原位杂交又称菌落杂交，若受体DNA从转染的空斑释放，则称空斑杂交。基本程序：在硝酸纤维素薄膜上接种转化细胞长出菌落（或空斑）并溶解释放DNA通过变性和干燥，使DNA在原有位置固定，作为杂交的受体DNA，以后的杂交和放射自显影与前两种方法基本相同，原位杂交是鉴别阳性重组体的精确和快速方法，一张硝酸纤维薄膜上筛选的菌落可达到上百个。19探针标记：放射性标记：大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段标记合成的寡核苷酸，达成杆菌DNA聚合酶I标记寡核苷酸探针，T4DNA聚合酶标记寡核苷酸探针，末端转移酶标记寡核苷酸探针，T4噬菌体多核苷酸激酶标记寡核苷酸探针；体内标记：生物体的新陈代谢，食物、营养来源标记探针，非放射性标记（成本高，污染小）:地高辛，化学发光素。20分子克隆：讲一个基因片段插入到另一个载体DNA中，组成重组DNA分子，将它转入到受体细胞中复制扩增，即进行无性生殖，由于这类克隆在分子水平上操作，故称为分子克隆。21外源基因导入宿主细胞的方法：1）逆转录病毒感染法：产物用于食品，医药一般不采用该方法，但在科研上效果好；2）DNA显微注射法：在显微镜下，用显微镜将目的基因注射入宿主细胞内，但对宿主细胞的机械损伤较大；3）磷酸钙转染技术：磷酸钙反复转染，是的DNA沉淀下来，易接受外源DNA；DEAE葡聚糖转染技术：DEAE葡聚糖与目的基因共沉淀，易于细胞结合；5）聚阳离子DMSO转染技术：DMSO较强的去污剂，对宿主细胞有机械损伤，转入宿主细胞内时间过长，机械损伤过大；6）电穿孔技术：电击，产生微小孔洞使得目的基因转入，强度时间的控制很重要，防止致死细胞；7）原生质体融合技术：充足DNA分子包裹在人工膜（脂质体转染）内，然后直至体育宿主细胞融合导入目的基因；8）精子载体介导法：局限性，与卵子结合，受精卵受精成熟的后，鉴定再哪个组织细胞中；9）胚胎干细胞法：胚胎干细胞培养困难，增长传代系数。22遗传选择标记：1）胸腺核苷酸基因（tk）：验证生物活性，用HAT培养基（H次黄嘌呤，A氨基嘌呤，T胸腺嘧啶核苷）；2）二氢叶酸还原酶基因（dhfr）：二氢叶酸在二氢叶酸还原酶作用下还原成四氢叶酸，dhfr不能还原成四氢叶酸，使得细胞死亡；3）氯霉素乙酰转移酶基因（cat）：氯霉素乙酰转移酶将氯霉素乙酰化，是氯霉素失效，cat则不能是氯霉素乙酰化，细胞死亡；4）细胞的黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因（ecogpt）；5）细菌的新霉素磷酸转移酶基因（econeo）。1哺乳动物基因转移中常用的报告基因：1）人生长激素基因（hGH，humangowthhormone）；2）碱酶基因（alkalinephosphatase）；3）半乳糖甘酶基因（Lacz）；4）荧光素酶基因（luciferas）；5）绿荧光蛋白基因（GFP，Greenfluorescentprotein）；6）邻苯二酚2，3双加氧标志基因（CatO2aseCatechol:Oxygen2,3oxidoreductase）2植物基因工程常用的基因：（一）抗植物病虫病基因：1）Bt基因（苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因）；2）昆虫的蛋白酶抑制剂基因：丝氨酸蛋白酶抑制剂，巯基蛋白酶抑制剂，金属蛋白酶抑制剂；3）植物凝集素基因（lectingene）；4）淀粉酶抑制剂基因；（二）抗植物病毒基因：1）cp基因（外援的病毒外壳蛋白基因）；2）病毒复制酶基因；3）病毒卫星RNA的利用：卫星RNA是多核苷酸，他们有时在其相伴的病毒中被发现，它们按照相伴病毒的复制和传播机制，从一个植株传到另一个植株，它们不与其相伴病毒序列同源，对病毒的复制也不起作用，但卫星RNA具有改变其相伴病毒的致病力的能力；4）核糖体失活蛋白基因：产物是核糖体失活，影响病毒蛋白质合成；5）干扰素基因；6）缺陷干扰颗粒（defectiveinterfering，DI）指那些序列与亲本病毒相关的，但必须依赖于病毒才能复制的DNA分子，这种分子多存在于动植物病毒中；（三）抗植物真菌病毒基因：1）几丁质酶与1，3葡聚糖酶，几丁质酶降解几丁质（聚N乙酰胺基葡萄糖），几丁质是构成真菌细胞壁的成分，1，3葡聚糖酶降解1，3葡聚糖，后者也是构成真菌细胞壁的成分；2）植物抗毒素基因；3）RIP基因：核糖体蛋白失活基因，使真菌蛋白不能合成；4）过氧化物基因：木质素由苯基类丙烷醇缩合而成，它可增强细胞壁的强度，增加抗真菌的穿透的压力，而且抗原菌酶的降解，从而限制了真菌酶和毒素向宿主扩散以及水和营养物质从寄主向真菌扩散，过氧化物酶催化苯基类丙烷醇脱氢酶聚合成木质素；（四）抗植物细菌病毒基因：病原菌本身的抗性基因（类似于抗生素）；杀菌肽基因（杀菌性的特异性不强，广谱杀菌）；溶菌酶基因（破坏细菌的细胞壁）。3高等植物基因转化方法：根瘤农杆菌Ti质粒系统；化学刺激法；电脉冲法；基因枪法；电击注入法；脂质体法；直接注射法；激光微束发；超声波法；花粉发。4植物基因工程常用遗传选择标记：NptII基因（新霉素磷酸转移酶基因或氨基糖苷磷酸转移酶基因，AphII），DHFP基因（二氢叶酸还原酶基因）；HPT基因（潮霉素磷酸转移酶基因）；Gent基因（庆大霉素抗性基因）；抗除锈迹的标记基因；争光霉素（博来霉素）抗性基因；Blas（杀稻瘟菌素）；磺胺类药物。5PCR技术原理：DNA双螺旋结构的生物功能主要是在与复制和转染，以加热或碱变性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂，双联竭力，形成单链DNA，这称为DNA变性，解除变性条件后，变形的单链可以重新结合起来，形成双链，其原有的活性复原，称为DNA复性，又称退火，变形和复性在一定条件下是完全可逆的。PCR扩增是一种特定区段DNA的复制，遵循DNA生物合成的基本规律，其复制方法是一般保留形式进行的，但PCR中的DNA复制必须有DNA模版，DNA聚合酶，DNA引物和四种dNTP，要扩增模板DNA中的某一片段，需设计一对寡核苷酸引物，它们分别与两条DNA模板链3末端互补，PCR扩增系统中模板DNA经过高温变性后，分解为两条单链，通过低温退火，引物与模板DNA结合，形成局部双链，这是DNA复制的固定起点，由此DNA聚合酶可以进行链的延伸，合成与模板互补的链，模板DNA经过高温变性，低温退火和中温延伸三个阶段的循环过程，每循环一次，模板DNA的拷贝数就增加一倍。6PCR反应体系：引物（自行设计），模板（DNA来源），Taq酶（5到3聚合酶活性，但没有3到5外切酶活性），dNTPs（底物），缓冲液（Buffer，含有一定的离子浓度、pH值），BSA（牛血清白蛋白），Mg2+（Taq酶的辅助性因子）。7引物的设计原则：1）引物的长度应在1530bp（一般为1825左右，太小或太长均可能致使非特异性配对）；2）引物中碱基的分布应当是随机的，避免一连串单个碱基或其他不常见的结构；3）GC碱基的含量在4555%左右；4）两个引物在3端均必须与模板互补，5可以不互补；5）引物自身连续互补碱基小于4个（若过长，引物自身回旋，形成二级结构）；6）引物之间连续互补碱基亦应小于45个（防止引物互补配对，形成二聚体）。8其他PCR技术：锚式PCR，热巢式PCR，不对称PCR，原位PCR，散体重序列PCR，等位特异性PCR，免疫PCR，AFLP，3RACE，巢式PCR,反向PCR，RTPCR，竞争性PCR，高变性引物PCR，竞争引物PCR，RAPD，RFLP，5RACE。9免疫PCR：基因产物在固相中固定，一抗与结合了生物素的二抗结合，结合生物素，在于结合了生物素的DNA模板，进行PCR，得到的产物进行电泳检测。10反向PCR：限制性内切酶将DNA片段进行酶切，然后环化，变形并加入根据已知序列合成的引物PCR扩增11RTPCR：将目的基因进行逆转录得到cDNA，合成cDNA的互补链并进行退火，得到双链DNA，一起为模板进行PCR扩增。12竞争性PCR：mRNA逆转录成为cDNA，与存在突变位点人工合成的竞争模板cDNA进行PCR，得到PCR产物通过限制性酶消化，然后酶切产物进行电泳检测。13分子生物学：从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，它以核算和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息遗传中的作用为研究对象，是当前生命科学中发展最快并正在与其他学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域。14分子生物学的主要研究内容：核算的分子生物学，蛋白质的分子生物学，细胞信号转到的分子生物学。15DNA的结构：在真核生物DNA一级结构中：1）高度重复序列：重复频率高，次数从几十万到几百万次，重复序列较短5300bp，多数为515bp，其中有些是反向重复序列，也称回文序列（palindrome），即该片段的碱基顺序在互补链之间正反读都相同，还有一些反向重复序列、中间被一些不相关的序列隔开，反向重复序列都能形成十字架（交叉）和发卡结构；2）卫星DNA：重复序列的重复单位一般由210bp组成，伴随DNA分子存在，重复序列长度不同，可分为小卫星DNA（minisatelletiteeDNA）和微卫星DNA(microsateDNA),相近种属的高度重复序列存在相似性；3）中度重复序列：重复频率和重复序列长度有很大差异，平均长度6*105bp,平均重复350次；4）低度重复序列：又称单拷贝序列，即序列不重复或只重复几次，十几次，重复序列长度大于1000bp，此类序列携带大量能编码各种功能不同蛋白质的遗传信息，也有一些是基因间隔序列。二级结构（BDNA）：1）两条反相平行的多核苷酸链围绕同一中心轴盘绕成右手双螺旋；2）糖与磷酸在外侧形成螺旋的轨迹，彼此通过3，5磷酸二酯键相连；3）碱基延伸向内部，其平面与螺旋轴垂直；4)两条核算连依靠彼此碱基之间形成的氢键相连继而结合在一起，且总是A与T，G与C相配对；5）双螺旋的平均直径为2nm，每个螺旋圈上升10对核苷酸，螺距为3.4nm；6）沿螺旋中心轴方向看去，双螺旋结构上有两个凹槽，一个较深，宽，称为大沟，（majorgroove）,另一个较浅小，称小沟（minorgroove）。16类病毒：是高等植物产生疾病的有传染性的因子，由很小的环状DNA分子构成与病毒不同，类病毒的RNA本身就是感染因子，类病毒只由RNA组成，其中广泛存在不完全的碱基配对，形成一种特有的棒状结构，类病毒的基因组不能编码蛋白质。17同源重组：一般有成一般性重组，同源重组发生在DNA的同源序列之间，真核生物非姊妹染色单体的变换，姊妹染色单体的交换，细菌及某些低等真核生物的转化，细菌的转到，结合等都属于这一类。1Holliay模型：分支移动，弯曲，旋转导致两种不同的切割：1）两个不同源染色体DNA排列整齐，2）一个DNA的一条链断裂并与另一个DNA对应的链连接，形成的连接分子称为Holliday中间体，3）通过分支移动（branchmignation）产生异源双链（heteroduplex）DNA，4）Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA；切开方式不同，所得到的重组产物也不同，如果切开的链与原来的链断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA，称为片段重组体（patchrecombinant），但如果切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同的亲本DNA，称为拼接重组体（splicerecombinant）。两个DNA分子必须具有75bp以上的同源区才能发生同源重组，同源区小于此数值将显著降低重组率，复制、重组和重组修复是三个密切相关的生物学过程。2细菌的基因转移主要有四种机制：1）细菌的接合（conjngation）作用：细菌的细胞相互接触是遗传信息可以有一个细胞转移到另一个细胞，称为接合作用。F质粒是双链闭环的大质粒，总长约100bp，复制起始点为oriV，F质粒可以在细胞内游离存在，也可以整合到宿主染色体内，因此属于附加体（episome）；2）细菌的遗传转化：遗传转化（genetictransformation）是指细菌品系由于吸收了外缘DNA（转化因子）而发生遗传形状的改变现象；3）细菌的转导：转导（trasdution）是通过噬菌体将细菌基因从工体转移到受体细胞的过程。转导的种类有两种：普遍性转导（generalizedtransduction）：宿主基因组任意位置的DNA成为成熟噬菌体颗粒DNA的一部分而被带入受体菌；局限性转导（specializedtranstution）：某些温和噬菌体在装配病毒颗粒时将宿主染色体整合部位的DNA切割下来代替病毒DNA：4）细菌的细胞融合（cellfusion）：在有些细菌的种属中可以发生有细胞质膜导致的基因转移和重组。3转座子（transposableelement）：是一种可以由染色体的一个位置转移到另外位置的遗传因子，也就是一段可以发生转座（trarsposition）的DNA，又称为转座子（trarsposion）。4大肠杆菌DNA聚合酶I（polI）：（一）生物活性（在Mg2+作用下）：1）5到3DNA聚合酶活性；2）5到3外切酶活性：从5切下几个核苷酸是无法修复的；3）3到5外切酶活性：从3切下几个核苷酸可以利用其5到3DNA聚合酶活性按互补模版生成；4）RNA酶H活性：可以降解RNA，形成RNA片段；5）置换活性：基1和3结合起来不断切不断合成（可利用放射性同位素标记来检测连接上的碱基）；（二）用途：1）用切口平移法标记DNA（缺刻转移法制备DNA探针、目的、标记DNA用T*）；2）用于cDNA克隆中合成地二条链（往往会缺一段5，因为有5到3外切活性）；3）用于对DNA分子的3突出尾进行末端标记（用置换活性）。5T4噬菌体DNA聚合酶：（一）生物活性：1）5到3DNA聚合酶活性；2）3到5核苷酸外切酶活性；（二）用途：1）补平或标记限制酶消化DNA后产生3凹槽；2）对带有3突出端的DNA分子进行末端标记；3）标记用作探针的DNA片段；4）将双链DNA的末端转化成平端；5）使结合单链DNA模板上的诱变寡核苷酸引物得到延伸。6分子克隆程序：1基因的分离与合成：1）DNA的提取；2）从原核生物分离纯化目的基因：目的基因的直接分离，鸟枪法克隆目的基因（基因组DNA文库）；3）从真核生物分离纯化目的基因（cDNA文库）：随即引物合成cDNA，从总RNA中提取出mRNA，用digel（t）；消化成线性且齐性，加入人工接头（人工接头包括多种酶切位点）；4）基因的化学合成：磷酸二酯法合成寡核苷酸，磷酸三酯法合成寡核甘酸，固相亚磷酸三酯法合成寡核甘酸，固相合成法；2目的基因片段与载体DNA的连接：1）同源多聚尾巴连接：oligodGdC尾部连接：末端转移酶能够催化dNTP加到ss或dsDNA在cDNA克隆中加oligodG到载体3末端，加OligodC到cDNA尾部，使载体和cDNA连接并克隆，大约20个dG：dC所居尾巴就可以连接起来，oligodAdT尾部连接；2）人工接头连接；3）合成连接一步法；3重组DNA分子导入原核细胞：1）感受态细胞制备（保证低温操作）：确定细胞的生长状态、活化状态（划平板、培养反复）以达到活化菌种，扩培至OD到0.3时（对数生长期），CaCl2反复处理细胞（20mL,10ml,2ml）CaCl2悬浮细胞，离心去除CaCl2，CaCl2使细胞膜上某些通道打开，是的基因进入且CaCl2是冷却的；4阳性重组体的选择：1）平板选择；2）电泳法选择；3）同源重组法筛选；4）免疫学法筛选；5）原位杂交法筛选；6）Southern转印筛选；7）PCR技术；5阳性重组子的鉴定：1）酶切图谱；2）PCR技术；3）分子杂交；4）测序。7分子克隆的方法：（一）直接克隆法：提取、酶切、克隆；（二）构建基因文库法：1）构建基因组文库：从供体生物制备基因组DNA，并用限制酶消化法产生待克隆的DNA片段，在体外将这些DNA片段同适当的DNA或plasmidDNA连接成重组体DNA分子，导入大肠杆菌所有阳性克隆即构建成基因组DNA文库；2）构建cDNA纹路：通过一系列的酶催化反应使总ploy(A)mRNA转变成双链cDNA群体，并插入到适当的载体分子中，然后在转化到大肠杆菌寄主菌株的细胞内，如此便构建了包含着所有基因编码序列的cDNA基因文库；（三）分子杂交法；（四）化学合成法；（五）差异显示技术：分析物种间差异以及物种间的亲缘关系及进化论；（六）扣除杂交；（七）PCR技术。8外源基因在原核细胞中的表达：（一）真核基因在原核中表