一个几丁质结合蛋白从草地螟鉴定和分子特征.doc

一个几丁质结合蛋白从草地螟鉴定和分子特征摘要：中肠是昆虫的一个关键屏障，围食膜（PM）在防止外部侵入中起重要作用。PM蛋白质，PM的主要组成部分，确定该膜的结构和功能。从草地螟幼虫的PM的CDNA文库中筛选出一个新的围食膜蛋白，命名为LstiCBP.LstiCBP的全长cDNA为2606 bp的长度，并包含一个2403 bp的开放阅读框是前蛋白编码一个808个氨基酸的具有15个氨基酸的信号肽。cDNA的推导蛋白质序列包含8个富含半胱氨酸的几丁质结合结构域（CBD的）。重组LstiCBP用重组质粒DNA成功地表达在BL21细胞和表现出较高的几丁质结合活性。同时在转录和翻译水平检测中肠LstiCBP表达，然而，LstiCBP在草地螟的生化和生理功能需要进一步调查。1. 介绍 围食膜，是无脊椎动物昆虫内脏中的特有结构，它可以保护昆虫免受病毒，细菌，原生动物和蠕虫的入侵，防止食物颗粒磨损肠细胞。在微生物和昆虫的共同进化的过程中，一些微生物形成若干机制破坏PM。与此同时，许多因素的影响，例如，Pseudaletia unipuncta GV（PuGV）增效，几丁质酶，calcoflour和凝集素，可以破坏PM的形成和提高病原体感染昆虫的几率。因此，作为病原微生物天然屏障，围食膜已经成为害虫控制的潜在靶点。 昆虫PM主要由蛋白质和几丁质组成，几丁质结合活性作为其典型特征。识别各种各样昆虫PM蛋白的表征将有助于发展虫害管理目标，以及提供更好的理解PM的功能和发展。目前，对PM的分子结构和形成机制的了解取得了显著的进展，有超过30种PM蛋白或几种昆虫PM蛋白也被鉴定出。四类PM蛋白质是基于该蛋白质在不同溶解度条件下提取而区分的。第1类PM蛋白是那些可以溶于生理盐水，第2类PM的蛋白质可以溶于温和的洗涤剂，第3类PM蛋白包括那些仅由强变性剂提取的和第4类PM蛋白质是不能提取的，即使是强变性剂。第3类蛋白是从PM提取到最多的一类蛋白。这些蛋白质通常具有几丁质结合结构域或peritrophin domains.PM蛋白质的结构特征主要集中在以下几类：围食膜因子，无脊椎动物肠粘蛋白和蛋白质与几丁质脱乙酰酶结构域。所述的围食膜因子含有60-75个氨基酸残基，并且其特征在于，半胱氨酸残基的conserved register和一个数个芳香族氨基酸残基。所述保守的半胱氨酸残基认为形成的域内二硫键有助于蛋白质在蛋白酶丰富的肠道环境中不被降解。昆虫肠粘蛋白（IIM）是一种高度糖基化的粘蛋白样蛋白非常强烈地结合在1类PMs上，是在Trichoplusiani幼虫10,29中确定的，它包含peritrophin-A结构域。几丁质脱乙酰酶（CDA; EC3.5.1.41）是催化在几丁质和脱乙酰几丁质的N-乙酰葡糖胺的乙酰基的水解，从而产生葡糖胺和乙酸水解酶。几丁质脱乙酰酶是新发现的昆虫PM组成成分。 草地螟，草地螟属（鳞翅目：螟蛾科），是一种多食性害虫，它以在35科200种植物和农作物为食，如玉米，大豆，马铃薯，甜菜，向日葵等。它几乎每年都造成了严重的经济损失，并成为最严重的一种害虫在亚洲，欧洲和北美。在这项研究中，我们从草地螟幼虫cDNA文库筛选出了一种新的PM蛋白质，被命名为LstiCBP。新型PM蛋白质表现出强的几丁质结合活性，这使得该蛋白质可能在PM的形成扮演着重要的角色。2. 结果与讨论 2.1 草地螟的CBP基因cDNA克隆 利用cDNA末端（RACE）-PCR扩增技术快速扩增，从草地螟中克隆全长为2606 bp的CBP cDNA（图1)（GenBankFJ408730)。所述LstiCBP cDNA的开放读框（ORF）包括2403个核苷酸，预测编码含有801个氨基酸的前体蛋白。它的ORF是由一个TAA终止密码子终止，之后是一个富含AT碱基的非编码区和推定的聚腺苷酸化信号（TATATAA）位于polyA尾的上游的69个碱基处（图1）。推导的蛋白序列显示有15个氨基酸的信号肽，如SignalP预测软件。LstiCBP编码蛋白计算出的分子量和等电点分别为84.7 kDa的和4.14。LstiCBP的亲水性，这是类似的其他昆虫CBPs，计算并绘制序列中的每个残基位置，其中显示，8个残基区域均疏水。该LstiCBP蛋白进行蛋白分析，以确定它的糖基化是否类似于IIM，并且NetNGlyc1.0分析表明LstiCBP只有三个N-糖基化。使用在线序列分析确定了该蛋白的胰蛋白酶和靡蛋白酶切割位点，其中胰蛋白酶裂解位点和糜蛋白酶切割位点分别在LstiCBP的55和128个氨基酸处。 图1.该核苷酸序列为L. sticalitis CBP的cDNA序列和其推导的氨基酸序列。 说明：信号肽区域（灰色背景），半胱氨酸区域（红底）CBD1-8（下划线），起 始密码子和终止密码子（框中）。潜在的多聚腺苷酸化信号序列（双线）。几丁质结合结构域从N-下划线至该蛋白质的C-末端蛋白质是PM的主要组成部分，以及这些蛋白质结合的几丁质纤维已被认为是在PM的形成是很重要。在这项研究中，我们发现了一种新PM几丁质结合蛋白CBP，这种蛋白质是从草地螟的非归一化的肠cDNA表达文库发现的，这是在与先前的观察一致，该蛋白与大多数PM蛋白质都是几丁质结合蛋白。与IIM不同，IIM是公认为的PM蛋白质中的最重要蛋白，LstiCBP是未糖基化的。在鳞翅目幼虫，胰蛋白酶和糜蛋白酶都是肠的主要消化酶。出人意料的是，LstiCBP潜在胰蛋白酶和糜蛋白酶切割位点较多，但该蛋白质对胰蛋白酶的降解具有很高的耐性。LstiCBP序列的胰蛋白酶和糜蛋白酶切割位点的分析表明，大部分切割位点在几丁质结合结构域。这个观察结果与早期报告显示一致，大多数的胰蛋白酶和糜蛋白酶切割位点是受到保护的，防止肠消化蛋白酶与被掩埋在几丁质结合结构域的切割位点结合，这是非常重要的，因为PM蛋白质在富含蛋白酶环境中是发挥一定作用的。 2.2LstiCBP的特征几丁质结合域LstiCBP与已知的昆虫CBPs，如TniCBP1，TniCBP2，SexiCBP和SlitCBP的氨基酸序列比对示于图2。经鉴定LstiCBP类似于大多数已经鉴定PM蛋白，并且其特征在于，其包含多个几丁质结合结构域，半胱氨酸残基的保守序列以及由多个芳香族氨基酸残基2，8个富含半胱氨酸的区域中每一个具有6个空间以上保守的半胱氨酸残基形成一个推定的CBD（图3）的区域。LstiCBP的CBD有一个保守的序列基序，CX14-15CX5CX9CX12CX7C，它类似于预测几丁质结合的T.ni等PM蛋白质CBPs的序列和属于peritrophin-A结构域家族2。图2：LstiCBP:与已知的昆虫的氨基酸相似比对。夜蛾CBP1：AAR06265.1;夜蛾CBP2：AAR06266.1;甜菜夜蛾CBP：ABW98673.1;斜纹夜蛾CBP：ADV03161.1。 早期的研究表明，大多数PM蛋白质具有大量几丁质结合结构域，其允许它们的部分降解蛋白片段保留着多个几丁质结合结构域，从而使它们与PM中的几丁质纤维交联形成6个半胱氨酸基序起作用，属于peritrophin-A结构域家族（图3）。像CBP1和蛋白酶丰富的环境。在这项研究中，LstiCBP被发现有8个保守串联，CBP2 of T. ni，存在的8个几丁质结合结构域在蛋白部分降解时蛋白片段可保留多个几丁质结合结构域，从而在PM的形成中保持它们的功能。另一方面，据观察（1）在CBP中的胰蛋白酶和糜蛋白酶切割位点大多分布在几丁质结合结构域之内，（2）所述的蛋白质含有众多的几丁质结合结构域，表明了一种机制，这些非粘蛋白的PM蛋白质适应了蛋白酶丰富的肠道环境并且发挥功能。 图3.草地螟LstiCBP蛋白质的几丁质结合域（CBDs）的定位。保守氨基酸是深色部分。底部显示的是共有序列。 2.3 重组LstiCBP在大肠杆菌的表达和几丁质结合分析使用引物CBP-MFP和CBP-MRP（表1）扩增LstiCBP ORF并插入到PET30质粒。重组DNA质粒转化到大肠杆菌BL21菌株，并诱导其表达。然后将细胞冷冻，解冻并通过超声破碎处理。该细胞裂解物在SDS-PAGE凝胶上进行电泳，并从诱导细胞的裂解物显示出强烈的预期的表达条带（约105 KD）（图4），这意味着该重组LstiCBP成功表达。为确认该表达产物是否是预期的重组蛋白质，使用抗6His抗体进行Western印迹。诱导转化的重组质粒也产生一个105kD的条带（图4）。 多数几丁质结合蛋白包含一个或多个peritrophin结构域，其被认为是该蛋白可以结合几丁质的重要标志。在这项研究中，LstiCBP被成功地在大肠杆菌中表达，并且该重组蛋白表现出明显的几丁质结合活性。和几丁质结合的LstiCBP只能通过竞争性几丁质结合试剂Calcofluor（Sigma公司，圣路易斯，密苏里州，美国）或由变性试剂尿素被释放（6M）。所述LstiCBP/几丁质结合物用PBS，0.5M氯化钠，2SDS，20mM的乙酸或0.1M的碳酸钠缓冲液（pH10.5）处理，没有检测到从几丁质解离的LstiCBP（图5）。体外几丁质结合分析表明，重组LstiCBP强烈结合到几丁质，而只有一个强变性试剂可以从几丁质中释放重组蛋白（图5）。因此，我们的结论是LstiCBP是第3类PM蛋白质。阴性对照没有显示出几丁质结合活性（结果未显示）。 图4：SDS-PAGE和Western blot分析重组LstiCBP的表达。MW,分子量标记; 1.1.0 mmol / L的IPTG诱导大肠杆菌PET / LstiCBP；2，2.0 mmol / L的IPTG诱导大肠杆菌PET / LstiCBP; 3. IPTG未诱导大肠杆菌PET / LstiCBP; 4.免疫印迹。 图5：分析重组LstiCBP的几丁质结合活性。用1荧光增白剂，2荧光增白剂，PBS，6M尿素，0.5M氯化钠，20mM的乙酸，2SDS，碳酸钠缓冲液分别处理LstiCBP。 2.4 LstiCBP的表达谱和定位首先，LstiCBP的表达使用定量PCR进行了研究。在这项研究中使用五龄第3天幼虫的中肠，头部，血淋巴，蜕皮，粪粒，脂肪体和珠被。所需产物在很大程度上是由从中肠提取的总RNA为模板反转录扩增的cDNA，只有的少数产物从其它组织来源，这表明LstiCBP在中肠中特异性表达（图6）。然后，LstiCBP通过Western blot检测使用LstiCBP的特异性抗体。其结果是与来自反转录PCR的结果一致：预期的条带，肠和PM表达是最强烈的，并且在粪便颗粒检测较弱的条带。发现在蜕皮，脂肪体，血淋巴或外皮没有阳性条带（图7），这表明该LstiCBP蛋白质在中肠合成，并转移到PM，它是参与PM结构的维持。因此LstiCBP是PM蛋白质。图6：qPCR分析草地螟幼虫不同组织LstiCBP的表达。肠，血淋巴，蜕皮，粪粒，脂肪体和表皮的特异性引物扩增cDNA。 图7：鉴定从草地螟幼虫中肠提取的LstiCBP蛋白，用特异性的LstiCBP抗体进行Western blot分析。蛋白质来自肠，PM，血淋巴，蜕皮，粪粒，脂肪体和表皮。3. 实验部分 3.1：昆虫的幼虫草地螟幼虫是2009年从中国，内蒙古的张家口（11349E，4228N）的野外收集。幼虫保持在221和70-80RH和下一个的L:D16：8光周期，直到化蛹和成虫羽化。成虫每日提供5的葡萄糖溶液（重量/体积）为补充食物，幼虫饲养在500毫升烧杯中，并每天用新鲜的藜的供给，直到它们停止喂养。以用于分析的身体部位从5龄幼虫中分离并储存在-70直到使用。 3.2 LstiCBP的克隆和测序 对草地螟中肠围食膜的cDNA表达文库，根据王，国等人的描述方法收集PM蛋白的抗体进行免疫筛选。cDNA的阳性克隆用双脱氧核苷酸链终止法测序（Takara中国大连有限公司），并将282克隆序列在BLAST上与GenBank分析。克隆49-52的序列是相似的已知的CBP基因的一部分，但缺乏5端。然后，感兴趣的克隆的完整的cDNA序列通过使用根据制造商的方案5-全RACE Kit核心集版本2.0（ TAKARA公司）5RACE法获得。5端基因特异性引物，从LstiCBP的部分编码序列设计。引物的序列示于表1。 3.3 LstiCBP的表达模式 五龄幼虫的中肠，淋巴血，蜕皮，粪粒，脂肪组织和珠被收集后，立即在液氮中冷冻，然后储存在-80中直至使用。从不同组织中分离总RNA使用一式三份Trizol试剂（Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国）处理以除去残留的基因组DNA。RNA的质量和浓度通过测定A260 / A280比值估计，并且用DEPC处理过的水将样品稀释到（0.1微克/微升）。用于RT-PCR合成cDNA用的第一链cDNA合成试剂盒（TaKaRa公司，大连，中国）。Taqman的引物和探针是使用引物表达3.0（应用Biosytems，格兰德岛，NY，USA）设计的，序列在表2中。所述的Taqman探针在其5端用FAM报告染料标记，并在它们的3与淬灭染料TAMRA结合。18S rRNA基因用作内源性对照正常化的可变靶基因的结果，并以校正样品到样品的变化 实时定量PCR用ABI Prism 7500 Fast Detection System进行。20微升反应体系在下列条件下扩增：变性在95下10秒，随后通过在95下5秒40个循环，60 34s。比较相对定量使用2-CT方法进行。所有数据均从相同的组织样本的内源性18S rRNA水平为标准化，并且在不同的组织的相对倍数变化使用蜕皮的转录水平计算校准。因此，在不同的组织中的相对倍数变化评估通过在组织中的蜕皮的CBP表达水平比较。 3.4 重组LstiCBP在大肠杆菌的表达和几丁质结合分析构建PET30-LstiCBP，LstiCBP的ORF PCR扩增的引物：CBP-MFP(5-CGGGATCCAAATCTGGGGATAGTGGTATAAAC-3)和CBP-MRP（5-GGAATTC AAACCCATCGCATAAAAGTG-3）（括号里序列分别表示的BamH I和EcoR I的限制性酶切位点）将PCR产物插入PET30的的BamH I和EcoR I位点，并转化到大肠杆菌BL21菌株。3小时预培养后，重组LstiCBP通过添加异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）以2.0mM为终浓度诱导4小时。将细胞培养液（1升）通过离心收获，并将沉淀在磷酸盐缓冲液（PBS，0.04M的，pH7.0）中匀浆。在412,000g下离心20分钟，用枪头吸干上清液，并储存在-70直至使用。的SDS-PAGE之前，将细胞解冻，并在PBS中通过超声处理破碎（5秒，5次，4）。在细胞裂解之前用IPTG诱导，然后破碎细胞获得细胞裂解物，用SDS-PAGE样品缓冲液，煮沸10分钟，在12000g下离心10分钟并将上清液装载到8SDS-PAGE凝胶。Western blot 按照Wei等人的描述的方法进行。将SDS-PAGE后的蛋白质转膜到PVDF膜上（Hybond-P，Amersham公司，中国郑州），并且将膜在37下与抗体一起在6His溶液温育2小时。膜在用PBST（PBS-吐温，Sigma-Aldrich公司，上海，中国）洗涤后与二抗（HRP-偶联的山羊抗兔IgG，稀释2000倍）一起在37下温育2h后用PBST充分洗涤。抗体结合检测使用DAB stock 染色试剂盒（华美生物技术有限公司，洛阳，中国）。使用由Wang等人所描述的几丁质结合测定方法，对LstiCBP的几丁质结合活性进行分析。首先，为几丁质结合测定通过莫拉诺等人的方法从脱乙酰几丁质（Sigma公司，圣路易斯，MO，美国）制备新的几丁质。一克脱乙酰壳几丁质在研钵中研磨，同时缓慢加入20毫升的10乙酸，并在室温下静置过夜。第二天，90毫升甲醇缓慢加入并混合和混浊的溶液过滤。将滤液置于在一个烧杯中，烧杯放在磁力搅拌器上并加入1.5毫升乙酸酐后约1分钟，该混合物变成凝胶。将凝胶静置约30分钟，然后用抹刀将其切成小片。用甲醇覆盖后的悬浮液以最大速度匀浆1分钟。细分散的几丁质用介质孔隙率烧结玻璃漏斗过滤并用水洗涤至中性。几丁质再悬浮0.02叠氮化钠至浓度约15毫克/毫升。然后，将重组LstiCBP分离1毫升LstiCBP含细胞培养基孵育以再生几丁质为40mg（湿重），以允许LstiCBP蛋白结合几丁质在41下在悬浮液中1小时，在蛋白酶的存在下抑制剂混合物（0.5毫克/毫升亮肽素，1毫克/毫升胃蛋白酶抑制素，1mM EDTA和1mM苯甲基磺酰氟）。再生几丁质结合到LstiCBP后用PBS彻底洗涤随后离心。将所得的几丁质-LstiCBP络合物等分不同增溶的条件下培养，PBS，2SDS，6M尿素，1Calcofluor，2Calcofluor，0.5M氯化钠，0.1M碳酸氢钠，碳酸钠缓冲液（pH10.5）或20毫乙酸。在室温下温育15分钟后，通过离心收集，并通过SDS-PAGE来分析几丁质上解离在上清的LstiCBP蛋白。IPTG诱导的大肠杆菌BL21菌株PET30作为上述处理的阴性对照蛋白。 3.5 LstiCBP抗体的制备 LstiCBP特异性抗体从对草地螟中肠PM蛋白质集合的抗血清准备。重组LstiCBP蛋白被固定在一块硝化纤维素膜上(Optitran BA-S85, Schleicher & Schuell, Keene, NH, USA) ，该重组蛋白质膜在室温下温育1小时，接着用磷酸盐缓冲盐水