神经生物学研究的常用方法.doc

1. 神经生物学研究的常用方法神经科学的发展与的研究方法的进步密切相关。总体上，神经生物学的研究方法有六大类：形态学方法、生理学方法、电生理学方法、生物化学方法、分子生物学方法及脑成像技术。7.1 形态学方法神经生物学研究中常用的形态学方法有束路追踪、免疫组化和原位杂交，其他还有受体定位、神经系统功能活动形态定位等方法。7.1.1 束路追踪法追踪神经元之间的联系是神经解剖学研究中的重大目标，它对研究神经元的功能、神经系统的发育和成熟都具有重要意义。这种方法学的建立始于19世纪末的逆行和顺性溃变（顺行溃变指胞体或轴突损伤后的轴突终末的溃变，逆行溃变指去除靶区之后神经元胞体的溃变）研究。20世纪40年代主要手段是镀银染色法，根据变性纤维的形态变化来判断变性纤维。20世纪50年代发展了Nanta法，能遏制正常纤维的染色而仅镀染出变性纤维。但该法不易显示细纤维，1971年Kristenson等将辣根过氧化物酶（HRP）注入幼鼠的腓肠肌及舌肌结果在脊髓和延脑的相应部分运动神经元胞体内发现HRP的积累 。不久LaVail正式使用HRP作为轴突逆行追踪，以后遂广泛应用于中枢神经系统的研究。HRP可被神经末梢、胞体和树突吸收，轴突损伤部分也可摄入。在胞体内，HRP的活性可持续45天，在溶酶体内对联苯胺呈阳性反应而显现出来。被标记的神经元可以清晰的显示胞体、树突及轴突。除了HRP标记法，还有荧光物质标记法、毒素标记法、注射染料等方法。7.1.2 免疫组织化学免疫组织化学术是应用抗原与抗体结合的免疫学原理，检测细胞内多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。这种方法特异性强，敏感度高，进展迅速，应用广泛，成为生物学和医学众多学科的重要研究手段。近年随着纯化抗原和制备单克隆抗体的广泛开展以及标记技术不断提高，免疫组织化学的进展更是日新月异，不仅用于许多基本理论的研究，并取得重大突破，而且也用于疾病的早期快速诊断等临床实际。组织的多肽和蛋白质种类繁多，具有抗原性。分离纯化人或动物组织某种蛋白质，作为抗原注入另一种动物体内，后者即产生相应的特异性抗体（免疫球蛋白）。从被免疫动物的血清中提取出该抗体，再以荧光素、酶、铁蛋白或胶体金标记，用这种标记抗体处理组织切片或细胞，标记抗体即与细胞的相应蛋白质（抗原）发生特异性结合。常用的荧光素是异硫氰酸荧光素（FITC）和四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC），在荧光显微镜下可观察荧光抗体抗原复合物。常用的酶是辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP,从辣根菜中提取的），它的底物是3，3二氨基、联苯胺（DAB）和H2O2,HRP使DAB氧化形成棕黄色产物，可在光镜和电镜下观察。铁蛋白和胶体金标记抗体与抗原的结合，也可在光镜和电镜下观察。标记抗体被检抗原的结合方式有两种。一是直接法，即如上述用标记抗体与样品中的抗原直接结合。这种方法操作简便，但敏感度不及间接法。间接法是将分离的抗体（第一抗体简称一抗）再作为抗原免疫另一种动物，制备该抗体（抗原）的抗体（第二抗体简称二抗），再以标记物标记二抗。先后以一抗和标记二抗处理样品，最终形成抗原一抗标记二抗复合物。间接法中的一个抗原分子可通过一抗与多个标记二抗相结合，因此它的敏感度较高，而且目前国内外均有多种标记二抗商品供应，使用方便。间接法中较常用的是一种称之为过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法（peroxidase-antiperoxidase complex method,PAS法），该法除需一抗和二抗外，还需制备HRP标记的抗酶抗体，即以HRP作为抗原免疫动物，制成抗HRP抗体，再以HRP标记该抗体制成由3个酶分子与2个抗酶抗体组成的相当稳定的环形PAP复合物。标本先后以一抗、二抗和PAP复合物处理后，再以DAB显色，即可检测抗原的分布。此法由于细胞内的抗原通过抗体的层层放大而与多个酶分子结合，因此敏感性很强。免疫组织化学术近10年来又有新进展，如生物素亲合素等新颖试剂的应用，为检测微量抗原、受体、抗体开辟了新途径。生物素（biotin）又称维生素H，是从卵黄和肝中提取的一种小分子物质（分子量244.31）；亲合素（avidin）又称卵白素，是从卵白中提取的一种糖蛋白（分子量 68kD）。每个亲合素分子有生物素结合的4个位点，二者可牢固结合成不可逆的复合物。生物素亲合素的应用大致有三种方法。标记亲合素生物素法（labelled avidin- biotin method,LAB法）：将亲合素与标记物（HRP）结合，一个亲合素可结合多个HRP；将生物素与抗体（一抗与二抗）结合，一个抗体分子可连接多个生物素分子，抗体的活性不受影响。细胞的抗原（或通过一抗）先与生物素化的抗体结合，继而将标记亲合素结合在抗体的生物素上，如此多层放大提高了检测抗原的敏感性。桥连亲合素生物素法（bridged avidin-biotin method,BAB法）：先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游离亲合素将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连接，也达到多层放大效果。亲合素生物素过氧化物酶复合物法（avidin-biotin-peroxidase complex method,ABC法）；此法是前两种方法的改进，即先按一定比例将亲合素与酶标生物素结合在一起，形成亲合素生物素过氧化物酶复合物（ABC复合物），标本中的抗原先后与一抗、生物素化二抗、ABC复合物结合，最终形成晶格样结构的复合体，其中网络了大量酶分子，从而大大提高了检测抗原的灵敏度。现有配制现成的ABC药盒商品供应，操作简便，是目前广泛应用的一种方法。7.1.3 原位杂交法（in situ hybridization）原位杂交术是一种核酸分子杂交技术，它是通过检测细胞内mRNA和DNA序列片段，原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。其基本原理是根据两条单链核苷酸互补碱基序列专一配对的特点，应用已知碱基序列并具有标记物的RNA或DNA片段即核酸探针（probe），与组织切片或细胞内的待测核酸（RNA或DNA片段）进行杂交，通过标记物的显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在与定位。此项技术需首先制备某种核酸探针，其种类主要有三种：利用大肝杆菌重组带有目的基因的质粒DNA，制成互补DNA探针(cDNA);应用限制性核酸内切酶消化制成线性DNA模板，在体外转录获得反义RNA探针(cDNA);依照待测核酸的核苷酸序列，应用DNA合成仪合成寡聚核苷酸探针。cRNA和cDNA的常用标记物有32S、32P、3H等放射性核素和荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质。组织学应用的原位杂交术主要是染色体原位杂交和细胞原位杂交。前者是研究遗传基因、抗原基因、受体基因、癌基因等在染色体上的定位与表达；后者是研究细胞某种蛋白质的基因转录物mRNA在胞质内的定位与表达。核酸分子杂交术有很高的敏感性和特异性，它是免疫细胞化学的基础上，进一步从分子水平探讨细胞功能的表达及其调节机制的，已成为当前神经生物学研究的重要手段。7.2 生理学方法神经生物学研究中的生理学方法有行为学方法、神经递质释放量的测定等，其中行为学方法最为常用。7.4.2 行为学方法行为学方法是建立在条件反射基础之上。条件反射是著名的俄国生理学家巴甫洛夫于20世纪初提出的。条件反射是动物个体生活过程中适应环境的变化，在非条件反射基础上逐渐形成的。形成条件反射的基本条件就是无关刺激与非条件刺激在时间上的结合，这个过程称为强化。要形成条件反射除需要多次强化外，还需要神经系统的正常活动。巴甫洛夫及其学派所研究的条件反射，称为经典性条件反射。另一种条件反射叫操作性(工具性)条件反射，美国心理学家斯金纳(BFskinner)把一只饿鼠放入实验箱内，当它偶然踩在杠杆上时，即喂食以强化这一动作，经多次重复，鼠即会自动踩杠杆而得食。在此基础上还可以进一步训练动物只对某一个待定信号，如灯光、铃声出现后，做出踩杠杆的动作，才给以食物强化，这类必须通过自己某种活动(操作)才能得到强化所形成的条件反射，称为操作性条件反射或工具性条件反射。操作性条件反射和经典性条件反射的基本原理是相同的，它们都以强化和神经系统的正常活动为基本条件，但它们之间也有不同之处。在形成操作性条件反射过程中，动物可以自由地活动，它通过主动操作来达到一定的目的；但在形成经典性条件反射时，动物往往被束缚着，是被动地接受刺激。另外，在操作性条件反射中强化只同反应(操作)有关，并出现在反应之后；而在经典性条件反射中，强化是同刺激有关，而且出现在反应之前。7.4.2 电生理学的方法电生理学的方法包括胞外记录、胞内记录、脑内电刺激、电压钳、膜片钳、脑电图等技术。电生理学发源于1791年。电流计的发明和应用于电生理学，初步满足了记录生物电活动的变化量小而变化速度快的特点。1922年Erlanger和Gasser用了电子管放大器和阴极射线示线器，才彻底满足了记录生物电活动的基本特点。从此神经生理学得以迅猛发展。20世纪40年代以来，英国剑桥大学Hodgkin学派利用微电极技术，而且选用了理想的实验标本枪乌贼的巨轴突，在修正了Bernstein膜学说的基础上，建立了动作电位的钠学说，阐明了神经冲动的传导理论。约在同一时期，Forbes和Renshaw等运用微电极开始了研究中枢神经系统神经元活动的工作。Hodgkin等人为精确测量神经活动中的离子运动，发展了电压钳实验技术。电压钳把单一的跨膜离子流从众多的离子流中分离出来，通过离子流的测定来分析离子通道开放及关闭的动力学变化。双微电极电压钳技术是把两根尖端小于0.5m的玻璃电极插入细胞内分别作为电位记录电极和电流注入电极。电位记录电极引出的膜电位经电压钳仪的前置放大器放大后，输入至电压钳仪的运算放大器的负输入端，而人为控制的指令电位输入其整输入端，两者的不断进行比较，将差值送入驱动放大电路，两者的任何差异都会被放大电路放大，并通过电流注入电极将相反方向的电流注入细胞，是膜电位钳制在指令电位水平。此时，注入细胞的电流值与标本兴奋时的跨膜电流值大小相等，方向相反。在此基础上, Neher又发展了膜片钳技术。它是将尖端直径仅为1m的玻璃电极吸附到细胞膜表面上，对微电极内施加负压，微电极与细胞膜形成10G的高阻封接，可记录膜上的pA级的离子通道电流，为从分子水平了解生物膜离子单通道的开、关动力学，通透性和选择性提供了直接手段。为此Neher获得1991年诺贝尔医学或生理学奖。在电生理技术中脑电图和诱发电位的描记反映了脑细胞群体活动的总和性电位，在临床诊断方面具有重要价值。神经系统的电生理方法，对神经科学的理论发展起着重要作用。7.3 生物化学的方法经典的生物化学方法包括离心、电泳、层析、质谱等。由于生物化学方法与药理学、免疫学等其他学科相结合，又发展了放射免疫(Radioimmunoassay，RIA)、放射受体和免疫印迹等方面。离心法是各种制备、鉴定方法的起始步骤，几乎没有一个实验没有离心法，也几乎没有一个实验仅用离心法就能完成。各种层析法是用来制备、鉴定和分离物质的主要手段，通常需将几种不同的层析法交替使用，才能达到预期的结果。由于HPLC和FPLC的使用，使分离的效率和分辨率大大提高。RIA是用来检测生物体内低含量物质（如神经介质、激素）的重要手段，也是对抗体进行检验的重要手段。RIA主要用来分析研究受体的特性，也可用于测定某一受体的配体的含量及分析比较各种配体的作用强度。免疫印迹法结合了电泳及KIA的优点，是鉴定蛋白质及肽类分子的理想方法。7.4 分子生物学的方法分子生物学技术同神经生物学结合产生了分子神经生物学，分子生物学技术在神经生物学中的应用有基因的分子克隆及表达、聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）、遗传连锁分析、反向遗传学等。7.4.2 PCRPCR是利用耐高温的DNA聚合酶体外快速扩增DNA的技术。通过PCR可以简便、快速地从微量生物材料中获得大量特定的核酸，并具有很高的灵敏度和特异性，可用于微量核酸样品的检测。PCR技术原理是将欲扩增的DNA做模板，以和模板正链和负链互补的两种寡聚核苷酸做引物，经过模板DNA的变性、模板与引物结合复性及在DNA聚合酶作用下发生引物链延伸反应的三步循环来扩增两引物间的DNA片段。每一循环的DNA产物经变性后又成为下一个循环的模板 DNA。这样，目的DNA的数量将以2n指数形式累积，短时间内的30个循环， DNA量就可达到原来的上百万倍。7.4.2 神经与精神性遗传疾病的基因定位、分离克隆与突变检测基因定位是基于基因的连锁分析和关联分析。在家系中，位于同一染色体上的两个位点（致病基因和遗传坐标）在减数分裂的过程中会发生交换和重组。重组率越高，两个位点在一起传给后代的机会就越少，反之，越高。通过用覆盖密度适当的遗传图中的遗传坐标在家系中进行连锁分析，以此找到与某以作标紧密连锁的致病基因，从而确定该基因在染色体上的粗略位置。常用的遗传坐标有RFLP、小卫星坐标、微卫星坐标及单核苷酸多态坐标等。关联分析是在可能的候选致病基因附近选择遗传坐标等位片段多态性，在正常人和病人之间进行比较，得到某一坐标等位片段和引起疾病基因关联的相对危险度。基因的分离与克隆的基本原理是在克隆有人基因组的YAC（或BAC或cosmid等文库中找到对应于基因定位的染色体区域，通过STS是载有该区域片段的文库按正确方向排列成重叠群。寻找到存在这些片段上的基因，再用合适的限制性内切酶进行切割分离，并克隆到按设计要求的载体上。7.5 影像技术在神经生物学研究中的应用7.5.1 计算机断层扫描术（CT）CT技术的关键是X光源，X光检测器和计算机系统。位于头颅一侧的X光源发出一束平行的X光束，X光束透过头颅后由位于头颅另一侧的X光检测器接收。X光源和X光检测器可围绕头颅作180度旋转，在每个旋转角度上都可以得到一组放射密度测量数据。计算机把成千上万的不同位点的放射密度换算成相应的衰减系数，然后根据每一个位点的衰减系数大小用不同的黑白亮度来显示。CT可清楚地显示颅骨、脑组织和脑脊液，但不能用于检测大脑的功能。 编辑本段CT扫描仪的发展历程自从X射线发现后，医学上就开始用它来探测人体疾病。但是，由于人体内有些器官对X线的吸收差别极小，因此X射线对那些前后重叠的组织的病变就难以发现。于是，美国与英国的科学家开始了寻找一种新的东西来弥补用X线技术检查人体病变的不足。1963年，美国物理学家科马克发现人体不同的组织对X线的透过率有所不同，在研究中还得出了一些有关的计算公式，这些公式为后来CT的应用奠定了理论基础。1967年，英国电子工程师亨斯费尔德在并不知道科马克研究成果的情况下，也开始了研制一种新技术的工作。他首先研究了模式的识别，然后制作了一台能加强X射线放射源的简单的扫描装置，即后来的CT，用于对人的头部进行实验性扫描测量。后来，他又用这种装置去测量全身，获得了同样的效果。1971年9月，亨斯费尔德又与一位神经放射学家合作，在伦敦郊外一家医院安装了他设计制造的这种装置，开始了头部检查。10月4日，医院用它检查了第一个病人。患者在完全清醒的情况下朝天仰卧，X线管装在患者的上方，绕检查部位转动，同时在患者下方装一计数器，使人体各部位对X线吸收的多少反映在计数器上，再经过电子计算机的处理，使人体各部位的图像从荧屏上显示出来。这次试验非常成功。1972年4月，亨斯费尔德在英国放射学年会上首次公布了这一结果，正式宣告了CT的诞生。这一消息引起科技界的极大震动，CT的研制成功被誉为自伦琴发现X射线以后，放射诊断学上最重要的成就。因此，亨斯费尔德和科马克共同获取1979年诺贝尔生理学和医学奖。而今，CT已广泛运用于医疗诊断上。 编辑本段CT扫描仪的工作程序CT的工作程序是这样的：它根据人体不同组织对X线的吸收与透过率的不同，应用灵敏度极高的仪器对人体进行测量，然后将测量所获取的数据输入电子计算机，电子计算机对数据进行处理后，就可摄下人体被检查部位的断面或立体的图像，发现体内任何部位的细小病变。7.5.2 正电子发射计算机断层扫描（Positron Emission Tomography，）正电子发射计算机断层扫描（Positron Emission Tomography，）是核医学发展的一项新技术，代表了当代最先进的无创伤性高品质影像诊断的新技术，是高水平核医学诊断的标志，也是现代医学必不可少的高技术。的独特作用是以代谢显像和定量分析为基础，应用组成人体主要元素的短命核素如11、13、15、18等正电子核素为示踪剂，不仅可快速获得多层面断层影象、三维定量结果以及三维全身扫描，而且还可以从分子水平动态观察到代谢物或药物在人体内的生理生化变化，用以研究人体生理、生化、化学递质、受体乃至基因改变。可以说是同位素发射计算机辅助断层（）的一种。正电子发射是放射性元素衰变的方式之一。这类核素在自发地从不稳定状态向基态衰变过程中，从核内释放出与普通电子一样但电荷相反的粒子，即正电子。正电子是一种反物质，从核内放出后很快于环境中自由电子碰撞湮灭，转化为一对方向相反、能量为511kev的光子。如果在这对光子飞行方向上对置一对探测器，便可以几乎在同时接受到这两个光子，并可推定光子发源（即正电子发射）点在两控头间连线上。通过环绕 360排列的多组配对探头，经探头对间符合线路检验判定每只探头信号时间耦合性，排除其它来源射线的干扰，得到探头对连线上的一维信息，再用滤波反投射方式，将信号按探头对的空间位置向中心点反投射，便可形成与探头组连线轴平行的断层面正电子发射示踪剂分布图像。这种探测方式一次只反映一个层面的信息，与CT探测方式很接近，实用中常用多层排列的探头对，配合层间符合线路，以利探测并重建更多层面的图像。在临床中，当由正电子放射性核素所标记的示踪剂（显像剂）注入血流后，到达全身，聚集在特定的器官或某一部位，通过对应的探头，采用符合线路技术，探测器从360方向检测不同部位的光子，记录释放出光子的时间、位置数量及方向。显像装置绕人体旋转，多角度采集，信息经计算机贮存，再通过影像重建原理获得人体各部位横断、冠状断面和矢状断面影像。显像仪的结构与线、或基本相似，由探头、数据处理系统、图像显示及检查床组成。大多数PET使用放射性2-18氟-2-D-脱氧葡萄糖（）作为示踪剂，这种类型的葡萄糖与普通葡萄糖化学性质相似，可在人体中产生有标记的代谢物，并且在人体中存留时间较长，便于测量。正常脑组织、心肌组织、肾脏及膀胱组织由于高糖代谢的需要因而对摄取较多。其它一些组织如肝脏、肌肉和肠壁由于其糖代谢水平低，则对的摄取量较少，显示出的活性水平也较低。其它用于PET研究的示踪剂如15OH2O可用来测量局部脑组织、心脏或肾脏的血流量，18F-DOPA、18F-UDR可用于评价受体的部位、密度及活动水平等。FDG PET中病人所接受的放射线剂量与CT基本相似。正常范围 PETPET特别适用于在没有形态学改变之前，早期诊断疾病，发现亚临床病变以及评价治疗效果。目前，PET在肿瘤、冠心病和脑部疾病这三大类疾病的诊疗中尤其显示出重要的价值。 检查介绍 PET中文译名为“派特”，是一种非创伤性的用于探测体内放射性核分布的影像技术。其全称中的“正电子” 临床意义 传统的医学影像技术显示的是疾病引起的解剖和结构变化，而PET显示的则是人体的功能变化。换言之，如果人体的解剖结构没有发生改变，传统的影像技术对于疾病的诊断是无能为力的。实际上，疾病的发生都伴随着生化过程的功能改变， 这些改变往往要早于解剖结构的改变；还有一些疾病如早老性痴呆、帕金森氏病等 本身就没有明显的结构改变，传统的医学影像就无法显示这些功能方面的变化了。PET能得天独厚地显示功能性的改变，因而对疾病的更早期发现、诊断具有优势；此外，PET还能进行三维立体动态及全身显像，可发现其它检查所不能发现的问题，防止了“叶障目，不见泰山”，弥补了传统医学影像的不足。 基本原理 PET是利用发射正电子的同位素作为标记物，将其引入脑内某一局部地区参与已知的生化代谢过程，利用现代化计算机断层扫描技术将标记物所参与的特定代谢过程的代谢率以立体成像的形式表达出来，可测定到组织对葡萄糖的利用和脑的局部血流量（灵敏度高达皮摩尔）。7.5.3 磁共振成像（Magnetic rexonance imaging, MRI）磁共振成像从原理的发现到目前临床各种先进成像技术的应用，是基于科学家们对原子结构的不断认识。1924年Pauli发现电子除对原子核绕行外，还可高速自旋，有角动量和磁矩。1946年美国哈佛大学的Percell及斯坦福大学的Bloch分别独立地发现磁共振现象并接收到核子自旋的电信号，同时将该原理最早用于生物实验，在物理学、化学方面作出了较大的贡献。1952年荣获诺贝尔物理奖。磁共振成像的设想出自Damadian。1971年发现了组织的良、恶性细胞的MR信号有所不同。1972年P. C. Lauterbur用共轭摄影法产生一幅试管的MR图象。1974年作出第一幅动物的肝脏图象。核子的自旋和磁矩的存在，使其能够在强大的磁场中旋进。Radi测出不同核子的角动量和磁矩。不同核子在同一磁场中其磁矩和角动量各不相同。同一核子在不同场强的磁场中，其振荡频率也不相同。磁共振是共振现象的一种，是指原子核在进动中吸收外界能量产生的一种能量跃迁现象。这种跃迁只能出现在相邻两个能量级之间。所谓外界能量是指一个激励电磁场（射频磁场），它的磁矢量在某一个平面上旋转，因此，除其旋转频率正好与原子核回转频率相同外，其自旋方向必须和核磁矩相同，原子核才会吸收到能量，这是磁共振现象的必要条件。磁共振成像技术的发展产生了许多成像技术方法，但总的设计思想是如何用磁场值来标记受检体中共振核子的空间位置。发生共振的频率与它所在的位置的磁场强度成正比。如果能使空间各点的磁场值互不相同，各处的共振频率也就不同，把共振吸收强度的频率分布显示出来，实际就是共振核子的分布，即核磁共振自旋密度图象。但不可能使同一时刻的三维空间中各点具有不同的磁场值，所以需设计突出各特定点信息的方案。要达到此目的，首先可对观测的对象进行空间编码，把研究对象简化为由nx，ny，nz个小体积（体素）的组成，然后采用依次测量每个体素或由体素排列的线或面的信息量，再根据个体素的编码与空间位置的一一对应关系实现图象重建。由于成像的灵敏度、分辨率、成像时间和信噪比（S/N）等要求不同，产生了多种成像方法，归纳起来可分为两大类：一是投影重建法；二是非投影重建法，包括线扫描成像法和直接傅立叶变换（fourier transform）成像法。Step of stereotaxic surgerya) The stereotaxic instrument is fixed.b) To achieve the flat skull position, the incisor bar was adjusted above interaural zero.（according to the instruction of brain maps）.c) Mice were anesthetized with sodium pentobarbital (40 mg/kg body weight, i.p.) for stereotaxic surgery. Compared to a rat, the skull of a mouse is paper thin. The airways run through the centerline directly between the two ears. Thus, it is very easy to strangle a mouse with even lightly applied ear bars. If ear bars are used on a mouse, the surgeon must be very watchful to see that they are in firmly enough to hold the head stable, and that the animal continues to be able to breath through the entire procedure. To avoid this, most researchers working on mice use a nose only holder, and not ear bars. This, however, introduces serious instability, particularly if the surgery is back toward the brainstem, as the leverage to move increases the further back the work is being done. Instability means reduced accuracy, and more animals needed. An alternative is the Cunningham head holder for mice (or neonatal rats, where a similar situation applies) that employs light, small plastic ear bars that allow the surgeon to feel the pressure of application better than with the heavy stainless steel ear bars commonly used. These allow ear bars to be used successfully on adult mice.d) Stainless-steel guide cannulas are implanted into nucleus according to brain maps. Guide cannulas were fixed to the skull with thre