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通过饮奶进行乳糖不耐受人群的筛查及干预对策的研究 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 2008 9 云战友 目录 研究背景研究目的研究内容我国乳糖不耐受人群的调查高水解率低乳糖牛奶的开发高水解率低乳糖牛奶对乳糖不耐受的干预试验该项研究得到的支持和相关评价 研究背景 很多人由于小肠上皮细胞乳糖酶缺乏 饮用牛奶后乳糖不能被分解吸收 乳糖进入结肠后被肠道细菌分解 产生大量乳酸 甲酸等短链脂肪酸和氢气 造成渗透压升高 使肠腔中的水分增多 引起腹胀 肠鸣 肠绞痛直至发生腹泻等症状 这种现象在医学上称为乳糖不耐受症 除表现为乳糖不耐症者外 还存在乳糖代谢不良但不表现为症状的人群 本研究中称之为乳糖吸收不良者 乳糖不耐受症与乳糖吸收不良 不表现为症状但乳糖代谢不良 合称为乳糖酶缺乏 研究背景 乳糖酶缺乏在欧洲北部后代中占15 黑人及拉丁人群占80 而美国印第安人和亚洲人可高达100 SwagertyDLJr WallingAD KleinRM Lactoseintolerance J AmFamPhysician 2002 65 9 1855 1856 6 10岁亚洲儿童的乳糖不耐受85 100 QuakSH LactoseintoleranceinAsianchildren JPaediatrChildHealth1994 30 91 2 杨月欣教授研究了中国儿童乳糖不耐受症的发生率 结果表明3 5岁 7 8岁 11 13岁组儿童中 乳糖不耐受发生率分别为12 2 32 2 和29 0 乳糖酶缺乏发生率分别为38 5 87 6 87 8 卫生研究 Vol 28 No 1 1999 肖玉桦等人的调查结果表明我国健康成人的乳糖酶缺乏率高达92 现代预防医学 Vol 26 No 1 1999 有如此高的比例吗 研究背景 分别给成人受试者50 25 12 5g乳糖 乳糖酶缺乏率分别为100 86 4 59 1 新医学 1988 Vol 19 512 分别给成人受试者25 12 5 6 25g乳糖 乳糖酶缺乏率分别为85 48 9 2 中国药学杂志 1998 Vol 33 No 5分别给受试者 7 18岁 25 12 5 6 25g乳糖 乳糖酶缺乏率分别为79 3 19 7 7 2 中国学校卫生 2002 Vol 23 No 2乳糖酶缺乏率 不耐受症状发生率受乳糖摄入量的影响 研究目的 有必要根据年龄 设计每次摄入牛奶的适宜量 通过饮用适宜量的牛奶 筛查得到乳糖酶缺乏数据和乳糖不耐受数据 这一数据对于生活习惯和健康的关系最大 在此基础上 研究如何满足乳糖酶缺乏和乳糖不耐受消费者饮用牛奶的需要 研究内容 我国乳糖不耐受人群的调查高水解率低乳糖牛奶的开发高水解率低乳糖牛奶对乳糖不耐受的干预试验 我国乳糖不耐受人群的调查 伊利集团联合中科院生物物理所中生金域诊断技术有限公司 哈尔滨医科大学 西安交通大学医学院少儿卫生教研室 中国优生科学协会钙工程专业委员会对北京 哈尔滨 西安三大城市3 70岁的人群通过饮奶 进行乳糖不耐受调查 我国乳糖不耐受人群的调查 试验方法 测试前两天至测试结束前 受试者禁止饮奶及奶制品 测试前一天至测试结束前 受试者禁食大量水果 一天250克以上 测试当天早晨 要求受试者不进食 不饮水 空腹到测试现场参加测试 将1490名志愿者按年龄段分为6组 每组饮用不同数量的纯牛奶 乳糖含量为4 8 受试者一次饮完液态纯牛奶 同时吃完现场配送的面包 饮奶后至测试结束前 不得再饮水 进食 饮奶后1小时排空尿液 饮奶后2小时收集尿液 然后用中生金域诊断技术有限公司的尿半乳糖试剂盒测定被调查人群的乳糖耐受情况 我国乳糖不耐受人群的调查 分组情况和饮奶量3 4岁125ml5 6岁250ml7 9岁300ml10 12岁350ml13 17岁400ml 18岁450ml 我国乳糖不耐受人群的调查 乳糖耐受能力的评价标准测定结果饮奶后的症状乳糖耐受能力阴性无消化道症状乳糖耐受阳性无消化道症状乳糖吸收不良阳性有腹痛 腹部不适 恶心 腹胀 腹泻一项乳糖不耐受症阳性 乳糖吸收不良 乳糖不耐受症 统称为乳糖酶缺乏 我国乳糖不耐受人群的调查 不同年龄组牛奶乳糖不耐受的检出情况 我国乳糖不耐受人群的调查 经常饮奶诱导不了乳糖酶活性 症状可弱化 卫生研究 Vol 28 No 1 1999 乳糖酶为非诱导酶 NewcomerAD McGillDB Gastroenterology 1967 53 6 881 889 乳糖酶缺乏受遗传影响 乳糖酶基因位于2号染色体长臂 2q21 酶蛋白先是由小肠上皮细胞合成一个220KD的前体物 然后再继续加工剪切成180KD的成熟酶蛋白 多数研究认为 断奶后乳糖酶活性的下降不依赖于膳食中乳糖的存在 多项研究均证明乳糖的摄入并不能维持或增强乳糖酶的活性 因此进食乳糖并不能抑制基因决定的乳糖酶的表达 芬兰儿童对牛奶过敏与其基因型为C C 13910相关 其成人型乳糖酶活性低下也与该基因型相关 有研究表明我国北方5个少数民族的乳糖不耐受和该基因在该处的变异关系不大 还有一种乳糖不耐受也可由腹泻导致 但一般可以在腹泻症治愈后恢复 研究内容 我国乳糖不耐受人群的调查高水解率低乳糖牛奶的开发高水解率低乳糖牛奶对乳糖不耐受的干预试验 高水解率低乳糖牛奶的开发 乳糖酶的选择乳糖水解率快速方法的开发低乳糖牛奶生产工艺的确定低乳糖牛奶在货架期内的褐变情况 乳糖酶的选择 目前仅来源于微生物的 半乳糖苷酶有工业应用价值 不同微生物来源的 半乳糖苷酶的性质有所不同 考虑安全性 经济性以及适应性 最终选择来源于乳酸克鲁维酵母产生的 半乳糖苷酶 乳糖酶的选择 随着反应温度的升高 乳糖酶催化乳糖的水解率增加 当达到一定温度时 温度再升高 乳糖酶催化乳糖的水解率就开始降低 从图中可以得到 该酶的最适反应温度为39 41 乳糖酶最适反应温度的确定 乳糖酶的选择 pH值低于6 5时 酶活力随着pH值的下降迅速降低 pH值在6 5 7 0时活性达到最大值 该酶的最适反应pH值为6 5 7 0 该酶最适pH值恰好在鲜乳的天然pH值之间 因此适合鲜奶的水解 乳糖酶最适反应pH值的确定 冰点法 低乳糖牛奶产品的水解率是衡量其乳糖水解程度的一项重要的生产指标 用HPLC法测定乳糖需要昂贵的仪器 不便于工厂使用 为了探寻一种适合于低乳糖牛奶生产中检测分析需要的简便快捷的新方法 开发了冰点法 利用冰点降低幅度可以测定牛奶乳糖水解率 得出较准确的冰点公式为X 0 5601 0 2907方法特点 节省检测时间 节约检测成本 HLPC每测定一个样子 费用在200元 而冰点仪每开一次机进行校正的费用仅为12元 可以测定几十个样品 乳糖水解率快速方法的开发 乳糖水解率快速方法的开发 葡萄糖氧化酶 分光光度法 牛奶中1分子的乳糖水解成1分子的葡萄糖和1分子的半乳糖 通过测定葡萄糖的量就可以得到已水解的乳糖量 测定原理如下 D葡萄糖 O2 H2OD 葡萄糖酸 H2O2H2O2 4 AAP 苯酚红色醌化物 H2O1ml乳糖水解牛奶稀释到10ml 取20 L到葡萄糖酶试剂与苯酚试剂等体积混合液 加好试剂后置37 恒温水浴反应20min 在505nm波长处测定吸光度值并计算葡萄糖浓度 乳糖水解率快速方法的开发 将低乳糖牛奶分两份 一份直接测葡萄糖 另一份加入10000NLU L的乳糖酶置于39 的环境中反应2小时充分水解牛奶重残余乳糖 然后测定葡萄糖的浓度 乳糖水解率的计算公式乳糖水解率 100 葡萄糖氧化酶 分光光度法 乳糖水解率快速方法的开发 葡萄糖氧化酶法准确度试验 乳糖水解率快速方法的开发 葡萄糖氧化酶法精密度试验 低乳糖牛奶生产工艺的确定 流程1 原料奶杀菌冷却到最适温度加酶搅拌水解UHT冷却包装 低乳糖牛奶生产工艺的确定 随着反应时间的延长 添加不同浓度乳糖酶的牛奶的水解率在增加 当水解率超过80 以上 乳糖的水解率趋于平缓 乳糖水解率达到70 就可以解决乳糖不耐受的症状 综合考虑 在最适反应温度下水解牛奶中乳糖的最佳工艺条件是酶的添加量为1500NLU L 水解时间2小时 最适温度 39 下乳糖水解率随时间的变化 低乳糖牛奶生产工艺的确定 流程2 原料奶巴氏杀菌 85 15S 冷却到 4 加酶搅拌水解UHT冷却包装 低乳糖牛奶生产工艺的确定 经过12小时 添加2000NLU L乳糖酶的巴氏杀菌牛奶的水解率达到70 以上 在低温下水解牛奶中的乳糖的最佳工艺条件为添加2000NLU L的乳糖酶放置一个班次的时间 低温下乳糖水解率随时间的变化 低乳糖牛奶生产工艺的确定 流程3 原料乳杀菌 UHT 冷却到15 灌装包装水解无菌添加乳糖酶 无菌乳糖酶的制备 采用膜过滤技术进行原料除菌 使产品在无菌添加时不会受到二次污染 采用膜过滤可以使酶活力损失降低至最小 最大限度地保持酶制剂活力 同时能保证乳糖酶的颜色呈现透明色 首先将乳糖酶通过无菌膜除去杂质和微生物 加工成无菌包装的乳糖酶 然后通过无菌在线添加设备将无菌袋包装的乳糖酶直接添加到无菌罐或者无菌灌装机中 低乳糖牛奶生产工艺的确定 在线无菌添加的实现无菌添加工艺采用高温高压蒸汽作为产品的保护屏障 在无菌酶制剂添加到产品的过程中始终保持一个双向无菌的环境状态 从而保证产品 酶制剂的无菌性 防止产品免受二次污染 在整个无菌酶制剂的添加过程中 产品和酶制剂的温度保持在20 25 的温度下 低乳糖牛奶生产工艺的确定 低乳糖牛奶生产工艺的确定 添加250 500 750NLU L的乳糖酶 经一周后乳糖水解率均达到90 以上 一般UHT奶经一周检验合格后才投放市场 当产品到达消费者手中时 乳糖可以完全水解 无菌添加的最佳工艺为添加250NLU L 贮存一周 无菌添加乳糖水解率随时间的变化 低乳糖牛奶生产工艺的确定 三种工艺的比较分别对三种工艺流程进行试验 发现使用流程1时 乳糖水解率达到70 时所需的时间短 但牛奶容易遭受微生物的污染 而且水解出的牛奶经过超高温灭菌后 有明显的褐变 流程2虽然可以减少微生物的污染 但所需的酶的用量大 水解出的牛奶经过超高温灭菌后 也容易褐变 流程3是在牛奶超高温灭菌后罐装的同时加入乳糖酶 该工艺不会引起低乳糖牛奶的微生物污染和褐变 并且所需酶的用量少 可生产出乳糖水解率 90 的低乳糖牛奶 能降低低乳糖牛奶的生产成本 最终选择工艺流程3来生产高水解率的低乳糖牛奶 低乳糖牛奶生产工艺的确定 工艺流程3优点普通工艺添加乳糖酶不仅需要大量添加乳糖酶 同时还需要很长的工艺时间来水解乳糖 耗时耗电 水解的产品经加工后容易发生褐变 缩短产品货架期 利用无菌在线添加技术极大地降低了乳糖酶的使用成本 同时防止产品在货架期内发生褐变 延长了产品的货架期 货架期可以达到7个月 用此工艺巧妙地利用了待检时间完成水解 使工艺操作中省去了水解时间 对于90 的乳糖水解率 酶用量减少为原来的四分之一 极大地提高了工厂的利用率 降低了生产成本和管理费用 低乳糖牛奶在货架期内的褐变情况 牛奶中含有丰富的蛋白质和还原糖 在热处理过程中易发生美拉德反应 美拉德反应是氨基化合物 胺 氨基酸 肽和蛋白质 和羰基化合物 糖类 自然发生的反应 也称之为非酶褐变 在牛奶中主要是还原糖的羰基和乳蛋白质中赖氨酸的 氨基结合 发生美拉德反应 并最终生成褐色物质 低乳糖牛奶的生产过程中 乳糖被分解成为葡萄糖和半乳糖 由于褐变反应速度与糖的种类有关 六碳糖比双糖更容易发生反应 再加上低乳糖牛奶中还原糖数量的增加 所以低乳糖牛奶比普通牛奶更容易发生褐变 本实验以初级美拉德反应中3 脱氧葡糖醛酮的降解产物HMF 羟甲基呋喃 作为褐变标志物 测定无菌添加乳糖酶的低乳糖牛奶在室温贮存期内的褐变情况 UHT奶在25 经5个月的贮存HMF几乎没有增加 无菌添加乳糖酶的UHT乳在同样条件下贮存 虽然HMF从43 16 mol L增加到73 09 mol L 但用肉眼观察不出它的颜色变化 经过7个月的贮存在颜色上仍与UHT乳无差别 而先水解后超高温灭菌的低乳糖牛奶 水解率 70 在生产出来时HMF就达到了120 26 mol L 用肉眼已经观察到它的颜色发生变化 所以选择无菌后添加乳糖酶的工艺生产低乳糖牛奶可解决褐变问题 并延长货价期 低乳糖牛奶在货架期内的褐变情况 低乳糖牛奶在货架期内的褐变情况 贮存一个月颜色的变化 贮存七个月颜色的变化 研究内容 我国乳糖不耐受人群的调查高水解率低乳糖牛奶的开发高水解率低乳糖牛奶对乳糖不耐受的干预试验 乳糖不耐受的干预试验 伊利集团联合北京中生金域诊断技术有限公司 哈尔滨医科大学 西安交通大学医学院少儿卫生教研室 中国优生科学协会钙工程专业委员会进行了乳糖不耐受的干预试验 乳糖不耐受的干预试验 经乳糖耐受试验筛查出的乳糖吸收不良者和乳糖不耐受者作干预试验 受试者饮用低乳糖牛奶 试验方法 不同年龄组饮奶量同耐受试验 试验方法 乳糖不耐受的干预试验 干预效果评价标准显效 消化道症状消失 尿半乳糖试验转为正常 有效 消化道症状减轻 尿半乳糖试验转为正常或单项尿半乳糖试验转为正常 乳糖不耐受的干预试验 本次研究采用内蒙古伊利实业集团股份有限公司研制的高水解率低乳糖牛奶 乳糖水解率 90 对468例乳糖吸收不良和152例乳糖不耐受症者进行干预 乳糖不耐受的干预试验 表2低乳糖牛奶对乳糖不耐受的改善结果 表3低乳糖牛奶对乳糖不耐受临床症状的改善效果 研究发现和创新 本项目在国内第一次通过给受试者根据年龄确定饮奶量 在北方3大城市进行了2000多例乳糖不耐受筛查试验 得到了50 6 的国人乳糖酶缺乏的结果 本项目开发了乳糖水解率大于90 的UHT低乳糖液态奶 营养舒化奶系列产品 产品技术特点 1 该产品水解率大于90 国内首创 2 解决了低乳糖牛奶生产过程容易发生褐变的问题 国内首创 3 第一次在乳品行业采用无菌添加酶工艺 国内首创 4 采用UHT技术 保质期7个月 国内首创 5 酶解过程无污染 用酶省 工艺技术经济性好 6 该项目已顺利的完成大规模 流水线的产业化生产 7 舒化奶配方中合理的添加膳食纤维和胶原蛋白 更贴近中国人膳食营养需求 本项目在国内第一次采用高水解率低乳糖牛奶 营养舒化奶 在多个城市进行了乳糖吸收不良人群饮用低乳糖牛奶的干预试验 结果表明 本项目开发的产品营养舒化奶改善乳糖吸收不良的有效率为96 6 对乳糖不耐受症改善的有效率和显效率分别为96 和90 1 本项目研究过程中还开发了2种乳糖水解率快速检测方法 相关资料 产品相关标准的编写 该项研究完成后 伊利集团申请了低乳糖奶国家标准的立项 并且已经纳入国标委2007年第四批国家标准制修订计划 伊利集团作为起草单位 承担了该项目 项目编号为 20071103 T 469 创新型企业 2007年申报材料 第二轮申报 国家标准化管理委会批准的第四批标准 xls 专利和文章 申请的专利 发表的文章 1卜建斌 云战友 邢黎明 半乳糖苷酶的应用及固定化 J 农产品加工 学刊 2006 2 4 6 2卜建斌 云战友 低乳糖牛奶生产工艺研究 C 中国奶业协会年会论文集 2007 148 150 3JianbinBu ZhanyouYun CuizhiLi CaiyunWang Applicationofimmobilized galactosidaseinapacked bedreactorsystem C 27thIDFWorldDairyCongress 2006 经济效益 产品一经推出就受到业界的一致好评和消费者的认可 产品目前处于产销两旺 到2007年底已