柑橘无核育种研究进展.doc

柑橘无核育种研究进展 摘要：无核水果在国内和国际市场上占据重要地位，越来越受到水果加工产业的欢迎和广大消费者的青睐。至今为止，柑橘通过了许多方法来获得无核的果实，包括芽变选种、辐射育种等传统育种方法，但因工作量大，无法遗传及周期长等因素在无性繁殖植物上的研究工作进展缓慢。随着生物技术的发展，利用基因工程原理与技术对植物进行无核的定向的性状改良，大大提高了果实无核化育种效率。本文对柑橘无核育种的各种方法据进展进行了综述。关键词：无核，传统育种，基因工程无核果实通常是指果实没有种子、只有少量败育种子或种子数量比正常品种少的果实1。近年来的研究结果表明，大部分单性结实的无核或少核品种是由于花粉败育、授粉受精不良、胚胎发育及种子形成过程中的某一环节受阻而产生的；而采取调节果实发育过程中的激素平衡、辐射育种、杂交育种或导入无核基因等措施亦可使果实无核。在许多水果中，种子是不受欢迎的特性，因为他们也许有坚硬的纹理、苦味，并在许多情况下积累有害的毒性成分。去除种子在食用水果中是非常被盼望的，目前，无核水果在国内和国际市场上占据重要地位，越来越受到水果加工产业的欢迎和广大消费者的青睐，也给生产者和广大消费者带来了巨大的经济效益。二十世纪60年代以来，国外已逐步将鲜食品种无核化。我国柑橘品种资源丰富，地方良种很多。但栽培的品种很多是有核的，因而影响了商品价值和在国际市场上的竞争力。因此，无核的特性尤其被需要。本文就至今柑橘在无核上的研究进行了综述，涉及机理，途径和方法三个方面，并进行了展望。1 柑橘无核化的生理机理柑橘中无核品种主要为甜橙类及温州蜜柑，造成它们无核的主要原因是花粉败育。我国已先后获得100多个无核或少核类型的柑橘品种（品系），涉及柑橘属的主要栽培种类和金柑属黄皮属。过去，芽变选种和实生选种是获得无核或少核类型的主要方法和途径，在已报道的119个无核或少核类型中,芽变选种和实生选种分别占39.5和42.92。也有少数品种是用诱变育种或杂交的方法得到的。现在人们尝试利用原生质体融合的方法得到三倍体，从而达到获得无核优良柑橘品种的目的。柑橘无核的机理可以分为以下几个方面：1.1 雄性不育绝大部分的无核或少核柑桔品种都与花粉败育有关，而且其雄性不育可通过杂交遗传给后代3-6。引起花粉败育的原因有遗传因素，也有环境因素,但后者是不能遗传的。就柑橘花粉发育过程而言，导致雄性不育的遗传因素有很多，主要有：花药败育、花粉母细胞退化、花粉粒退化或染色体异常等。花粉母细胞退化，主要由绒毡层退化、抑制花粉细胞分裂所致，而其花粉退化主要由于小孢子液泡形成期绒毡层的异常而引起的营养缺乏。染色体结构的变异体现在同源染色体不联会、易位、倒位等方面。如少核红江橙变异株系，花粉育性只有原母树的30%左右2，伏令夏橙在第一次分裂中期染色体相互易位7。温州蜜柑花粉粒退化，温州蜜柑的不育性可以遗传给后代，利用它与其它品种杂交得到不少不育类型。关于花粉败育的内在生理机制，许多人认为，可能与花药内游离脯氨酸的含量有关，在辣椒8，水稻9，小麦10等不育系中， 检测游离脯氨酸含量明显低于对照；但也有研究者认为，脯氨酸含量的变化是花粉败育的结果，或二者不存在因果关系，是同一原因造成的两种现象11。Palif等12人认为，花药内游离脯氨酸含量与其育性呈正相关，并提出它是花粉粒及花粉育性的衡量指标。但是，陈桂信认为，蕉柑成熟花药游离脯氨酸含量的相对缺乏与花粉败育之间不是一种因果关系，而是两种现象同时发生的一种平行关系。关于雄性不育的机理尚需进一步探明。1.2 雌性不育1.2.1 胚囊败育胚囊是柑橘雌性器官的重要组成部分，胚珠的发育与胚囊的育性关系密切，当胚囊不育或部分不育时，胚珠就不能发育或是部分发育成种子，从而产生无核或少核果实。胚囊败育主要表现在珠被或珠孔发育异常、胚乳核分裂异常、胚乳中途退化、大孢子分裂异常(包括四核或八核时期的卵细胞、极核、助细胞和反足细胞发育异常)等方面。许多柑橘品种都具有不同程度的胚囊不育现象，因为成熟果实内的种子数常比胚珠数目少得多。华盛顿脐橙、伏令夏橙、哈姆林甜橙、温州蜜柑马叙无核葡萄柚等的无核或少核性，除与花粉高度不育有关外，还与胚囊不育密切相关，这些品种的胚囊败育高峰期都在胚囊的四核期，此外在大孢子期和胚囊的二核期及八核期也都发生类似的败育现象。这种遗传的胚囊不育特性同样可以传递给后代。但是，胚囊不育导致无核又是杂交育种的一个障碍，因为如以胚囊不育品种作母本，即使以健全的花粉授粉，也很难得到杂交种子，这样，必须加大杂交数量，才可能得到一定数量的杂交种子和遗传了胚囊不育特性的杂种后代7。Chen等13人认为，桂林良丰无核桠柑胚囊在形成前后大量败育退化。而蕉柑大孢子发生发育过程比正常品种明显滞后，其胚珠和胚囊在发育过程中陆续出现严重的败育现象心14。1.2.2 胚乳败育在柑橘受精时的胚囊，通常只有很少的营养物质，胚乳总是先于胚的发育，为幼胚生长提供条件。胚的生长只有当胚乳正常发育才能进行，如果胚乳败育，胚发育也停顿。有报道表明，胚乳退化继而诱发胚胎中途败育，是最终导致了无核蜜香柚15和“塔1”无核芦柑突变体16的形成的原因。1.3 自交不亲合自交不亲和，主要表现在花粉落于柱头上不萌发，或即使形成花粉管，花粉管的生长缓慢，也不能适时进入胚囊。从而无法完成受精过程，这是那些具有单性结实能力的树种或品种产生无核的原因之一11。在柑橘中，由自交不亲合造成的无核，表现出花粉和胚囊的形态及育性均正常。橙子Keraji品种出现的无核或少核果实是由该品种的雌性不育性、自交不亲和性和单性结实引起的17；日本通过杂交选育的清见柑桔具有花药退化、自交不亲和、单性结实强等优良性状18；宽皮橘中的克可迈丁橘是有名的自交不亲和品种，以其作亲本的杂种后代也常表型出自交不亲合类型；另外，鲁滨逊橘、李橘、佩奇橘柚、诺瓦橘柚等，也是自交不亲合类型；多数柚类的无核品种也都是自交不亲和类型。关于柑桔自交不亲和的遗传机理，大多数研究者认为，主要因为复等位基因的控制，即具有相同基因型的雌雄配子不能结合19。2 柑橘无核育种的途径2.1芽变选种和实生选种芽变是体细胞突变的一种，突变发生在芽的分生组织细胞中，当芽萌发成枝条，并在性状上表现出与原类型有所不同，就是芽变。在自然授粉产生的种子播种后形成的实生群体中，采用一定的选择方法获得新品种的方法称为实生选种。柑橘中存在着广泛的变异，特别是在发生自然灾害后，老年树体会发生一些有益的变异。无核突变是无核柑橘品种的主要来源。现有的无核、少核品种大多数都是来自于有核品种的芽变或珠心胚实生变异。如少核红橘“宣南一号”、黔阳无核大红甜橙等。2.2 辐射育种人工诱变是诱导无核突变的又一手段。柑橘辐射育种的历史不长，1935年才有人利用x射线进行柑橘诱变。1970年，美国Hensz从热中子处理哈德逊葡萄柚种子的实生后代中，选出了无核、红肉的星红玉(Star Ruby)葡萄柚。我国柑橘辐射育种工作开始于20世纪60年代。通过辐射诱变育种得到了红江橙20、雪柑21等的无核或少核的突变体。黄建昌等22人应用60Co-射线辐射处理红江橙、暗柳橙23和沙田柚24的接穗，试验结果表明：由于辐射诱发染色体联会消失，染色体变异，分裂不正常，导致花粉和胚胎败育，致使花粉败育，产生二倍体水平的无核突变。李庄等25人在使用RAPD技术证明有核沙田柚经辐射诱变后形成无核沙田柚时，发现基因组已发生明显变异。近年来，辐射育种已经向细胞和分子水平发展。对离体培养的愈伤组织进行诱变处理，进而选择所需目标性状的优良突变体。但是，辐射诱变的缺点是获得无籽品种的不确定性和偶然性较高。也可通过化学诱导染色体突变获得无核株系，陈大成26等人用秋水仙碱处理十月桔、沙田柚等6个品种的茎尖，仅获得了突变性稳定的四倍体十月桔，其种子数由原来二倍体的15-20粒减少至近无核；李传生等人27用同样的方法获得了四倍体少核金柑。2.3 杂交育种由于柑橘存在多胚现象和有性胚败育现象，有性胚与珠心胚难以区别，因而其杂交育种较其它果树难度更大。为了解决这些难题，人们采用了很多方法提高杂种获得率，并努力探索各种途径，来寻找一种简便准确而实用的方法来鉴别区分杂种苗和珠心苗。在柑橘中可以通过有核与无核品种的杂交，综合双亲控制的包括无核性状在内的多个有利基因。经常利用温州蜜柑、脐橙等遗传性花粉败育品种与其它柑橘品种杂交，可在后代中分离出花药退化的高度雄性不育类型。2.4 三倍体育种凡是染色体数目的倍数大于基数(单倍体)3倍的都称为多倍体(polyploid)；植物界野生种中约有13的是多倍体28。多倍体尤其是奇数多倍体，由于同源染色体在减数分裂时无法平均地分配到配子中去，因而染色体失去平衡，由于三倍体减数分裂不正常，形成的配子缺乏生活力而不易形成种子，同时柑橘具有单性结实特性，可以形成无核果实，因此培育三倍体是得到无核柑橘类型的一个重要途径。1）直接从柑橘二倍体品种的小粒种子中选育出柑橘三倍体，这些充实饱满的小粒种子大小为正常种子的1/61/3，而且大多数为三倍体29,30；2）胚乳培养是获得柑橘三倍体的另一途径，因柑橘胚乳本身就是三倍体，因而可以直接用来培育三倍体；3）利用细胞融合技术获得三倍体植株。利用细胞融合技术得到柑橘四倍体，然后再与二倍体品种杂交得到三倍体植株。也可以利用柑橘四分体小孢子原生质体与体细胞原生质体融合获得三倍体31。2.5 基因工程的方法通过基因工程的方法得到无核柑橘品种的研究，近几年开展得较多，并显示了很好的应用前景。此外，还有一些研究二倍体花粉或二倍体胚，希望只通过授粉就可以得到三倍体果实，而实现得到优良无核柑橘的目的。邓秀新等以异源四倍体花粉对沙田柚授粉，得到了瘪籽的沙田柚果实32。3 利用基因工程获得无核果实的研究进展无核果实是鲜销水果的首选优势性状，为广大消费者所喜爱。传统上，可通过选育天然单性结实和刺激性单性结实品种来实现无核化栽培。但因工作量大，无法遗传及周期长等因素在无性繁殖植物上的研究工作进展缓慢。随着生物技术的发展，利用基因工程原理与技术对植物进行无核的定向的性状改良，大大提高了果实无核化育种效率。3.1 雄性不育基因工程的研究进展雄性不育，是指生理上或遗传上的原因造成植物花粉败育，而雌蕊正常，仍能接受外来花粉的特性。根据遗传特性，雄性不育可分为细胞核不育(Genome male sterility，GMS)和细胞质不育(Cytoplasmic Male SterilityCMS)。GMS受核基因控制，CMS受细胞质和细胞核遗传物质的双重控制。从雄性不育现象已经在很多植物中发现，虽然雄性不育相关因子的位置结构功能等人们还没有研究得很清楚，但是近十几年来，随着细胞分子生物学和分子生物学理论和技术的发展，人们对植物雄性不育的相关机理的研究推上了一个新台阶。由于细胞器分离技术、限制性内切酶技术、分子标记技术、基因克隆和序列分析技术的发展，人们对植物雄性不育现象的特征和遗传规律及其作用机理逐渐有所认识。近十几年来，应用基因工程创造雄性不育植株已经在很多植物上进行并取得了一定的进展。3.1.1 利用基因工程创造雄性不育植株的主要策略目前利用基因工程创造雄性不育主要是利用花粉发育的特异启动子与外源基因嵌合，构建表达载体，转化植物来阻断花粉发育的过程从而达到雄性不育的目的。这些特异的启动子主要包括：在绒毡层中特异表达的基因：烟草的TA29，金鱼草的tap2 基因33，水稻的0sg6B34，拟南芥的蛋白酶抑制剂A9 基因35；在花药中特异表达的基因: 拟南芥和油菜的APG 基因36。在花粉中特异表达的基因如：玉米的 Zm13 (蛋白酶抑制剂)37、CDPK （钙依赖型蛋白激酶）38；番茄的LAT52 39和 LAT 59 40；油菜Bp4 、I3 、E2和 F2s 41。利用基因工程创造雄性不育的策略主要分为以下几种：第一、特异表达细胞毒素基因创造雄性不育系绒毡层是显花植物花粉发育过程中一种独特的分泌细胞，其活跃的代谢与花粉的发育有着密切的关系。绒毡层的主要功能有：营养作用、分泌胼胝质酶、参与花粉外壁和花粉包被的合成等作用。现在已经发现多种绒毡层特异表达的启动子如TA13、TA29、A3、A8、A9 42，将这些特异性启动子与细胞毒素基因（来自黑曲霉素的RNase T1和淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefciens 中的RNase Barnase）嵌合，导入受体植物，细胞毒素基因和特异表达可以选择性破坏花粉、花药的结构，阻断花粉的发育进程，进而达到创造雄性不育种质的目的。由于Mariani首次应用该方法创造了基因工程雄性不育系，故此途径又称为Mariani方法43。这已经被认为是利用基因工程创造雄性不育的成功典范。水稻花药绒毡层高度特异表达启动子Osg6B 启动子与Barnase 基因形成融合基因，构建成表达载体，也利用它得到了雄性不育性转基因植株44。另外也可以将花粉特异启动子（PSL）与Barnase 构建成PSL-Barnase 基因，利用它得到转基因植株45。特异表达细胞毒素基因获得无核果实的技术也被应用于柑橘领域。Koltunow等46将Barnase导入柑橘后发现该基因可使种子减少75，为柑橘的无核育种找到了一条新的途径。Li等47将嵌合基因TA29：Barnase转入多籽椪柑的胚性愈伤组织中，试图得到雄性不育的柑橘优良品种。此后，刘高平48又利用愈伤组织及上胚轴切段的转化，将TA29：Barnase转入多个品种的多籽柑橘，以期获得雄性不育的柑橘品种。第二、利用反义RNA 技术获得植物雄性不育反义RNA 技术是利用一段DNA(或cDNA)，再反向装上启动子和终止子，使反向DNA像正常的DNA一样转录产生RNA，与有关的mRNA 通过碱基互补，形成反义RNA/mRNA 杂交分子，以便抑制或封闭mRNA 正常的翻译和表达，达到特异性抑制或下游调节(down-regulation)目的基因表达的目的。通过反义RNA 技术阻断与花粉发育有关基因的表达可以获得雄性不育植株，此途径由vander Mee等提出。类黄酮是花粉发育过程中的重要物质，苯基苯乙烯酮合成(chalconesynthase，CHS)是其生物合成的关键酶。将“花药盒序列” (anther box sequence)与CaMV35S启动子串连，使其在花药中表达，然后将CHS基因的反义RNA 基因与之串联构建成嵌合基因，利用它得到了矮牵牛转基因雄性不育植株49；利用反义肌动蛋白基因和花药特异启动子TA29 组成的嵌合雄性不育基因也得到了转基因雄性不育植株50；利用热激蛋白HSP70的反义cDNA 也得到了表现雄性不育的植株51,52。第三、通过提早降解胼胝质获得植物雄性不育系胼胝质是在孢母细胞减数分裂完成后作为小孢子的临时膜，以分隔所产生的四分孢子，防止它们之间相互粘连和融合，以及周围二倍体组织或邻近小孢子的影响。绒毡层中胼胝质酶合成与分泌的特异性对于花粉的正常发育具有决定性作用。将-1、3-葡聚糖酶（胼胝质酶）基因与拟南芥绒毡层特异表达的启动子A3 或A9 重组，以农杆菌介导的方法得到转基因植株；将-1、3-葡聚糖酶与PSL启动子连接，并利用它得到转基因雄性不育植株53。第四、细菌基因在植物中组成型表达导致植物雄性不育农杆菌RhizogenesA4 是植物的病原物，Ri 质粒的T-DNA左边界有4个基因rolABCD是致病的关键性基因。如果将这些基因导入植物会导致植物形态和性状变化，造成雄性不育54。Schmulling等将其T-DNA序列间的rolC基因与CaMV35S启动子串联成嵌合基因转化烟草，结果由于rolC基因在转基因植株中的系统表达，使得植株在形态上发生了一系列的变化，包括株高降低，顶端优势减弱，叶片色素水平降低，最令人感兴趣的是植物雄性不育。除此之外，rolC的转基因马铃薯和拟南芥菜也同样表现雄性不育。而Spean等55将农杆菌的rolB与金鱼草的TAP1启动子, 启动子融合后转化烟草，结果花药中的IAA含量增加，而GA含量却下降，导致花粉发育异常，植株表现雄性不育。第五、其他策略现在人们已经在一些植物的线粒体上找到了一些与细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)有关的基因，通过基因工程的方法扰乱线粒体与细胞核之间的信息交流，可以导致植物雄性不育56。3.2 单性结实基因工程的研究进展单性结实(Parthenocarpy)是指不经过授粉或授粉而不受精形成果实的现象。单性结实是无核果实生产的一个重要的性状要求57。柑橘中存在不同单性结实能力的突变体，如塔西提来檬(Tahiti lime)、温州蜜柑(Satsuma mandarin)等具有较强的单性结实能力，不需要授粉就可形成果实(专性单性结实)；而星路比葡萄柚(Star-ruby grapefruit)的单性结实能力较弱，必须经授粉刺激才能形成果实(兼性单性结实)。温州蜜柑虽然单性结实能力较强，但并不适合作为母本进行无核果实的育种，因其胚囊败育、花粉雄性不育，且果实中仅存的少量种子具有多胚性的性状58。因此，有效地利用基因工程手段诱导具备自交不亲和或雄性不育的柑橘品种来获得单性结实，成为快速获得无核柑橘新种质的一个新途径。3.2.1 利用基因工程创造单性结实植株的主要策略天然单性结实中，单性结实果实的子房在开花期及开花后早期含有较高浓度的IAA及其它生长促进物质，能有效刺激子房发育成果实，如在未开的花中，无核伏令夏橙的IAA为239 mgkg明显高于有核伏令夏橙（058 mgkg）。因此，运用转基因技术，在子房中特异表达影响生长素及其他激素合成的基因，开辟了在开花期和果实发育早期诱导单性结实的新途径59。Sitbon把iaaM基因和组织特异性启动子CaMV 35s结合，导入到烟草中，发现转基因植株的IAA水平比未转化植株高10倍，但是表达iaaM基因的转基因植株在形态发育方面表现出一些不正常的特征，如茎和叶形成不定根“矮化”，顶端优势增强和发育上的退化。可能是因为在强启动子的诱导下，整株植株合成的IAA的量大大超过了IAA调节系统的能力，从而导致植物表型的变化。最近的研究表明,将一些子房和种子特异性表达启动子(如DefH9、GH3、AGL5、INO、FBP7和SSP等)与农杆菌的影响激素合成的基因结合构建融合基因导入植物中，可使植物产生无核果实。应用的最为广泛的就是将来源于根癌农杆菌(Atumefaciens)以及假单胞菌(Pseudomonas syringae pv. savastanoi)的iaaM基因和来自于大金鱼草(Antirrhinum majus)的DefH9基因结合形成DefH9-iaaM基因导入到植物中，就可能调控iaaM基因只在植物胚珠发育的时候合成IAA，促使子房不通过授粉受精而膨大，从而形成单性结实。iaaM基因编码的色氨酸单加氧酶 (tryptophan monooxygenase)可催化色氨酸转变成吲哚乙酰胺(IAM)，吲哚乙酰胺可进一步由产物吲哚乙酰胺水解酶酶(IAAH，由iaaH基因编码)催化生成IAA60。DefH9来自于大金鱼草(Antirrhinum majus)缺失的同源染色体9，该基因是一个子房特异启动子，它具有在子房中特异表达的功能。目前DefH9-iaaM基因已经成功导入多种植物中，如烟草61、茄子62、番茄63,64、草莓65,66 )、葡萄 67、黄瓜68，并获得了单性结实的无核果实，从而更加显示出了单性结实的转基因植物的商业潜力。冯鹄竣69，罗赛男等70利用农杆菌介导的遗传转化方法将DefH9：iaaM基因分别转入沙田柚和糖橙中，以期获得单性结实的无核果实。单性结实也被通过胚珠特异性启动子诱导rolB表达而产生。在TRP-F1启动子(一种子房和幼果特异表达启动子) 诱导下的rolB基因表达，产生了无核的番茄果实。来自拟南芥的INO胚珠特异性启动子特异表达iaaM和rolB基因，成功诱导番茄单性结实71。美国康涅狄格大学的李义教授发明的果实无核化专利（US Patent 6268552）以果实特异性表达启动子AGL 5或GH3进行调控，通过优先和特异性表达异戊烯转移酶（ipt）或色氨酸加氧酶编码基因（iaaM）来促进细胞分裂素和生长素的合成，成功实现了番茄的无核化。单性结实水果也通过SlIAA9基因（IAA4的前体）和SlARF7的沉默来获得。并且ARF8基因的突变也已经被证明可诱导单性结实的番茄。利用基因工程获得的单性结实品种具有明显的增产潜力。Mezzetti等72,73将DefH9-iaaM基因导入草莓，转基因株系花芽中IAA的含量明显高于对照，且转基因植株的繁殖能力、单果重、果实大小、总产量等都显著增加。Pandolfini等74对嵌合基因DefH9-iaaM进行了改良，改良后的基因为DefH9-RI-iaaM，将其转入UC82番茄品种后，生长素的含量比对照增加10倍，所结单性结实的果实产量增加，无畸形果。3.3 通过诱导雄性不育与单性结实共同作用形成无核果实将雄性不育基因TA29-Barnase转入具有单性结实的植株中，其转化植株呈现显性杂合不育系，当与正常对照植株杂交后，其杂交后代中会出现50的可育植株75；Mikkelsen等(1996)对转耐除草剂Basta基因油菜(Bnapus)与杂草型亲缘种(Bcampestris)杂交、回交后代植株的育性及染色体数目进行研究，结果发现杂种花粉的育性超过90，其农艺性状和染色体数目接近野生种型，并有42左右的植株抗除草剂Basta，经过不断的回交，转基因作物中的外源基因还可进入野生亲缘种的遗传背景中，造成转基因的逃逸76；刘高平48将Barnase与抗除草剂的筛选标记基因Bar共同转入多籽柑橘，保证了后代植株具有较高纯合率的无核性状。将单性结实基因转入植株后，需抑制异花授粉、自交亲和的性状，且需人工去雄后才能获得无核果实。Chao等77对自交不亲和的柑橘采用隔离区的方式生产无核果实。自交不亲和的克里曼丁橘，在相隔97 km，面积为1214 ha的区域内，可获得“绝对意义上无籽的果实，但是有限的地域限制，需要寻找更适宜的方法进行无核柑橘的生产。因此，将雄性不育和单性结实两种特性结合起来加强无核频率，因该能够获得效率高并完全无核的果实。美国康涅狄格大学李义教授就将含有雄性不育基因Barnase及单性结实基因iaaM的融合基因转入西瓜中，获得了完全无籽的西瓜。利用此融合基因转化植株，既解决了显性杂合不育系的产生，又减少了去雄的繁琐工作，可谓一石二鸟。参考文献1陈俊伟, 谢鸣, 吴江. 遗传工程无耔果实原理及其研究进展J. 浙江农业学报, 2003, 15(6):365-371.2邓秀新, 郭文武, 孙绪华. 我国无核柑桔类型选育研究进展. 园艺学报, 1996, 23(3):235-240.3温寿星, 蔡子坚. 我国无核柑桔不育机理研究概况J. 福建果树, 2000, (2):15-16.4肖金平, 陈力耕. 叶伟其. 等. 萌桎2号”无核桠柑花粉育性及超徽结构观察J. 浙江林业科技, 2006, 26(1):36-38.5曾燕如, 张炼炳, 斯金平, 等. 无籽瓯柑无核原因的研究J. 浙江林学院学报, 2005, 22(4):359-362.6李庄, 陈茂鑫, 韦文楼, 等. 无核早熟沙田柚与花粉败育-无核机理研究J. 激光生物学报, 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