稳定表达T7RNAP的BHK_21细胞系的建立.pdf

稳定表达 T7 RNAP 的 BHK 21 细胞系的建立 李欣 1 2 杨少华1 王洪梅1 刘 晓 1 武建明1 高运东1 王立群2 仲跻峰1 何洪彬1 1 山东省农业科学院 奶牛研究中心 山东 济南 250100 2 东北农业大学 生命科学学院 黑龙江 哈尔滨 150030 摘要 为建立能稳定表达 T7 RNA 聚合酶 T7 RNAP 的 BHK 21 细胞系以研究 RNA 重组疫苗 本研究从 BL21 DE3 大肠杆菌中扩增 T7 RNAP 基因 定向克隆于质粒 pcDNA3 1 中 经双酶切及测序鉴定 获得阳性 重组质粒 pcDNA3 1 T7 RNAP 用该质粒转染 BHK 21 细胞 经 G418 筛选 14 d 后获得阳性细胞株 RT PCR 和 western blot 检测结果表明 建立了稳定表达 T7 RNAP 的 BHK 21 细胞系 并且在不同代次的阳性细胞中能稳定 表达目的基因和蛋白 该研究为 RNA 病毒感染性质粒在细胞内转录及病毒拯救技术平台的建立奠定了基础 关键词 T7 RNAP BHK 21 细胞 中图分类号 Q814文献标识码 A文章编号 1008 0589 2010 06 0473 03 Establishment of BHK 21 cell lines stably expressing T7 RNAP LI Xin1 2 YANG Shao hua1 WANG Hong mei1 LIU Xiao1 WU Jian ming1 GAO Yun dong1 WANG Li qun2 ZHONG Ji feng1 HE Hong bin1 1 The Research Center of Dairy Cow Shandong Academy of Agricultral Science Jinan 250100 China 2 College of Life Science Northeast Agricultural University Harbin 150030 China Abstract To establish the cell line with stable expression of T7 RNA polymerase gene T7 RNAP gene was amplified from E coliBL21 DE3 and inserted into pcDNA3 1 vector to construct recombinant plasmid pcDNA T7RNAP The BHK 21 cell line stably expressing T7 RNAP was generated by pcDNA T7RNAP transfection and the positive cell clones were obtained after continually screening using G418 The expressions of T7 RNAP gene were confirmed by RT PCR and western blot The cell line stably expressing the T7 RNAP gene could provide a platform for rescue RNA recombinant virusin vitrovia reverse genetic technique Key words T7 RNAP BHK 21 stable cell lines reverse genetic technique 收稿日期 2009 10 12 基金项目 国家转基因重大专项 2009ZX08007 006B 山东省自然科学基金 Y2008D20 山东农科院 杰出人才 基金 山东省农业重大应用技术创新课题 山东省科技攻关项目 作者简介 李欣 1982 女 黑龙江牡丹江人 硕士研究生 主要从事微生物学研究 通信作者 E mail wangliqun2 hongbinh Corresponding author 中国预防兽医学报 Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine 第 32 卷 第 6 期 2010 年 6 月 Vol 32 No 6 Jun 2010 T7 RNA 聚 合 酶 T7 RNA polymerase enzyme T7 RNAP 是一种依赖 DNA 的 RNA 聚合酶 其编码 基因长度为 2 652 bp 该酶是 1 个单体酶 1 可特异 性识别 T7 启动子 在没有其它蛋白因子的协助下 就能介导 T7 噬菌体晚期基因转录的顺利进行 2 5 T7 RNAP 和相应转录单元在体内发生转录 以实现 病毒的体内拯救 6 8 本研究利用基因克隆及重组技术 构建了 T7 RNAP 重组 pcDNA3 1 质粒 转染 BHK 21 细胞 后 经 G418 筛 选 获 得 了 具 有 G418 抗 性 的 BHK 21 细 胞 系 经 RT PCR 及 WB 检 测 表 明 G418 抗 性 的 BHK 21 细 胞 可 稳 定 表 达 T7 RNAP mRNA 及蛋白 该细胞系为依靠 T7 RNAP 体内转录 系统建立的 RNA 病毒反向遗传技术平台提供了技 术支撑 并为研究 RNA 病毒的致病机理和免疫机 制及重组疫苗等奠定了基础 1材料和方法 1 1菌株 质粒与细胞BL21 DE3 为 DE3 噬菌 体浸染的 BL21 大肠杆菌并整合了 T7 RNAP 的基 因 以及 pcDNA3 1 质粒 BHK 21 细胞由本实 验室保存 1 2酶与试剂所用限制性内切酶均购自宝生物工 程 大连 有限公司 DNA 回收试剂盒 质粒提取试 剂盒 LipfectamineTM2000 转染试剂盒购自 Invitro gen 公司 琼脂糖凝胶购自美国 Biowest 公司 细胞 培养基及优等胎牛血清购自 Hyclone 公司 新霉素 购自 Sigma 公司 1 3T7 RNAP 基因的扩增和克隆根据 GenBank 的 T7 RNAP 基因参考序列设计并合成 T7 RNAP 基 因的引物 上游引物 5 CGGATATCGCCACCATGG ACTACAAGGACGACGATGACAAGAACACGATTA ACATCGCT 3 下划线部分为 Flag Tag 下游引物 5 CGGCTCGAGTTAGCCGCACTTTTGCTTCTTGGT GTTAGGCGCGAACGCGAAGTCCGA 3 以 BL21 DE3 基因组 DNA 为模板 利用上述 引物进行 PCR 扩增 扩增程序为 95 5 min 95 30 s 50 1 min 72 2 min 30 s 循环 30 次 72 延伸 10 min 1 4T7 RNAP 重组 pcDNA3 1 质粒的构建分别 用EcoR 和Xho 酶切 T7 RNAP PCR 产物和 pcD NA3 1 回收目的片段 进行连接 转化感受态 细胞 DH5 通过菌液 PCR 和双酶切鉴定为阳性克 隆的重组质粒 进行序列测定和分析 重组质粒 pcDNA3 1 T7 RNAP 参照质粒小量提取试剂盒提取 1 5BHK 21 细胞培养与质粒转染BHK 21 细胞 在 37 5 CO2的条件下培养 培养液为含 10 FBS 的 DMEM 将细胞接种于 60 mm 培养皿中 待细胞密度达 90 以上 在脂质体 LipfectamineTM 2000 的介导下 将 8 g pcDNA3 1 T7 RNAP 转染 BHK 21 细 胞 24 h 后 用 含 400 g mL G418 的 DMEM 培养 1 6阳性单克隆的筛选和获得 1 6 1BHK 21 细胞的 G418 最小致死浓度的测定 将 BHK 21 细胞接种于 96 孔培养板中 待细胞密度 达到 90 时 顺次加入不同浓度的新霉素 同时设 置正常细胞对照 每种浓度设 3 个重复孔 持续培 养 7 d 选择能使 BHK 细胞全部死亡的最低浓度为 最佳致死浓度 1 6 2G418 筛选并扩增阳性克隆转染 pcDNA3 1 T7 RNAP 的 BHK 21 细胞 24 h 后传代 在含 400 g mL G418 完全培养基中培养 约 14 d 后获得 G418 抗性细胞 经 6 孔板及细胞培养瓶依次扩增 后 部分冻存 其余继续传代以备检测 1 7稳定细胞系的鉴定 1 7 1RT PCR参考 RNeasy Mini Kit 操作说明 从 G418 培养的抗性细胞中 提取总 RNA RT PCR 检测 T7 RNAP 目的基因表达的 mRNA 1 7 2Western blot 鉴定细胞用 RIPA 裂解液裂解 后 用 12 的 SDS PAGE 胶分离细胞蛋白 细胞蛋 白经电转移至 PVDF 膜上 经含 10 BSA 封闭液 封闭 用 1 1 000 的酶标小鼠抗 FLAG 的一抗 Sigma 公司 和 HRP 偶联的羊抗鼠 IgG PIERCE 公司产品 稀释的二抗进行免疫标记 用化学发光底物显色 检测 T7 RNAP 的表达产物 2结果和讨论 2 1T7 RNAP 基因的克隆及重组质粒鉴定以 BL21 DE3 基因组 DNA 为模板 利用本实验 1 3 中 所设计引物 扩增出了约 2 600 bp 的片段 经连 接 转化 酶切鉴定 序列测定分析 确认获得了 T7 RNAP 重组质粒 pcDNA3 1 T7 RNAP 图 1 2 2稳定表达 T7 RNAP 基因的 BHK 21 细胞系的 鉴定重复试验发现 400 g mL G418 浓度为正常 中 国 预 防 兽 医 学 报2010 年474 BHK 21 的 7 d 最小致死浓度 G418 抗性克隆细胞传 代扩增后 分别进行 RT PCR 和 western blot 检测 RT PCR 产物电泳显示 在约 2 600 bp 处扩增出一 特异性片段 图 2A 表明 T7 RNAP 在 BHK 21 细胞 中表达 筛选出的第 1 代 第 2 代 第 5 代 第 10 代整合的 T7 RNAP 基因的 BHK 细胞均可扩增出约 2 600 bp 的片段 而 pcDNA3 1 转染的同代次阴性 对照没有扩增出片段 同时 将第 10 代整合的 BHK 细胞经 western blot 检测 结果显示 在 98 ku 左右出现阳性条带表明 T7 RNAP 得到了正确表达 而空白对照组未出现特异条带 图 2B 上述结果表 明 我 们 已 建 立 了 稳 定 表 达 T7 RNAP 基 因 的 BHK 21 细胞系 目前 以 cDNA 为模板体外转录合成 RNA 然 后转染细胞 利用反向遗传技术拯救 FMDV 9 10 然 而 体外转录拯救病毒的方法有一些缺点 如体外 RNA 转录本的感染性常常比病毒 RNA 的要弱 试 剂较昂贵 费时费力 易降解 并且具有多态性和 异质性等 11 为此 探索建立包括以 T7 RNAP 为基 础的细胞内转录拯救的方法 12 研究表明 T7 RNAP 利用 T7 启动子能够有效地促进感染性 cDNA 在体内大量转录 13 本研究构建了表达 T7 RNAP 重组质粒 转染 BHK 21 细胞后 经 G418 持续筛选获得阳性克隆 利用 RT PCR 和 western blot 检测 成功地建立了稳 定表达 T7 RNAP 基因的细胞系 该研究为利用 T7 RNAP 转录系统细胞内转录及拯救 RNA 病毒提供了 技术平台 为 RNA 病毒的基因功能等研究提供支 撑 参考文献 Kochetkov S N Rusakova E E Tunitskaya V L Recent studies of T7 RNA polymerase mechanism J FEBS Lett 1998 440 3 264 267 虞结梅 杨兵 谢灿 等 T7 RNA 聚合酶的克隆及其介导 基因转录功能的鉴定 J 安徽医科大学学报 2007 42 3 272 274 Chamberlin M McGrath J Waskell L New RNA polymerase fromEscherichia coliinfected with bacteriophage T7 J Na ture 1970 228 5268 227 231 Sousa R Structural and mechanistic relationships between nucleic acid polymerases J Trends Biochem Sci 1996 21 5 186 190 Tunitskaya V L Kochetkov S N Structural functional analysis of bacteriophage T7 RNA polymerase J Biochemistry Mosc 2002 67 10 1124 1135 郑海学 常艳艳 靳野 等 以 T7 RNA 聚合酶为基础的病 毒拯救系统研究进展 J 动物医学进展 2007 28 11 62 65 刘光清 刘在新 谢庆阁 反向遗传学技术及其在 FMDV 研究中的应用 J 生物技术通报 2003 3 1 5 刘光清 刘在新 谢庆阁 RNA 病毒感染性克隆的构建原 理及应用 J 生命的化学 2003 23 4 317 320 Zibert A Maass G Strebel K et al Infectious foot and mouth