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分子生物学大题一、基因与基因组1.鉴别蛋白质编码基因的五项标准:(1).开放阅读框（open reading frame, ORF）:是始于起始密码子并终于终止密码子的一串密码子。;(2). 序列特征密码子偏爱和剪接点;(3). 序列保守性;(4). 转录产物:寻找基因的表达产物RNA或蛋白质.;(5). 基因失活。2.真核生物基因组特点:（一）分子量很大的DNA与蛋白质形成染色体存在于核内。（二）转录与翻译不同步，转录产物为单顺反子，功能相关基因分散排布，无操纵子结构。（三） 基因组存在高比例的非编码序列 (non coding sequence, NCS), NCS可作进化标尺。（四） 大量重复序列（repeat sequence）存在。（五） 基因多为不连续的，被插入序列（IS）所分隔(这种现象称为断裂基因（split gene）. 断裂基因由内含子（intron）（非编码序列）和外显子（exon）（编码序列）交替组成。（六 ）功能相关基因构成各种基因家族3.重复顺序的功能：1）编码某些重要的功能性蛋白、rRNA、tRNA等; 2）与染色体构象、着丝粒形成有关; 3）参与基因的表达调控. 分类：1）倒位（转）重复顺序：指两互补顺序呈反向排列，形成回文结构或发夹状结构；2）串连重复顺序：由相同的核心顺序（270bp）成串（头尾相接）排列而成的高度重复顺序。3）散在重复顺序。4.人类基因定位的基本方法:(1).家系分析法发现感兴趣的基因。通过分析统计家系中有关遗传性状的连锁情况和重组率而进行基因定位的方法。;(2).体细胞杂交初步的基因定位;(3). 核酸杂交技术精确的基因定位。克隆基因定位法；原位杂交法；原位PCR；定位克隆技术。5.基因论：1)相引是两个基因位于同一染色体上，相斥则反之；2)同源染色体在减数分裂时发生交换；3)位置相近的因子相互连锁。6.HGP的主要成果四张图：1）遗传图:第一代遗传标记是RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制性酶切片段多态性）;第二代遗传标记是STR（short tandem repeat，简短串连重复序列 ），6000个标记;第三代遗传标记是SNP（restriction fragment length polymorphism，单核苷酸多态性），不再是分析长度，而是直接测序2）物理图:以一段已知序列的DNA片段（STS，sequence tagged site，序列标记位点）并有染色体定位为路标，以Mb或Kb为图距的基因组图。3）转录图又称表达序列图或cDNA图的路标:是以部分5 端或3端cDNA序列（即表达序列标签，EST）为路标，根据表达顺序的位置和距离作图4）序列图：测定总长约30亿个核苷酸组成的全染色体序列。7.五大模式生物：E.coli、酿酒酵母、黑腹果蝇、秀丽线虫和小鼠，其序列分析被列为HGP的内容；8.DNA多态性及其意义：DNA多态性:除同卵双生的两个体外，没有两个人的DNA组成是完全相同的，即人类DNA组成具有多态性。如果比较随机的十个人的常染色体的非编码区,就会发现约200400bp就有一个核苷酸不同,这些可变区域即称为DNA多态性 (DNA polymorphism)位点。 DNA多态性标记的价值：1）为路标，构建DNA标记的遗传连锁图谱;2）使遗传图谱从直接可见的表型多样性标记进步到DNA分子本身多态性标记。 DNA多态性的种类：1）DNA位点的多态性；2）串连重复顺序多态性；3）单核苷酸多态性二、细胞凋亡1. 细胞凋亡与细胞坏死的区别:项目 细胞凋亡 细胞坏死诱导因素 生理性、弱刺激性 强烈刺激细胞数量 单个细胞丢失 成群细胞死亡膜完整性 保持至晚 早期即丧失染色质 凝聚呈半月状 稀疏呈网状细胞核 早期固缩、断裂 晚期破碎细胞器 无明显变化 肿胀、破坏胞内容物 无释放 释放细胞形状 形成凋亡小体 破裂成碎片基因组DNA 受调控降解 随机降解大分子合成 一般需要 不需要基因调控 有 无后果 不引起炎症反应 引起炎症反应意义 生理性死亡 病理性死亡2.细胞凋亡的生物学意义：1）具有清除个体发育过程及成熟个体中多余细胞及老化细胞的机体调节作用；2）具有消除对机体有害的癌变细胞及病毒感染细胞的机体防御作用。细胞凋亡是维持个体生存所必需的一种生物学机制。3.Caspase的性质和种类：Caspase即天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶。1）已在哺乳类中发现14种，分为3个亚类： Caspase-1亚家族，Caspase-2亚家族，Caspase-3亚家族；2）根据前体分子(procaspase)N端的原结构域(prodomain)分为2类:启始分子(initiator), 如-8、-9、-10等，为蛋白酶级联反应的启始者，其活化后再切割和活化下游Caspase；效应分子(effector),如-3、-6、-7等，作为上游酶的底物被切割活化，再作用于多种蛋白质或酶，促使细胞凋亡。4.效应caspase引起细胞凋亡的机制：1）灭活细胞内凋亡抑制蛋白：非凋亡细胞中, CDA (caspase活化的DNAase)与其抑制蛋白(ICDA)结合;凋亡细胞中, caspase剪切ICDA; CDA游离并进入核内降解DNA,细胞凋亡.2）剪切细胞结构蛋白：如Caspase对核板的降解作用; 在凋亡过程中, caspase在单一位点剪切核纤层蛋白(lamin), 导致核板塌陷, 染色质浓缩.3）剪切效应蛋白: 如参与基因表达蛋白因子,如PARP；4）活化caspase抑制剂。5.细胞凋亡的信号传递通路的特点:(1).同一性：各种因素引起的凋亡的形态与生化改变均相同。(2).多样性：环境因素不同，细胞类型不同，或刺激因素不同时，从凋亡程序启动到凋亡发生，其信号传递途径是不同的。(3).分类：百余种凋亡调控因子，正逐渐被组装成一条条的信息传导通路，可分为基本传导通路和非专一性传导通路二类。6.细胞凋亡的信号传递途径:(1)死亡受体介导的细胞凋亡;(2)线粒体相关蛋白的凋亡诱导途径：线粒体跨膜电位(m)的下降，线粒体膜通透性转运孔（MPT）破坏或开放，开放的后果是， m 下降、氧化磷化脱偶联、GSH耗竭、ROS产生等，并形成恶习性循环。;(3)细胞核凋亡诱导途径;(4)粒酶B介导的细胞凋亡：CrB由CTL分泌进入靶细胞胞浆后,其丝氨酸蛋白酶在胞浆pH7.0条件下发挥最佳活性，切割胞浆和核中的多种底物；Caspase依赖的死亡通路是CrB介导细胞死亡的重要途径之一。7.P53蛋白的调控作用：自N端起包括：转录活化区、DNA结合区、四聚体化区和C-调节区；1）P53的表达与活性调节。正常状态下：胞浆P53水平很低，半衰期很短；胞内P53被严格监控，受HDM2的负反馈调节，并通过泛素降解途径调节P53水平。异常情况下：当细胞DNA损伤、纺锤体丝断裂、癌基因异常表达等细胞生存面临威胁时； P53水平迅速升高和活化；2）P53对细胞凋亡和细胞周期的调节作用：野生型P53蛋白具维持细胞生长、抑制恶性增殖的作用； P53蛋白作为“基因警卫”负责维持基因组的完整性、DNA损伤修复和细胞周期的正常运转；如果损伤不能修复， P53就激活那些诱导凋亡的基因表达，使细胞进入凋亡状态。突变型P53蛋白：丧失抑制细胞恶性增殖功能，p53基因突变是50%以上肿瘤逃逸凋亡的重要原因;并且本身具有癌基因功能。8.Bcl-2家族的功能:(1)属凋亡抑制基因，阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命，但对细胞周期和分化无影响.(2)阻止或减少各种刺激引起的细胞损伤。如Bcl-2能阻止由r射线和多种化疗药导致的细胞凋亡。(3)Bcl-2蛋白具抗氧化作用;(4)Bcl-2蛋白抑制细胞器内Ca2+ 离子向胞质释放，而凋亡必须有Ca2+ 离子参与。9.bcl-2家族成员：1）抑制凋亡：bcl-2，bcl-xL，Mcl-1 。2）促进凋亡：bax，bcl-xs ，bad。10. Bcl-2家族对细胞凋亡的调节机制:(1)Bcl-2、Bax和Bcl-x组成一个凋亡调控系统;(2)当Bax/Bax同源二聚体形成时，便诱导细胞凋亡；(3).随bcl-2表达量增加，渐多的Bax/Bax解聚，形成更稳定的Bax/Bcl-2异源二聚体，从而中和了Bax/Bax诱导凋亡的作用。即Bax和Bcl-2 比值调节凋亡；(4) 当Bcl-xs存在时，优先形成Bcl-xs/Bcl-2 ，使Bax/Bax形式保留，诱导细胞凋亡。11.原位末端标记技术(in situ end lableing, ISEL)：原理: ISEL的原理是基于细胞凋亡时，DNA断裂，利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）或DNA聚合酶将带有生物素标记的核苷酸（biotin-16-dUTP）掺入到断裂的DNA的3端，再使其与带有辣根过氧化物酶的抗生物蛋白结合，经DAB显色后，便可观察到细胞内是否存在DNA片段端存在。主要方法有2种: 1）. TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)； 2）. DNA聚合酶I 或klenow大片段介导的原位的缺口平移(ISNT)。该法特异性和敏感性较高，可检出早期的凋亡细胞.12.与细胞凋亡减少有关的疾病：1）.癌症；2）.自身免疫性疾病，红斑浓疮，免疫介导的肾小管肾炎。3）.病毒感染与细胞凋亡增加有关的疾病：1）.AIDS；2）. 神经退行性病变，帕金森病，老年痴呆；3）再生性障碍贫血；4）.缺血性损伤，心肌梗塞，脑卒中，再灌注损伤；5）.酒精肝13.细胞凋亡自身免疫性疾病：正常情况下：1） 90%以上的淋巴细胞在胸腺内发育都会发生凋亡，那些能识别自身抗原的细胞都应被清除，确保被选择生存下来的淋巴细胞不至于对自身抗原产生免疫应答；2）如果这种选择性清除失败，在靶细胞存在下，淋巴细胞被激活，产生大量的效应细胞攻击靶细胞，导致发生自身免疫性疾病。发病的分子机制：1）淋巴细胞中调节细胞凋亡的一个关键分子是细胞表面受体Fas（又称APO或CD95）， Fas受体与FasL （配体）结合即可激活凋亡信号传导途径，细胞凋亡；2） T细胞表面受体Fas和FasL发生突变时，T细胞不能发生正常凋亡，导致自身免疫性疾病。3）除系统性红斑狼疮外，还证实类风湿性关节炎、自身免疫性糖尿病、牛皮癣均与淋巴细胞凋亡敏感性改变（Fas和FasL突变）有关。14.细胞凋亡病毒性疾病：病毒的溶解性感染所产生的细胞病变变作用与引发细胞凋亡有关；而病毒的持续性感染与病毒抑制细胞凋亡有关。1）病毒感染引发细胞凋亡：牛疱疹病毒、鸡白血病毒和HIV等，均能通过诱导细胞凋亡而引起宿主细胞缺失。如HIV感染后引起CD4+T细胞凋亡而缺失。2）病毒感染抑制细胞凋亡：许多病毒具有抑制细胞凋亡的机制，有利于建立持续感染、延长病毒复制时间、以最大限度产生子代病毒。如EB病毒产生LMP-1，使Bcl-2基因上调；牛痘病毒产生crmA,可抑制由caspase所介导的细胞凋亡。15.细胞凋亡与肿瘤：肿瘤不仅是细胞增殖和分化异常疾病，同时也是细胞凋亡异常疾病。1）大多数肿瘤P53突变、而有些肿瘤过度表达Bcl-2蛋白，这些可有效地以避免细胞凋亡发生。2）P53蛋白作为“基因警卫”负责维持基因组的完整性、DNA损伤修复和细胞周期的正常运转。如果损伤不能修复， P53就激活那些诱导凋亡的基因表达，使细胞进入凋亡状态。3）Bcl-2属凋亡抑制基因，阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命。三、细胞周期调控：1.细胞周期：1）间期：G1期 (合成前期)； S期 (DNA合成期)； G2期 (合成后期)。 2）分裂期：前期；中期；后期；末期。2.细胞周期调控的主要分子机制：细胞周期引擎异二聚体蛋白激酶复合体，包括二个亚单位：1）调节亚单位：细胞周期蛋白，其浓度随细胞周期不断变化，不仅起激活CDK的作用，还决定了CDK何时、何处、将何种底物磷酸化；2）催化亚单位：细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶 (CDK)，单独存在时无活性，与cyclin结合才具有蛋白激酶的活性。参与细胞周期调控的分子：1）异二聚体蛋白激酶复合体；2）生长因子；3）泛素与APC：泛素由76个氨基酸组成，高度保守，普遍存在于真核细胞，故名泛素；泛素相当于蛋白质被摧毁的标签。4）周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKI） 3.细胞周期的运行：1）细胞周期的启动（G0G1）；2)DNA复制（ G0S ）；3）进入M期 (G2-M)； 1）细胞周期的启动：细胞在生长因子的刺激下，Cyclin D表达，与CDK4、CDK6结合而活化激酶下游蛋白质磷酸化促进基因的转录2）DNA复制：CyclinE与CDK2结合-S-CDK触发前复制复合体（pre-RC）启动，同时阻止DNA再次进行复制.3）进入M期 (G2-M)：CyclinA、CyclinB与CDK1结合，形成 M-CDKCDK-Cyclin能够积累CDK1使底物蛋白磷酸化细胞分裂.4.检验点由感受异常事件的感受器、信号传导通路和效应器构成，主要检验点有4个：1) G1/S检验点: 在哺乳动物中称R点(restriction point)，控制细胞由静止状态的G1进入DNA合成期，相关的事件包括：DNA损伤？细胞外环境适宜？细胞体积足够大？2) S期检验点：DNA复制是否完成？3) G2/M检验点：是决定细胞一分为二的控制点，相关的事件包括：DNA损伤？细胞体积足够大？4)中-后期检验点（纺锤体组装检验点）：任何一个着丝点没有正确连接到纺锤体上，都会抑制APC的活性，引起细胞周期中断。四、蛋白质分离纯化1.蛋白质的含量测定方法：1）紫外光谱 (A280)吸收法：色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280 nm附近。大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280 nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。 注意事项：石英比色杯；调零所用溶液；配制标准蛋白所用溶液；光密度范围。 2）Bradford检测法：考马斯亮蓝G-250在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳。蓝色复合物在595 mn波长处具有最大光吸收值，并与溶液中蛋白质浓度成正比，因此可检测595 mn的光吸收值大小计算蛋白的含量。 缺点：对各种纯化蛋白质反应不同；这种测定方法对蛋白质引起不可逆的变性。 注意事项：标准曲线在2.5 ug15 ug BSA浓度范围内保持线性关系；反应1015 min后开始出现沉淀，尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条件下易发生沉淀；若选用目的蛋白来做标准曲线或用另一种方法来校正，所测蛋白浓度较准确。3）Lowry检测法：在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin-酚试剂)，产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色的复合物在745 750 nm处有最大的吸收峰，颜色的深浅(吸收值)与蛋白质浓度成正比，可根据750 nm的光吸收值大小计算蛋白质的含量。 缺点：干扰物质多；反应速度慢；某些试剂不稳定；使蛋白质发生不可逆变性。 注意事项：在加入试剂30 min后呈色达到饱和，时间延长颜色信号减弱；许多干扰物质降低颜色反应；高盐浓度可引起沉淀。4）BCA (二喹啉甲酸)检测法：改进的Lowry测定法，反应简单而且几乎没有干扰物质的影响。 原理：在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与Cu2生成络合物，同时将Cu2还原成Cu。而BCA试剂可敏感特异地与Cu结合，形成稳定的有颜色的复合物，在562 nm处有高的光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量。 注意事项：与Lowry相比，采用BCA法时，如果样品中含有脂类物质将明显提高光吸收值；为促进BCA法的反应进程，可将样品适当加热。2. 经典的细胞蛋白质分离纯化流程由下述主要步骤组成：(1). 清洗组织或细胞;(2). 裂解细胞;(3). 离心除去膜组分等获得可溶性蛋白质;(4). 离心、层析、电泳等进一步纯化;(5). 获取产物蛋白。3. 包涵体的成份：包涵体是表达蛋白非天然形式的混合物，包括目的蛋白、宿主细胞蛋白及膜蛋白片段，DNA、RNA和质粒编码蛋白以及LPS。4. 包涵体的形成原因：表达蛋白不适当的中间折叠体高浓度聚集在一起形成的不溶物。5.影响包含体形成的因素：除分子伴侣和折叠酶外；还与蛋白质本身的性质（形成转角的残基数目及平均带电性等）和生长条件（宿主、培养温度、培养基和pH等）有关。6.防止包涵体形成：降低细胞生长温度；共表达分子伴侣；改变渗透压；融合蛋白7.包含体中蛋白质的提取： 用变性剂使之成为可溶性的伸展的肽链，然后再在适当的条件下复性折叠成天然的、有活性的蛋白质分子。8.分离纯化细菌包涵体蛋白的基本步骤：破碎细胞-分离包涵体-溶解包涵体（用68mol/L或 910mol/L尿素或pH2.0 4.5酸性溶液）-蛋白质产物的构型复原9.影响电泳迁移率的主要因素：(1)带电颗粒的性质：即净电荷数量、颗粒大小及形状;(2)电场强度：指每厘米的电位降，也称电位梯度，或电势梯度;(3)溶液的pH值：决定带电颗粒的解离程度，亦即决定所带净电荷的多少;(4)溶液的离子强度：影响电动电位，缓冲液离子强 度越高，电动电位越小，泳动速度慢;(5)电渗：在电场中，由于多孔支持物吸附水中的正或负离子使溶液相对带电，在电场作用下，溶液就向一定的方向移动.(6)支持介质的选择：(7)其它因素：10.不连续系统原理概要:(1)在不连续电泳系统中，含有三种离子，两种不同孔径的凝胶，两种或两种以上不同pH的缓冲溶液.(2)所谓不连续就是指凝胶浓度不一样，缓冲液离子成分及pH不一样。(3)在不连续电泳系统中，有三种物理效应，即样品的浓缩效应、分子筛效应及电荷效应。由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。11.以下为四个不连续性：(1)凝胶层的不连续性：浓缩胶 (stacking gel)； 分离胶 (separating gel)(2)缓冲液离子成分的不连续性：快离子(前导离子, leading ion)；慢离子(尾随离子, trailing ion)；缓冲配对离子(缓冲抗衡离子,the buffer counter ion); (3)电位梯度的不连续性：在不连续系统中，电位梯度的差异是自动形成的。(4)pH的不连续性：浓缩胶pH：6.7： 分离胶pH：8.9； 缓冲液pH：8.3。在浓缩胶与分离胶之间有pH的不连续性，是为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率。由于电泳基质的上述四个不连续性，使样品在电泳开始时得以浓缩，然后再被分离。12.SDS-PAGE： SDS作用：1）与蛋白牢固结合，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白质分子间天然的电荷差异；2）SDS-蛋白质复合物分子构型也几乎相同，而且具有相同的荷质比，因此在SDS-PAGE中，SDS-蛋白质复合物的电泳迁移率只与菌、酵母等的破碎。2）物理法： A. 超声法：在处理少量样品时操作简便、效率高，液量损失少，适于实验室使用。注意: 超声波产生的化学自由基团能使敏感的活性物质变性失活，另外噪声也比较大。 B.反复冻融法：由于在此过程中易使活性蛋白失活，故适用于提取非常稳定的蛋白质。 C.冷热交替法：绝大多数细胞被破坏，一般适用于从细菌或病毒中提取蛋白质。 D. 低渗裂解：是指无胞壁细胞在低渗溶液中通过渗透张力作用裂解的方法，常用于红细胞的裂解3）化学法：A.有机溶剂法：有些有机溶剂(如苯、甲苯等)可以改变细胞壁或膜的通透性，使内含物有选择性的渗透出来。 B.表面活性剂：常用的有十二烷基磺酸钠、TritonX-100、去氧胆酸钠等。 C.酶解法：必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶 15.分离方法：1）利用溶解度的差异分离：A.盐析法。 B.有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子之间不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另外有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出。 C.温度。 2）根据分子量的不同分离：.A.透析和超滤； B.平衡离心法； C.凝胶过滤。 3）根据电荷的不同分离：A.电泳； B.离子交换层析 。 4）亲和层析。16.分配定律：1）假设有两种互不混溶的溶剂S和M，将A物质溶于一定量的S溶剂中，再加入一定量的M溶剂；2）A物质在两相中相互扩散；3）A物质在两相中达到了平衡(在同一时间内，进出两相的A物质的分子数完全相等)时，其分配系数为常数K=CAS/ CAM。17.塔板理论的要点：1）分配层析柱象分馏柱一样可以分成很多层，每层为一理论塔板，其高度为理论塔板高度。在一定的条件下，一根分配层析柱的理论塔板数是一定的；2）在分配层析柱中，物质只有横向扩散，没有纵向扩散，而且在两相间达到分配平衡的速度很快；3）体系中其他物质的存在不影响待分离物质的分配。 待分离物质的存在也不影响其他物质的分配；4）在分配层析柱上，物质在各个理论塔板中的含量可通过计算求得。18. 区带电泳的优点：1）是带电的物质，都可采用某种电泳技术，分离成不同位置的区带，对区带可进行定性或定量分析；2）样品用量少；3）设备简单；4）可在室温进行；5）操作简便，化时间不多；6）不同类型的电泳，有不同的用途；7）改进或找到更好的支持介质，就有可能大大提高分辨率。19 .聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)：聚丙烯酰胺凝胶的性能：1）机械强度好，有弹性透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的；2）没有吸附和电渗作用. 通过改变浓度和交联度，可以控制孔径变化在极广泛的范围，并且制备凝胶的重复性好；3）由于纯度高及不溶性，还适合于少量样品的制备， 不致污染样品。 制备：1）原料：丙烯酰胺(Acr)和亚甲基双丙烯酰胺(Bis)；2）催化剂：引发剂（过硫酸铵, (NH4)2S2O8），加速剂（四甲基乙二胺, TEMED；3）化学聚合和光聚合两种；4）凝胶浓度和交联度；5）不连续系统制备。 可能出现的问题及解决措施：1）条带过淡：上样量不足；染色操作错误；2）条带丢失：电泳时间过长，小条带已跑出胶；胶浓度不正确。3）多余条带：还原剂过量。4）条带模糊：被降解; 药品不纯。5）条带位置错误：被降解；上样量过大；电泳条件不正确；上样前加热不够；还原剂失效。6）条带不整齐：孔径不均一；胶聚合太快，不均一；可能有气泡；样品离子强度过大。7）条带扩散：电压过低，电泳时间过长；缓冲液离子强度太低；样品本身结构不均一。8）条带弯曲：电泳过程产热过多；染色、固定时间短。9）拖尾：样品溶解不充分；胶板不干净。20. 蛋白质的浓缩：1）超滤法；2）冷冻干燥法；3）吸收法：聚乙二醇 (PEG)、蔗糖、凝胶等； 4）沉淀法。 五、酵母细胞双杂交系统1.研究蛋白质相互作用的常用方法：1）酵母双杂交；2）亲和层析；3）免疫共沉淀；4）蛋白质交联；5）基于GFP的细胞内蛋白质相互作用的研究方法；6）噬菌体显示系统筛选。2.酵母双杂交系统的基本原理：转录激活因子上有DNA结合结构域(BD)与转录激活结构域(AD);单独的BD虽然能和启动子结合,但不能激活转录;单独的AD也不能激活转录;与调控目的基因有关的两个蛋白质X蛋白与Y蛋白,将X蛋白的编码基因与BD结构域基因融合(表达所得的融合蛋白为”诱饵”蛋白), ,Y蛋白的编码基因与AD结构域基因融合(表达所得的融合蛋白称为”猎物”蛋白);如果X蛋白与Y蛋白之间存在相互作用,那么分别位于这两个融合蛋白(”诱饵”蛋白与”猎物”蛋白)上的BD和AD就能重新形成有活性的转录激活因子,从而激活相应基因(报告基因)的转录与表达. 通过对报告基因表达产物的检测,反过来可断别作为”诱饵”蛋白与”猎物”蛋白的两个蛋白质之间是否存在相互作用.3.以酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: (1)易于转化、便于回收扩增质粒;(2)具有可直接进行选择的标记基因和特征性报告基因;(3)酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白相互结合4.改造后的酵母细胞的特点：(1)基因组中GAL4基因是缺失型的;(2)基因组中引入额外的报告基因LEU、TRP、HIS; (3)通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。5.酵母双杂交系统的基本策略：1）表达“诱饵”和“猎物”蛋白；2）检验这两种蛋白表达后能否激活酵母中的报告基因做法：首先构建能表达“诱饵”和“猎物”蛋白的表达载体。该载体中可加入进行营养型筛选的基因。6.酵母双杂交系统的优点：(1)高敏感性；(2)真实性；(3) 简洁性；（4）广泛性。(1)高敏感性。原因：采用高拷贝和强启动子的表达载体，使融合蛋白过量表达；激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物，之后又与启动子结合，此三元复合体使融合蛋白各组分间结合更趋于稳定；通过mRNA使信号放大； 检测的结果是基因表达产物的累积效应，可检测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。(2)真实性。检测在活细胞内进行，作用条件与作用力无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。(3)简洁性。融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和纯化蛋白质的繁琐步骤。(4)广泛性。采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料构建cDNA文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白。p7.酵母双杂交系统的应用现状：(1)分析已知蛋白之间的相互作用;(2)对蛋白质功能域的分析，如可将待测蛋白质进行点突变或缺失突变再进行双杂交。(3) 用已知功能蛋白质筛选双杂交cDNA文库，研究蛋白质之间相互作用的传递途径，发现新基因。(4) 分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选文库，再根据筛的已知基因推测新基因功能。(5) 绘制蛋白质相互作用系统图谱;(6) 在药物设计中的应用。8.酵母双杂交系统中常见问题的解决和改进措施：1）假阳性较多；2）转化效率偏低；3）阴性干扰。1）假阳性定义：在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下，报告基因仍被激活。 原因：BD融合诱饵蛋白的单独激活作用。这种融合蛋白的激活作用被外来蛋白激活。如AD融合靶蛋白有DNA的特异性结合，则可单独激活报告基因的表达。AD融合蛋白直接与转录因子相互作用激活报告基因；AD融合靶蛋白与BD相互作用或者AD与BD融合蛋白之间的相互作用，尤其是后者带来许多假阳性。 排除假阳性的措施：作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。采用多个报告基因，且每个报告基因的上游调控区各不相同。目前试剂公司已采用。报告基因整合到染色体上，可使基因表达水平稳定。优化3-AT(3-aminotriazole)浓度。适当增加浓度可减少假阳性。2）转化效率偏低：办法：引进酵母接合型3）阴性干扰：两个蛋白本应发生相互作用，但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来。 原因：（1）融合蛋白的表达对细胞有毒性时，应选择敏感性较低的菌株或拷贝数低的载体；（2）蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株或多拷贝载体。（3）蛋白在酵母中不能稳定地表达，或者不能正确地折叠，或杂交蛋白不能转入胞核。9.酵母双杂交系统局限性：(1)某些诱饵蛋白具有自身激活性质。双杂交前删除该部分，但应避免删除相互作用的结构域;(2)某些蛋白在酵母中不稳定表达或不能准确定位到胞核内。在细胞表面发生的相互作用可采用噬菌体显示系统。(3)双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等， 这些反应在核内无法进行。(4)有时DNA-BD或AD融合部分不包括相互作用位点，或破坏了融合蛋白的正确折叠。(5) 哺乳动物蛋白之间相互作用有时要求正确的折叠和翻译后修饰，而酵母细胞不能提供这样的环境。这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。阳性克隆必须进行体外翻译和表达，用抗原表位特异性的抗体进行共定位研究. 双杂交系统的得到的阳性结果一定要通过其它的实验手段来验证。10.Gal4为酵母半乳糖苷酶基因gal1的转录激活因子，结构域中的DNA-BD位于N-末端，能识别位于Gal4基因的上游激活序列，AD位于C-末端。当Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分接近，则能恢复Gal4作为转录因子的活性。两个融合蛋白分别构建在穿梭质粒上，一个是将Gal4的DNA-BD与酵母蛋白SNF1融合；另一个是将Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。SNF1是一种丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶，SNF4是它的一个结合蛋白，这两种蛋白是已知可以相互作用的。当两种穿梭质粒共转化含有Gal4结合位点的报告基因LacZ的酵母菌株后，通过SNFl与SNF4的相互作用，Gal4的DNA-BD与Gal4的AD靠近, 形成复合物，激活报告基因LacZ的转录。11.酵母单杂交系统：原理 ：利用靶DNA序列，捕获具有与该元件特异结合的结构域的蛋白质。即靶DNA序列特异的结合蛋白(BDPX)与Gal4 P的激活结构域可融合形成融合体，BDPX与其特异DNA结合位点之间通过相互作用激活报告基因的表达。 应用：研究DNA-蛋白质相互作用。确定已知DNA-蛋白质之间是否存在相互作用。分离编码结合于目的顺式调控元件或其他短DNA结合位点蛋白的新基因。定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合结构域以及准确定位与DNA结合的核苷酸序列。 12.反向酵母双杂交系统：该系统是一项鉴定阻断蛋白间相互作用的技术，核心在于构建一种反向筛选的报告基因。在这系统中，野生型BD-X/AD-Y间的相互作用激活一种毒性标志作为报告基因，对酵母宿主是毒性或致死性的，即所谓的阴性筛选。在此情况下BD-X/AD-Y作用的解离赋予酵母一种选择生长优势。利用这种方法能方便地鉴定作用缺陷等位基因、解离肽或相关的小分子物质。 应用：1）用于筛选缺陷等位基因的研究：在稳定、全长及能够形成正确蛋白质折叠的条件下，已有了几种遗传学策略来筛选作用缺陷性等位基因；2）在反式作用解离分子方面的应用；3）在蛋白质组研究方面的应用：利用反向双杂交系统对文库进行预清除，则可能大大减轻以后的假阳性鉴定工作。反向双杂交系统作为正向双杂交系统的补充，提出了创建整个有机体蛋白质连锁图谱的设想。 13.酵母三杂交系统：基本原理：构建3个杂交体：1） BD与一个位点特异的RNA结合蛋白融合，可结合到报告基因上；2） RNA(Y)，含有“诱饵”顺序，且可结合到BD融合的蛋白质上；3）与AD融合的X蛋白。若X蛋白能与RNA结合，则AD靠近报告基因，使其激活。 种类：两个融合蛋白的相互作用必须借助于第三种分子，而这第三种分子可以是蛋白质、小分子多肽和核酸，因而产生了：1）蛋白质三杂交系统；2）激酶三杂交系统；3）小配体三杂交系统；4）RNA三杂交系统。六、DNA重组杂交1. DNA重组技术基本程序：外源DNA的获取-克隆载体的选择与构建-目的基因与载体的连接- DNA导入受体菌-重组体的筛选-克隆基因的表达 2.DNA重组的基本步骤：分、切、接、转、筛。3.作为基因工程载体所需具备的基本条件：(1)有自身的复制子，能借助自身的复制和调控对携带的目的基因进行复制和增殖。(2)有多克隆位点(多种酶单一位点)，易于外源DNA分子与载体及重组。(3)有多个利于选择和筛选的遗传表型或标志，包括抗药性、营养缺陷型、噬菌斑形成及显色反应。(4)表达型载体还应有强启动子、前导序列、增强子等调控元件。4.载体的分类：（一）按功能分类：1）克隆型载体； 2）表达型载体。 （二）按受体细胞分类：1）原核细胞载体：原核克隆型载体，原核表达型载体； 2）真核细胞载体（穿梭载体）：真核表达型载体，真核转递型载体。 （三）按载体来源分类：质粒载体，噬菌体载体，病毒载体，酵母人工染色体，粘性载体。5.质粒载体具备的特点：1）分子相对较小，具有较高的拷贝数； 2）含高效的复制子，可用氯霉素阻止细菌蛋白 质的合成，非使质粒的拷贝数增加；3）具有多种遗传选择标记，包括各种抗药基因或营养代谢基因等。6.抗药基因或营养代谢基因：1）氨苄青霉素抗性基因（ampr）:编码-内酰胺酶，水解amp -内酰胺环使amp失效；2）四环素抗性基因（tetr）：编码转膜泵将tet从细胞移出； 3）大肠杆菌LacZ基因：编码半乳糖苷酶，分解X-gal，使菌落为蓝色。7.l噬菌体作为载体具有两个特点： l噬菌体生长繁殖所必需的序列位于其左右二臂上，噬菌体基因组中央含有30%的DNA是l噬菌体生长所非必需的。 l噬菌体的成熟需要包装，当与外源DNA重组后的大小介于原来的75%105%之间时，重组的DNA分子才可包装为成熟的噬菌体颗粒。8.酵母人工染色体载体(YAC)：1）酵母基因：着丝粒，端粒，自主复制顺序； 2）质粒pBR322衍生物：复制起点(ori)，Ampr基因。 用途：构建真核生物基因组DNA文库9.酶切反应体系的建立：1）标准的酶切体系：1gDNA，20l总反应体积，1U酶，推荐的Buffer和温度，反应1h； 2）酶切体系组成：内切酶 根据实验目的选择，保存，使用，稀释（避免失活与污染）； DNA底物纯度，含量； 反应buffer 严格按产品说明书 高、中、低盐； 3）酶切温度与时间：一般为37, 1h； 4）酶切反应过程：容积：20l，50l, 酶容积10%, 即甘油 5%；注意混匀；反应终止：三种方法 :10mM EDTA或0.1%SDS; 65，20min; 酚/氯仿抽提，乙醇沉淀； 酶切鉴定 ：琼脂糖凝胶电泳10.Klenow片段：大肠杆菌DNA聚合酶I大片段，缺5 3外切酶活性。用途：1）随机引物标记法标记探针-主要用途；2）双脱氧末端终止法进行DNA测序；3）cDNA第二链的合成；4）DNA 3突出末端进行末端标记11.DNA连接酶(DNA ligase)基因工程的缝纫针：催化双链DNA相邻碱基5P和3-OH间磷酸二酯键形成的酶。 主要功能与用途：催化两个独立DNA片段(粘性末端和平末端) 5P和3-OH之间形成磷酸二酯键。催化平末端连接要比粘性末端 效率低得多。修复双链DNA分子中单链缺口。12.末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)：功能：催化多个脱氧核苷酸依次加到单链或双链DNA分子的3-OH末端。 用途：1）主要作用是在载体或目的基因 3末端加上同源多聚尾巴，形成人工粘性末端，便于DNA重组。 2）DNA 3末端的同位素标记。13.碱性磷酸酶功能：催化DNA，RNA以及核糖和脱氧核糖三磷酸上的 5 磷酸基团水解。 用途：1. 在连接反应中去除载体DNA片段5-P，防止载体自我连接. 2. 用32P标记5末端时，用此酶去除5-P，再用激酶进行5的 32P标记.14.基因组文库的构建和筛选：1）基因组文库(G文库)用基因克隆的方法保存宿主细胞中的DNA重组分子中的集合, 所有重组子所含的插入片段的总和代表某种生物基因组全部核苷酸序列； 2）G文库构建方法：鸟枪法； 3）分离、筛选基因方法：分子杂交及探针技术。15.cDNA文库的构建和筛选：1）cDNA文库(C文库)用基因克隆的方法保存在宿主细胞中的DNA重组体的群体，每一重组子只含一种mRNA信息，这些重组子的总和包含某种生物的全部mRNA序列。2）C文库构建方法：反转录法合成的cDNA与合适的载体重组并导入宿主细胞而形成。3）分离、筛选基因方法：分子杂交及探针技术。16.化学合成法制备基因片段：1）使用DNA合成仪。2）适用于氨基酸残基数目较少的蛋白基因。3）缺点：只能合成较小片段的DNA；目的基因DNA序列需通过氨基酸序列推测，难于保证与天然基因序列一 致，导致表达效率大大降低。17.PCR产物的克隆策略：1）限制性内切酶酶切位点添加法； 2）T/A克隆法18.外源DNA片段和载体的连接：1）粘性末端连接法：适用于插入片段和载体具有相同的粘性末端。 缺陷：高背景(自身环化)；双向(正、反)插入；多拷贝插入。 2）平头末端连接法：适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点。3）人工接头法：用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点。4）同聚物接尾法：适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点。19.转化原理及转化、转染程序：对数生长期的细菌 感受态细菌(4保存24h) 37，倒置培养重组质粒DNA+细菌热休克蛋（42度，90秒）普通培养基温育涂布于含抗生素的培养基平板单菌落20. Southern印迹杂交是将经凝胶分离的DNA转移到合适的固相支持物，再通过特异性探针的杂交来检测被转移的DNA片段的一种技术。 程序： 限制性内切酶消化DNA琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段转印到NC膜或尼龙膜碱变性、中和预杂交、杂交放射性自显影. 其基本原理-毛细管转移21.Northern印迹杂交程序: 将RNA样品变性和通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移到NC膜等固相载体上，用标记的DNA或RNA特异探针对固定在膜上的RNA进行杂交。22.Northern与Southern印迹杂交异同点：相同点：基本原理; 不同点：(变性方法) Northern印迹杂交：聚乙二醛、二甲亚砜、甲醛、甲基氢氧化汞; Southern印迹杂交：碱变性23.核酸分子杂交的基本原理: 用一已知的DNA或RNA片段(探针)来检测样品中未知的核苷酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原理互相结合，再经显影或显色的方法，将结合核苷酸序列的位置和大小显示出来。具有一定同源性的两条核酸单链在适宜的条件（温度及离子强度）下可以按碱基互补配对的原则退火形成双链分子，由此可用来检测核酸分子存在与否。 实质是核酸分子的变性与复性过程。 核酸分子杂交应用：1）基因克隆的筛选；2）酶切图谱的制作；3）基因组中特定基因序列的定量和定性分析；4）基因突变分析；5）疾病的诊断。24.核酸探针的种类：1）寡核苷酸探针；2）基因组DNA探针；3）cDNA探针；4）RNA探针。25.理想探针标记物应具备的条件:(1).高度灵敏性;(2).标记物与核酸探针分子的结合，不影响探针的主要理化特性，绝对不能影响其碱基对特异性;(3).具有较高的化学稳定性，能耐较高温度和保存时间;(4).检测方法具有高度特异性;(5).标记及检测方法简单;(6).对环境无污染，对人体无损伤;(7).价格低廉。26.放射性核素-目前最常采用：优点：1）灵敏度极高；2）放射性核素对各种酶促反应无任何影响,也不会影响碱基配对的特异性与稳定性和杂交性质；3）极高的特异性。 缺点：1）半衰期短, 随用随标；2）放射性污染。非放射性标记物：优点：1）无放射性污染；2）稳定性好,可较长时间存放。 缺点：1）灵敏度不太高；2）特异性不太高。 非放射性标记物：1）生物素；2）地高辛；3）荧光素：FITC，罗丹明。27.核酸探针的标记方法:(1)DNA的切口平移标记法;(2)随机引物标记法;(3)RNA探针的标记;(4)DNA的末端标记;(5)cDNA探针的标记：在反转录过程中选用反转录酶, 加入标记的核苷酸, 引物可以特定的,也可以是随机六核苷酸, 或oligo dT;(6)寡核苷酸探针的标记：在DNA合成时加入特定标记的核苷酸进行标记。28.DNA的缺口平移标记法，随机引物标记法，DNA的3末端标记等均为延长核苷酸的反应，而且要让32P进入链中，故应选择-32P-dNTP， 50ci/反应，无特殊原因首选-32P-dCTP。29.DNA的5末端标记，为加磷酸反应，而且要让p/32P进入5末端，故应选择-32P-ATP， 150ci/反应。30.生物素化核苷酸的制备:酶法(U)与化学法(C)生物素标记方法:参入标记法(随机引物法或缺口翻译法)与光敏生物素标记法。生物素探针的检测体系：生物素探针+抗生物素蛋白+带ALP或HRP的生物素+底物；生物素探针+抗生物素抗体+ 抗生物素抗体的抗体+ABC试剂(底物:BCIP+NBT)。31.探针DNA标记:Dig+dUTP Dig-dUTP Dig-dUTP标记DNA方法: 切口平移法与随机引物标记法检测方法: Dig-DNA探针+抗Dig抗体-ALP或HRP+底物（BCIP+NBT）。32.目前常用的印迹转移的方法：1）毛细管转移；2）电转移法；3）真空转移法。七、DNA的P C R1.PCR原理：类似于DNA的天然复制过程，是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5末端和3末端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸，直至完成新的DNA合成，反复重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。PCR反应的特异性依赖于2个与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，取决于2个引物设计的好坏，依赖于引物与模板结合的正确性，退火温度。2.PCR的过程：(1)DNA模板变性 (denature)：95左右高温使模板DNA完全变性;(2)单链DNA模板与引物退火 (annealing)：引物与模板形成复合物的几率DNA分子自身的复性;(3)引物的延伸 (extension)：DNA聚合酶在最适温度下催化DNA合成反应。5 端是人工合成的