基因工程复习资料.doc

第二章分子克隆工具酶基因工程工具酶n 限制性内切酶主要用于DNA分子的特异切割 n DNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化 n 核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割 n 核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 n 核酸连接酶用于DNA和RNA的连接 n 核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰 n 其它酶类用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等。第一节限制性核酸内切酶(restriction enzyme)一、限制性内切酶的发现历史核酸酶：催化核酸酯键的水解核酸外切酶：作用于核酸链的末端(3或5 ),逐个水解核苷酸。核酸内切酶：从核酸分子内部切断3， 5磷酸二酯键。限制性核酸内切酶：在细菌细胞内存在的一类能识别并水解外源双链DNA的核酸内切酶。1、细菌的限制修饰现象细菌的限制修饰作用发现细菌的限制（restriction）现象：寄主控制的专一性phageK R-M 系统的作用:R-M 系统是细菌安内御外的积极措施。 保护自身的DNA不受制；破坏外源DNA使之迅速降解细菌 R-M 系统的限制酶可以降解 DNA，为避免自身 DNA 的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身 DNA，未被修饰的外来 DNA 则会被降解。 个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。2、限制性核酸内切酶的发现限制性核酸内切酶(restriction endonuelease) 是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)。它是可以将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。 1968 Linn 和 Arber 从 E.coli B 中发现限制酶 1970 Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶 1978 W. Arber，H. O.Smith，Nathans 因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金 。 限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双链 DNA 分子中的特定核苷酸序列，并对 DNA 分子进行切割的一种酶。 功能：降解不同源 DNA，而不降解同源DNA。3 、限制性核酸内切酶的命名若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。 限制酶的命名是根据细菌种类而定，以EcoRI为例： EEscherichia（属）cocoli（种）RRY13（品系）I首先发现在此类细菌中发现的顺序4、限制与修饰系统的种类特性型型型限制和修饰活性双功能单一功能双功能识别与切割位点分别，随机切割，相距较远同一位点相距 5-10 bp对基因工程中意义无用非常有用意义不大型限制酶（无用）1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出的核酸内切酶。 分子量：30万dal左右 组成：3种亚基a. 特异性亚基：具特异性识别DNA序列的特性。b. 修饰亚基：具甲基化酶活性。c. 限制亚基：具核酸内切酶活性。 辅助因子：需Mg2+、ATP和SAM。 识别和切割位点：不一致（距识别位点5一侧数千碱基处随机切割DNA分子）。型限制酶（十分有用）1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分离出来的限制酶。 分子量：2万10万dal（较小） 组成：一种多肽，常以同源二聚体形式存在。 辅助因子：无需辅助因子，或只需Mg2+。 识别和切割位点：相一致。型限制酶（无用） 组成：两个亚基a. M亚基：负责位点的识别与修饰。b. R亚基：具核酸酶的活性。 辅助因子：需Mg2+、ATP和SAM 识别和切割位点：不一致（距识别位点一侧约25bp处切割DNA分子）。二、限制性核酸内切酶识别的序列 绝大多数的型限制性核酸内切酶都能够识别由4-8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。 限制性核酸内切酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此这些识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。 在 DNA 分子双链的特异性识别序列部位，切割 DNA 分子，产生链的断裂。 2 个单链断裂部位在 DNA 分子上的分布，通常不是彼此直接相对。断裂结果形成的 DNA 片段，具有互补的单链延伸末端。1、限制酶识别序列的长度 （限制酶识别序列的长度一般为4-8个碱基，最常见的为 6个碱基）4 个碱基识别位点：Sau3A GATC5 个碱基识别位点：EcoR CCWGG Nci CCSGG6 个碱基识别位点： EcoR GAATTC Hind AAGCTT7 个碱基识别位点： BbvC CCTCAGC PpuM RGGWCCY8 个碱基识别位点： Not GCGGCCGCSfi GGCCNNNNNGGCC当识别序列为 4 个和 6 个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每 256 个和 4096 个碱基中会出现一个识别位点（44=256，46=4096）。 限制性内切核酸酶2、限制酶识别序列的结构 II 型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构。类酶识别序列特点 回文结构(palindrome) 切口 ：平端切口、粘端切口3、限制酶切割的位置 DNA在限制性核酸内切酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置被称为切割位点，用或表示。 切割的位点：一般在识别序列内部，如GGATCC、ATCGAT、GTCGAC、CCGCGG、AGCGCT等。少数在识别序列的两侧，如GATC、CATG、CCAGG等 三、限制酶产生的末端1、限制酶产生匹配粘端若在对称轴 5侧切割底物， DNA 双链交错断开产生 5突出粘性末端。 5GAATTC3EcoRl 5GOH PAATTC 3 3CTTAAG5 3CTTAAP+ OHG5 若在 3-侧切割，则产生 3 突出粘性末端，如 Pst： 5CTGCAG3 Pstl 5CTGCA- 3 5G3 3GACGTC- 5 3G- 5 十3-ACGT5 2、限制酶产生平末端在回文对称轴上同时切割 DNA 的两条链，则产生平末端，如 Hae（GGCC）和 EcoRV（GATATC）。 3、限制酶产生非对称突出末端许多限制酶切割DNA产生非对称突出末端。当识别序列为非对称序列时，切割的DNA产物的末端是不同的，如 Bbc,它的识别切割位点如：CCTCAGC GGAGTCG1. S1核酸酶(1) 特点：活性：降解单链核酸（DNA或RNA）为单核苷酸；降解双链核酸的单链区(2) S1核酸酶的应用-RNA分子的定位2.Bal31核酸酶Bal31核酸酶的三种活性：（1）单链核酸内切（2）双链核酸外切（3）双链切口对应链Bal31核酸酶主要用途：（1）诱发DNA发生缺失突变（2）定位测定DNA片断中限制性位点的分布（3）研究超盘旋DNA分子的二级结构3.其他核酸酶外切核酸酶（Exonuclease ）：3至5外切RNA酶(RNase)：切割DNA-RNA杂合链中的RNA其他核酸酶:外切核酸酶（Exonuclease ）：3至5外切DNA酶（DNase ）：随机切割ss & dsDNARNA酶(RNase )：切割DNA-RNA杂合链中的RNA4、同裂酶（来源不同的限制酶识别相同的核苷酸靶序列） 同序同切酶、同序异切酶、同功多位等。同序同切酶5、同尾酶来源不同，识别的核苷酸靶序列也不相同，但切割后 DNA 分子产生的粘性末端相同的限制性核酸内切酶。BamH Bcl Bgl三种酶可产生相同的 5GATC 粘性末端（配伍末端），由这种同尾酶产生的 DNA 片段可因粘性末端的互补而彼此再连接起来。四、DNA末端长度对限制酶切割的影响限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求，也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则限制酶难以发挥切割活性。限制性核酸内切酶的活性单位20L Buffer 中，含1g 底物 DNA，于最适反应条件和温度下，保温 1 小时，能使 1g DNA 完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用 U 表示。 五、位点偏爱（Site preference） 对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。六、酶切反应条件酶切反应系统应组成： 酶、底物和反应缓冲液，并且还需要合适的反应温度。 1、缓冲液：常规缓冲液一般包括提供稳定pH的缓冲剂、 Mg2+、牛血清蛋白 (BSA)、二硫苏糖醇(DTT)。2、反应温度：大多数酶的标准反应温度 37度。3、反应时间：通常是1小时或更多，许多酶延长反应时间可减少酶量。4、终止酶切的方法：EDTA可螯合Mg2+，从而可终止酶切反应；加热。七、星星活性 （ Star activity ） 限制性内切酶识别特异性放宽 EcoR在正常情况下识别 GAATTC 序列发生切割，但如果缓冲液中甘油浓度超过 5%，其识别位点发生松动，可在 AATT 处发生切割，EcoR这种特殊的识别能力叫做星星活性，用 EcoR*表示。 星星活性可造成位点切割机率不等，降解不完全。 影响因素：甘油浓度高 12-20%；酶过量（100U/l）；离子强度低（ 25mol/l）； pH过高（8.0）；加入有机溶剂：45% 聚乙二醇 (PEG)，8% 二甲基亚枫，12% 乙醇；二价阳离子。 抑制星星活性的措施：如减少酶的用量（可避免过分酶切），减少甘油浓度，保证反应体系中无有机溶剂或乙醇，提高离子强度到 100150mM （如果不会抑制酶的活性的话），降低反应 pH 至 pH7.0 ，以及保证使用 Mg2+作为二价阳离子。八、影响酶活性的因素限制性核酸内切酶反应影响因素： 温度、缓冲液、时间、反应体积和甘油浓度、DNA纯度和结构等。1、底物 DNA （1）样品DNA的纯度 RNA 与 E 结合影响有效酶浓度； 蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1 mg DNA 用 10 U 酶加大反应总体积延长反应时间（2）DNA 浓度 DNA 过大，抑制酶活性，影响酶分子扩散 （3）DNA样品的甲基化程度大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、Mbo I等，但BamH I、 Bgl II、Sau3A I不受影响。大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等。哺乳动物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基。（4）识别位点及邻近位点特异性序列 如：pBR322 DNA 有 4个 Nar切点 (GGCGCC)其中 2 个切点用1U 酶水解 1h 完全切开, 2 个切点用50U 酶水解 16h 水解不完全。 Xma 切点（CGGCCG）在GGCGGCCGCC时不切割。 （5）DNA 二级/三级结构 如：超螺旋 DNA (病毒或质粒) 比线状 DNA 需酶多 （6）提取时混入杂质可改变识别特异性 如： 高浓度 Hg2+、酚、 氯仿、乙醇、EDTA、 SDS、NaCl 等。2、反应系统因素 高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Star activity（星星活性）现象。Eco R I 在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5AATT3或者5PuPuATPyPy3。（1）缓冲液（无菌、无污染） （2）金属离子 如：型酶需 Mg2+，若以 Mn2+ 代替Mg2+ （如Hind，EcoRI）则特异性改变。 离子浓度不合适会抑制酶活。 （3）牛血清蛋白 (BSA) BSA 是酶稳定剂，可避免热、表面张力、化学品导致的酶变性。过量 BSA 会引起电泳拖尾。二硫苏糖醇(DTT)或-巯基乙醇：维持酶活性的稳定。 Tris-HCl或Tris-Ac：维持酶活性适合的pH环境。限制性核酸内切酶的应用p 重组DNA前的切割 p 构建新质粒 p 构建物理图谱 p DNA分子杂交 p 用限制性内切酶消化受体DNA p 制备DNA探针 p 亚克隆以用作序列分析 p 基因定位，DNA同源性研究 第二节甲基化酶 (methylase)p 类 R-M 系统由限制性核酸内切酶和甲基化酶两种酶分子组成。大多数限制酶都已分离出相应的甲基化酶。 p 甲基化酶也称修饰酶 (modification enzyme)，用来修饰限制酶的识别序列，使得该序列可以被限制性内切酶识别而免于切割。 一、甲基化酶的种类1、Dam甲基化酶 可在GATC序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基。2、Dcm甲基化酶 Dcm甲基化酶识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个胞嘧啶C的C5位置上引入甲基。二、甲基化对限制酶切的影响1、修饰酶切位点 2、产生新的酶切位点 3、对基因组作图的影响第三节 DNA 聚合酶（DNA polymerase）指在DNA(或RNA)模板指导下，以4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）为底物，在引物3 -OH末端聚合DNA链的一类酶。DNA聚合酶在DNA复制时起关键作用。真核细胞DNA聚合酶种类及作用在高等真核细胞中现已分离到五种 DNA聚合酶，即 DNA聚合酶、和。 其中、 和存在于细胞核中， 存在于线粒体中。n DNA聚合酶 染色体的DNA复制n DNA聚合酶 分子较小，参与DNA的修复。n DNA聚合酶 与线粒体DNA复制有关n DNA聚合酶 染色体的DNA复制，作用相 当于pol III。n DNA聚合酶 类似于pol I，主要参与DNA的修复n DNA聚合酶与DNA聚合酶 共同完成DNA复制一般认为DNA聚合酶仅仅是合成引物，引物再被与DNA聚合酶所延伸。高等真核细胞的DNA聚合酶和细菌DNA聚合酶的性质相似。它们也以四种脱氧核苷三磷酸作为底物。聚合反应需要模板和引物以及金属Mg2+（或Mn2+），链的延长方向为5 3 。真核细胞的 DNA聚合酶一般都不具有核酸外切酶活力。真核细胞中DNA的复制过程极可能与原核生物类似，真核生物复制叉的移动速度较慢，但复制总速度可能比原核生物快 。DNA聚合酶种类及作用：1、大肠杆菌DNA 聚合酶2、Klenow DNA 聚合酶3、T噬菌体DNA 聚合酶4、T7噬菌体DNA 聚合酶5、耐热DNA 聚合酶DNA 聚合酶共同点： 把脱氧核糖核苷酸连续的加到双链DNA分子引物链的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离的情况。DNA 聚合酶的分类： 聚合酶（pol） 聚合酶(pol) ， 聚合酶(pol )。(参与 DNA 复制)DNA 聚合酶和 的比较：DNA 聚合酶的特点： 需模板 (DNA 或 RNA)； 需引物； 具有三种酶活性: 5 3聚合酶活性； 5 3外切酶活性 3 5外切酶活性。一、大肠杆菌DNA 聚合酶 （ E.coli DNApolymerase）来源：E.coli，由染色体 DNA 基因编码。商品上用的此酶来源于 Phage NM964 整合的溶源性 E.coli。结构 ：单链多肽链，MW = 109，000 D。 1、大肠杆菌DNA聚合酶 I的活性n 53的DNA聚合酶活性n 53的核酸外切酶活性n 35的核酸外切酶活性n 交换（置换）反应53聚合酶活性53外切酶活性 35外切酶活性 交换反应：如果只有一种dNTP存在， 3 5外切核酸酶活性将从3OH端降解DNA，然后在该位置发生一系列连续的合成和外切反应，直到露出与该dNTP互补的碱基。2、大肠杆菌DNA聚合酶 I的用途切口平移（ Nick translation ）法标记DNA，制备32P标记的探针DNA pol的53聚合活性和53外切酶活性协同作用，可以使DNA一条链上的切口从53方向移动，这种反应叫做缺刻平移(nick translation)。DNA 聚合酶在分子克隆中的主要用途是通过 DNA 缺口平移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的 DNA 探针。此时， DNA 聚合酶的 5- 3核酸外切酶活性和 5-3 聚合酶活性同时发生。DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途是通过DNA缺口平移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。32P标记的DNA 杂交探针的制备探针：用来探知被测物存在的小 DNA 或RNA叫做探针。 标记物：探针上结合有易被检测的化合物称为标记物。 分子杂交：探针 DNA 或 RNA 与被测物的互补结合叫做分子杂交（molecular hybridization）。二、 Klenow DNA 聚合酶来源 ：E.coli DNA Polymerase经蛋白酶水解的大片段 (Klenow 和 Henningseon.1970）Klenow酶的基本用途：p 补平由核酸内切酶产生的3凹端p DNA片段的同位素末端标记p cDNA第二链的合成p 双脱氧末端终止法测定DNA序列 补平由核酸内切酶产生的3凹端：DNA片段的同位素末端标记：Klenow 在有底物存在时则聚合；无底物时只进行 3 5外切。 但 Klenow 作用不如T4DNA聚合酶3 5外切酶活性。三、T4DNA 聚合酶来源：T4Phage 感染的 E.coli 结构：MW=114,000 d 活性：53聚合活性； 35外切活性，对单链活性大于双链DNA，外切酶活性比 Klenow 大 200 倍 用途:填补或标记限制酶切后产生的 3-凹缺末端。（同 Klenow） 四、T7DNA 聚合酶来源：T7 Phage 感染的 E.coli 结构：由 2 个蛋白亚基组成： T7 phage gene 5 蛋白 + 宿主硫氧还蛋白 活性： 53聚合，持续反应时间最长，所以合成的 DNA 链长。故在 DNA 测序中很优越。 35外切，是 Klenow 聚合酶的 1000倍。用途: 复制较长的模板，在测序中可读出较长的序列 ,用填补或交换反应快速进行末端标记。 活性与 TDNApol、 Klenow DNApol 一样。 定点突变中互补链的合成。修饰的 T7DNA 聚合酶(测序酶)来源： 天然 TDNA 聚合酶经修饰处理 结构： 同T聚合酶。 用还原剂、分子氧、低浓度 Fe+与酶保温几天，可使Phage T7 gene5 蛋白 N- 端35外切酶活性中心失活 (O- 修饰)。 即：53聚合酶作用提高，持续性长。3 5外切作用下降 99% 以上。 五、Taq DNA 聚合酶(Thermusaqraticus)来源：从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种。 结构：单亚基 MW = 94,000 d。 活性：聚合最适温度为 75-80，不具35外切酶活性，具53外切活性 。 用途：PCR 反应。 测序，高温下进行 DNA 合成可减少模板二级结构。六、反转录酶 (reverse transcriptase) 依赖于RNA的DNA聚合酶来源：来自禽类成髓细胞瘤病毒 (AMV)。 来自能表达 Moloney 鼠白血病毒(M-MLV)反转录酶基因的 E.coli。 结构和活性：酶类别肽链5-3聚合活性RNAseHAMV62，000 94，000 +M-MLV84，000+n 53的DNA聚合酶活性（需要Mg2+ ）n 53RNA核酸外切酶活性（RNAseH）n 35RNA核酸外切酶活性（RNAseH）产生含5磷酸及3羟基的长420个碱基的核苷酸。反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链。反转录酶的基本特性：双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链。反转录酶用途：对 RNA-DNA 杂交体中的 RNA 特异性地降解，免除了在反转录完成后再用 NaOH 降解 RNA 模板的步骤。七、末端转移酶(terminal transferase) (末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）)来源：来自小牛胸腺，只在前淋巴细胞和淋巴细胞分化早期阶段中存在的罕见的 DNA 聚合酶 (Chang 和Bollum,1986)。 结构：MW = 60,000 d. 活性：催化 dNTP 掺入 DNA 3-OH 末端，形成同聚物末端；反应不需模板 DNA，需 Co2+或Mg2+ 。用途： 克隆DNA片段时加上互补同聚物末端，便于与载体连接。 末端标记来TdT的基本特性：不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs。第四节其他分子克隆工具酶p 依赖于DNA的RNA聚合酶 p 连接酶p T4多核苷酸激酶p 碱性磷酸酶p 核酸酶p 核酸酶抑制剂p 琼脂糖酶p DNA结合蛋白p 其他酶一、依赖于DNA的RNA聚合酶（DNA dependent RNA polymerase）来源（包括三种酶） T7、T4噬菌体 RNA 聚合酶 在 E.coli （或细菌）中的克隆表达。 E.coli RNA 聚合酶。 SP6噬菌体 RNA 聚合酶活性:在 DNA 指导下合成 RNA，结合于启动子部位，转录无意义链 (-) 产生与有意义链相似 (以U代替模板中 T) 的链。 转录链为无意义链，负链 (-)。不转录链为有意义链，正链 (+)。用途 (1)体外合成RNA分子 (2)用于表达外源基因DNA连接酶的发现1967年，世界上有数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶(1igase)。DNA连接酶的作用特点：能够催化 DNA 中相邻的 3-羟基和 5-磷酸基末端之间形成3，5-磷酸二酯键; 吸能反应。DNA连接酶是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP(动物与噬菌体)或NAD (细菌) 水解提供的能量催化DNA链的5-PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。 DNA连接酶的连接机制:DNA连接酶利用NAD或ATP中的能量催化两个核酸链之间形成磷酸二酯键。反应过程可分三步： (1)NAD+或ATP将其腺苷酰基转移到DNA连接酶的一个赖氨酸残基的氨基上形成共价的酶-腺苷酸中间物，同时释放出烟酰胺单核苷酸(NMN)或焦磷酸。 (2)将酶-腺苷酸中间物上的腺苷酰基再转移到DNA的5-磷酸基端，形成一个焦磷酰衍生物，即DNA-腺苷酸; (3)这个被激活的5-磷酰基端可以和DNA的3-OH端反应合成磷酸二酯键，同时释放出AMP。 连接酶的作用机理此反应是由焦磷酸 (ppi)的水解作用激发的,需要花费两个高能磷酸键,DNA连接酶所催化的整个过程是可逆的。 酶-腺苷酸中间物可以与NMN或PPi反应生成NDA或ATP及游离酶;DNA-腺苷酸也可以和NMN及游离酶作用重新生成NAD。该逆反应过程可以在AMP存在的情况下使共价闭环超螺旋DNA被连接酶催化，产生有缺口的DNA-腺苷酸，生成松弛的闭环DNA。 DNA连接酶的基本性质(1) 修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键(2) 修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键(3) 连接多个平头双链DNA分子二、DNA连接酶（ligase）种类 T4DNA 连接酶 大肠杆菌 DNA 连接酶 T4DNA 连接酶 可连接带匹配粘性末端的 DNA 分子，也可使平端的双链 DNA 分子相互连接。 反应底物为黏端、切口、平末端的RNA（效率低）或DNA。反应系统中必须加有辅助因子ATP(a)分子间连接(b)分子内连接二、DNA连接酶（ligase）(大肠杆菌 DNA 连接酶 )只能连接带匹配粘末端的 DNA 分子,反应系统中必须含NAD作为辅助因子。三、T4多核苷酸激酶和碱性磷酸酶 磷酸激酶催化 5加 P （标记） 碱性磷酸酶去除 5- P （防止自身环化） T4多核苷酸激酶（标记） 在分子克隆中呈两种反应，其一是正反应，指将ATP的磷酸基团转移至无磷酸的DNA5末端，用于对缺乏5磷酸的DNA进行磷酸化。其二是交换反应，在过量ATP存在的情况下，该酶可将DNA的5端磷酸转移给ADP，然后DNA从ATP中获得磷酸而重新磷酸化。碱性磷酸酶（防止自身环化） 来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP）;来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP）五、核酸酶（nuclease）Bal 31 核酸酶 单链内切双链外切的核酸酶 来自艾氏交替单胞菌（A.espejiana） 从 DNA 末端同时降解两条链。 用于基因表达调控序列的研究。S1 核酸酶 降解单链核酸 来自稻谷曲霉菌（Aspergillus oryzae） 用于把具粘性末端的 DNA 变为平齐末端的 DNA。 在 DNA 部分变性条件下，能在富含 AT 区切断 DNA。 S1核酸酶S1核酸酶来源于稻谷曲霉(Aspergillusoryzae)，是一种高度单链特异的核酸内切酶，在最适的酶催反应条件下，降解单链DNA或RNA，产生带5，-磷酸的单核苷酸或寡核苷酸。对双链DNA、双链RNA和DNA-RNA杂交体相对不敏感。通常水解单链DNA的速率要比水解双链DNA快75000倍。这种酶需要低水平的zn2+的激活，最适pH范围为4043。 一些螯合剂(如EDTA和柠檬酸等)能强烈地抑制s1核酸酶活性，此外磷酸缓冲液和06左右的SDS溶液也可以抑制它的活性，但它对尿素以及甲酰胺等试剂则是稳定的。S1核酸酶的单链水解功能可以作用于双链核酸分子的单链区，并从单链部位切断核酸分子，而且这种单链区可以小到只有一个碱基对的程度。由于具备这种功能，使S1核酸酶在分析核酸杂交分子(RNA-DNA)的结构、给RNA分子定位、测定真核基因中间隔子序列的位置、去除DNA片段中突出的单链尾，以及打开在双链cDNA合成期间形成的发夹环。 六、核酶（ribozyme）p 1981 Cech 和 Altman 首次发现，并因此获得1989年的诺贝尔奖。 p 具有酶活性的 RNA片段。 p 是真核生物转录产物地内含子本身含有的前导序列，能在离体条件下特异地催化内含子剪切。 p 核酶可以作为 R