磁性纳米微粒在磁性分离技术中的应用进展_文献综述_李贵平.pdf

18 production directly li m it induction of type 2 i mmunity in vivo Eur J I mmuno l 2002 32 12 3536 5 刘华锋 陈孝文 白细胞介素 18与免疫性肾损伤 国外医学 泌尿系统分册 2000 20 6 244 6 Xu D ChanW L Leung B P et al Selective expression and func tions of interleukin 18 receptor on T helper Th type 1 but not Th2 cells J ExpM ed 1998 188 8 1485 7 K obashiK I wagakiH Yoshino T et al Down regulation of I L 18 receptor in cancer patients its clinical significance Anticancer Res 2001 21 5 3285 8 Lauwerys B R Rensuld JG Houssiau F A Synergistic proliferation and activation of natural killer cells by interleukin 12 and interleukin 18 Cytokine 1999 11 822 9 皇甫长梅 刘华锋 陈孝文 IL 18与肾脏疾病 中国中西医结 合肾病杂志 2004 5 4 240 10 K ikuchiT AkssakiY JokiT et al Antitumor activity of interleu kin 18 onmouse g lioma cells J I mmunother 2000 23 184 11 Cho D K i m T G LeeW et al I nterleukin 18 and the costi mula tory molecule B7 1 have a aynerg istic anti tumor effect on murine and melanoma i mplication of combined i mmunotherapy forpoorly i mmunogen ic malignaney J Invest Der mato l 2000 114 928 12 朱林 白细胞介素 18与肿瘤 国外医学免疫学分册 2004 27 3 164 13 Rothe H HausmannA CasteelsK et al I L 18 inhibits diabetes develop ment in nonobese diabetic m ice by counterregulation of Th1 de pendent destrutive insulitis J I mmuno l 1999 163 1230 14 A rnold D W asem C Juillard P et al I L 18 independent cyto tox ic T lymphocyte activation and IFN gamma production during exper i mental acute graft versus host disease Int I mmuno l 2002 14 5 503 15 Fuji moriY T akstsuka H Takemoto Y et al Elevaled interleukin IL 18 levels during acute graft versus host disease after allogenic bone marrow transplantation Br JHemato l 2000 109 652 16 Reddy P Teshi ma T H ildebrandt G et al Interleukin 18 pre serves a perforin dependent graft versus leukem ia effect after alloge neic bone marrow transplantation Blood 2002 100 9 3429 17 Okamoto I K ol mo K Tani moto T et al I L 18 pervents the de velopment of chronic graft versus host disease in m ice J I mmuno l 2000 164 6067 18 Lert memongkolchaiG CaiG HunterC A et al Bystanderactiva tion of CD8 T cells contributes to the rapid producton of I FN gamma in response to bacterial pathogens J I mmuno l 2001 166 1097 19 孙文长 陈诗书 白细胞介素 18研究进展 国外医学临床生 物化学与检验学分册 2000 21 2 57 20 肖莉 王志强 细胞因子对感染性休克作用的新进展 国外医 学生理病理科学与临床分册 2003 23 1 100 21 Nakamura S O taniT IjiriY et al I FN gamma dependent and independentmechanis ms in adverse effects caused by concom itant adm in istration of IL 18 and I L 12 J I mmuno l 2000 164 6 3330 2005 02 21收稿 磁性纳米微粒在磁性分离技术中的应用进展 文献综述 南方医科大学南方医院 510515 李贵平 张 辉 中国科学院上海应用物理研究所 201800 汪勇先 磁性分离技术是以纳米或微粒级的磁性微粒为载体 利 用结合于磁性微粒表面的蛋白质所提供的特异的亲和特性 在加磁场的定向控制下 通过亲和吸附 清洗 解吸操作 可 以一步从复杂的生物体系中分离到目标物分子 具有磁性分 离简单方便 亲和吸附高特异性及高敏感性等众多优点 1 应用于磁性分离技术的磁性载体应具备以下特点 粒径比 较小 比表面积较大 具有较大的吸附容量 物理和化学性 能稳定 有较高机械强度 使用寿命长 含有可活化的反应 基团 以用于亲和配基的固定化 粒径均一 能形成单分散 体系 悬浮性好 便于反应的有效进行 针对这些要求 人 们对磁性载体的制备 性能及应用展开了许多研究 并取得 一定成果 磁性分离技术在生物学方面的应用始于 20世纪 70年 代后期 目前已经在分子生物学 细胞学 免疫学 微生物学 生物化学和生物医学等领域取得一些令人瞩目的研究成果 这里就纳米磁性分离技术在放射免疫分析 DNA分离与纯化 以及细胞分离中的应用研究成果做简要介绍 1 纳米技术制备的磁性分离剂在放射免疫分析中 的应用 放射免疫分析中的经典分离方法 液相法分离 不能 满足简便快速 自动化分离的要求 因此各种新的分离方法 不断出现 1975年 Hersh等 2 首先报告了在地高辛放射免 疫分析 Radioi mmunoassay RI A 中用磁性微粒作为分离剂 此后人们对磁性微粒的制备方法进行了系统的研究 并取得 了显著的成果 特别是纳米技术的出现 更加促进了磁性微 粒的应用 这种磁性微粒很小 加至反应液中呈悬浮状态 待反应平衡后 放至磁板上可迅速分离 是目前 RIA很有发 展前景的方法 3 4 磁颗粒固相二抗作为放射免疫测试中的分离试剂 既具 有快速方便的分离能力 又具有沉淀完全和免疫结合物稳定 的特性 还是一个通用的放射免疫分析的分离试剂 磁性微 粒应用于 RI A 和免疫放射分析 IRMA 中简便了操作 避免 了离心时温度 离心力对测定值的影响 随着单克隆抗体 M c Ab 技术的发展 将 M c Ab应用于双抗夹心法磁性微粒 分离技术中 明显缩短了反应时间 由于 M cAb的特异性高 和均一性好 因此 提高了放射免疫分析的灵敏度及方法学 上的稳定性 磁性分离法的优点有 当反应液中的抗原 抗体结合 反应达到平衡后 加上磁性分离剂 只要将试管架放到磁板 380 放射免疫学杂志 2005年第 18卷第 5期 J of Radioi mmuno logy2005 18 5 上 瞬间分离 简便快速 重复性好 磁性分离法不需离 心 非常适合自动化分析 由于磁性微粒的直径一般是 0 1 10 m 在液体中呈悬浮状态 近似液相反应 几千万颗 微粒的表面积比等量的固相载体表面积大得多 可吸附更多 的抗体 能加快免疫反应速度 缩短反应时间 磁性微粒 的核心是铁离子 在磁场中能很快沉淀下来 因此容易进行 结合相和游离相的洗涤和分离 使分离更完全彻底 免疫测 定在技术上有其特殊性 自动化发展较迟 目前除 R I A 外 几乎所有的免疫测定方法均可进行全自动分析 PR 试剂法 R I A试剂盒由于需要离心 不适宜自动化操作 而应用磁性 微粒则能解决这方面的一些问题 此外 磁性纳米微粒还可 通过免疫反应与标记有荧光素 化学发光物质 酶等物质连 接 建立其它各种免疫分析方法 2 在 DNA分离与纯化中的应用 DNA的分离与纯化在分子生物学实际工作中起着一个 重要的角色 传统的 DNA 分离方法 不仅需接触有毒试剂 而且步骤繁杂 费时 费力 难以自动化操作 一种新型的高 分子材料 磁性纳米微粒已被用于分子生物学研究领域 磁性纳米微粒研究始于 20世纪 70年代 迄今广泛用于有机 固相合成和生物分子固定化的载体 磁性纳米微粒粒径很 小 比表面积大 偶联容量高 其悬浮稳定性较好 便于各种 反应高效而方便地进行 又因其具有顺磁性 在外磁场作用 下 固液相的分离十分简单 可省去离心 过滤等繁杂的操 作 并可在外磁场作用下定位 磁性纳米微粒可通过共聚 表面改性 赋予其表面多种反应性功能基 可连接各种基团 或 DNA片段以达到分离的目的 下面介绍其在 DNA 纯化与 分离中的一些具体应用 在磁性纳米微粒表面共价结合链霉亲和素 Streptavidin SA 再合成生物素化的核苷酸探针 利用生物素与亲和素间 高度特异性亲和力而达到快速 有效的生物磁性分离靶分 子 Schluep等 5 介绍应用三螺旋结构作为中介 从细菌的 溶液中纯化质粒 DNA 将连有 SA 的磁性纳米微粒与合成的 生物素化的寡核苷酸探针反应 再与制备好的细菌溶解液孵 育 使质粒 DNA与寡核苷酸探针充分形成三螺旋结构 在强 磁场作用下进行洗涤 弃上清液 然后将质粒 DNA从三螺旋 结构上洗脱下来 在磁场下将上清液移至清洁管中 而磁性 纳米微粒在外加磁场作用下吸附在管壁上 与传统的有机分 离和阳离子交换层析方法比较 这种方法没有 RNA的污染 没有细菌染色体组 DNA 没有残留的蛋白质 Rudi等 6 应 用磁性纳米微粒从各种组织中分离用于 PCR的 DNA 他们 先用去垢剂溶解细胞 释放出 DNA 将释出的 DNA 吸附在单 分散状态的磁性纳米微粒上 吸附后的 DNA 通过几步洗涤 后得到纯化 因为 DNA没有渗入磁性纳米微粒内 而磁性纳 米微粒又不会影响 PCR 扩增 磁性纳米微粒 DNA 复合物便 可直接用于 PCR 在磁性分离载体表面偶联各种各样的特异性亲和配基 通过亲和吸附 解吸和磁场分离出纯的目标生物活性物质 具有选择性高 回收率高等显著优势 是生化分离的重要发 展方向之一 分子生物学在分析复杂的基因时 需要制备高 纯度的 DNA或 RNA 使用磁性载体技术能收到很好的效果 Bose等 7 在卵磷脂包裹的磁性微粒表面偶联亲和素 对结合 有寡核苷酸的目标 DNA pTC45 和非目标 DNA DNA 混 合物进行分离 获得的目标 DNA纯度达 100 在磁性纳米 微粒上包裹有抗鼠 Ig G 用单克隆抗 DNA结合在顺磁性纳米 微粒上进行分离 DNA 载有 DNA 抗 DNA复合物的磁性纳米 微粒可无需洗脱便可直接用于 DNA 扩增 排除了样本中的 任何 PCR抑制物对扩增的影响 提高了 PCR 反应的精确 性 8 为了构建 DNA 样品制备芯片 谢欣等 9 研发了一种以 羧基修饰的磁性纳米粒子作为固相载体 从全血 唾液和细 菌培养基中快速提取基因组 DNA 并扩增靶基因的通用方 法 这种羧基修饰纳米粒子不但可以从样品中富集靶细胞 和从细胞裂解液中吸附 DNA 而且吸附在纳米磁珠表面的 DNA可以不用洗脱而直接作为目标基因 PCR 扩增的模板 从而通过功能集成简化了从靶细胞富集到靶基因扩增的全 过程 利用该方法实现了微量唾液样品中 HLA 基因的快速 制备与扩增 扩增产物与固定于寡核苷酸基因芯片上的 16 条探针杂交进行 HLA 基因分型 取得了良好的效果 由于 该方法快速简便 不使用有毒试剂和离心操作 样品和试剂 用量少 有利于构建快速高通量的核酸制备微芯片 最近 向娟娟等 10 评价了利用氧化铁纳米颗粒 I ONP 作为体外基因载体的可行性及其外加磁场对于某转染效率 的影响 其方法是以碱沉淀法制成 I ONP 在其表面修饰多 聚赖氨酸制成多聚赖氨酸 氧化铁纳米颗粒 I ONP PLL 应用荧光素酶报告基因系统 检测 I ONP PLL 将外源基因 转染至不同的细胞系的转染特性 同时 应用钕 铁 硼稀 土强磁场结合荧光素酶报告基因 评价外加磁场对于 I ONP PLL作为基因载体效率的影响 结果 I ONP PLL可将外 源基因转染至多个细胞系并高效表达 不同细胞系的转染效 率和时间各不相同 外加磁场可使转染效率提高 5 10倍 提示磁性 I ONP是一种可用于体外转染的新型非病毒基因载 体 外加磁场可提高其转染效率 I ONP的制作简便 成本低 廉 有望成为目前基因转染载体的良好替代品 并用于体内 的基因治疗 3 在细胞分离中的应用 磁性纳米粒子用于分离癌细胞和正常细胞在动物 临床 试验中已获成功 展现了令人瞩目的应用前景 通常情况 下 癌症 肿瘤手术后需进行放疗 以杀死残存的癌细胞 与 此同时 大面积辐射也会使正常细胞受到损害 尤其是危及 具有造血功能和免疫功能的骨髓干细胞 为了避免骨髓细 胞受到损害 可在放疗前将骨髓抽出 辐射后再重新注入 但 癌细胞往往已扩散到骨髓中 因此将骨髓从癌细胞中分离出 来是至关重要的 若将含有癌细胞的骨髓液注回放疗后的骨 髓中 会使治疗前功尽弃 利用磁性纳米微粒分离癌细胞的 技术主要是采用约 50nm的 Fe3O4纳米粒子 其包覆聚苯乙 烯后直径为 3 m 用于小鼠骨髓液中癌细胞分离实验 首先 从羊身上取出抗小鼠 Fc抗体 免疫球蛋白 然后与上述磁 性粒子的包覆物相结合 将小鼠带有正常细胞和癌细胞的骨 髓抽出 加入小鼠杂种产生的抗神经母细胞瘤 尚未彻底分 化的癌化神经细胞 单克隆抗体 此抗体只与骨髓液中的癌 细胞相结合 最后将带抗体和包覆层的磁性粒子放入骨髓液 中 它只与携带抗体的癌细胞相结合 利用磁分离装置很容 易将癌细胞从骨髓液中分离出来 分离度达 99 9 以上 近年来 随着免疫磁性分离技术的成熟 有学者开始将 381 放射免疫学杂志 2005年第 18卷第 5期 J of Radioi mmuno logy2005 18 5 这一技术应用于某些肿瘤循环癌细胞的检测 并取得一些成 果 据文献报道 11 原发性肿瘤的肿瘤细胞在早期阶段即 可脱落进入血液循环 H a mdy等 12 报道 外周血循环肿瘤细 胞的出现预示肿瘤的复发和转移 表明循环肿瘤细胞在肿瘤 细胞转移中起着重要作用 1983年 U gelstad等 13 提出用磁 性微粒用于细胞分离 1995年 W ri watz等 14 首次报道了应用 磁性激活细胞分选 M agnetic actived cell sorting MACS 技术 从恶性肿瘤患者的外周血中分离出单个肿瘤细胞 认为该技 术是较好分离靶细胞的分选方法 MACS技术的原理是在 磁珠表面偶联有免疫活性的抗体 直接与靶细胞的抗原分子 或间接与结合在靶细胞表面的抗体进行抗原 抗体反应 在 细胞表面形成 玫瑰花结 将这些结合了磁珠的细胞置于 磁场下 通过洗涤使其与未被结合的细胞分离 从而达到分 离和纯化细胞的目的 15 16 一种分选所采用的磁珠为超顺 磁性的 MACS微型磁珠 MACS microbeads 直径为 50nm 体 积约小于真核细胞的一百万分之一 可与病毒的大小相比 标记细胞上的微型磁珠即使在扫描电镜照片上也几乎看不 到 磁性抗体和磁性标记物间的反应可在几分钟内完成 由 于微型磁珠体积极小 所以不会对细胞造成机械性压力 而 且孵育时间短 操作过程快 M icrobeads形成一个稳定的胶 体液 它们在磁场中既不沉淀又不凝聚 微型磁珠的大小和 它的组成成分 氧化铁和多糖 使其可被生物降解 且不会激 活细胞或影响细胞的功能和活力 细胞的生理功能也不会产 生变化 磁珠不需要去除 因此 阳性分选出的细胞 即磁性 标记细胞 可立即用于分析和随后的试验 用 MACS细胞分 选系统可以在几分钟内从复杂的细胞混合物中分离出很高 纯度的细胞 而且有极高的回收率和存活率 用 MACS磁性 分选细胞最重要的参数是要有好的标记质量 对阳性细胞 的标记要尽可能地强 而对背景的标记则要尽可能地弱 才 能使阳性的磁性标记的和阴性的非标记的组分得到最好的 分离效果 H ildebrandt和 M artin等 17 18 应用 MACS技术 分别从乳腺癌 前列腺癌等肿瘤患者外周血分离纯化肿瘤细 胞 认为 MACS技术是一种筛选外周血肿瘤细胞的有效工 具 国内胡振红等 19 构建了能特异地与靶细胞结合并赋有 磁响应性的小细胞肺癌免疫磁性微珠 并检验其在分离微量 癌细胞中的效率 结果该免疫磁性微珠能有效地从外周血单 个核细胞中分离出微量肺癌细胞 有望成为一项新的微量细 胞检测方法 总之 MACS技术是诊断和研究肿瘤的一种新 的辅助方法 它能分离出体液中存在的少量肿瘤细胞 对肿 瘤来源的判断 术后监控 肿瘤化疗敏感药物筛选 疗效判断 及恶性度的预测均有积极作用 此外还可对所分离的细胞 进行体外细胞培养和 或 结合其他方法如原位杂交 免疫组 化等技术对肿瘤细胞进行多重耐药基因 基质金属蛋白酶 抑癌基因 p53及核多倍体等检测 从而为恶性肿瘤的发生 发展 转移及多重耐药机制等研究提供一条无创便捷的途 径 免疫磁性分离技术还可用于分离人类各种细胞 如 T淋 巴细胞 B淋巴细胞 内皮细胞 造血干细胞 单核细胞 胰岛 细胞等 Sakai等 20 应用多抗修饰的磁性微球成功地对人体 T 辅助细胞 CD4 骨髓干细胞 CD34 肿瘤干细胞 CD19 CD34 等免疫细胞进行了分离 分离效率达 99 9 以上 O rekhova等 21 利用磁性微球成功地在骨髓移植过程中对骨 髓中的 T淋巴细胞进行了提纯 使之应用于进一步的分类 培养 功能研究和流式细胞术等 国内周晓荣等 22 采用免 疫磁珠法从人外周血单个核细胞中分离和纯化了 CD4 T细 胞 分离后的 CD4 T 细胞对植物血凝素的刺激保持了良好 的增殖能力 杜英等 23 用磁性微珠标记的 CD133单抗与脑 组织的细胞悬液孵育 通过磁性分选器分离出 CD133 的细 胞 并经体外培养扩增和诱导分化 唐岩等 24 用其来分离 人外周血树突状细胞 Ugelstad 25 认为磁性微粒用于细胞分 离时需考虑以下几个关键因素 在细胞分离介质中不凝 结 具有灵敏的磁响应性 不与非特定细胞结合 能快 速 彻底分离 最低程度的吞噬细胞 本文获得中国博士后科学基金和南方医科大学南方医院院长 基金资助 参考文献 1 官月平 等 生物磁性分离研究进展 化工学报 2000 51 su pl 315 2 Hersh LS Y averbaum S M agnetic so lid phase radioi mmunoassay C lin Chi m Acta 1975 63 1 69 3 李贵平 等 磁性纳米微粒的制备方法及其在放射免疫分析中的 初步应用 核技术 2004 27 11 828 4 董墨 等 磁性颗粒固相分离剂的制备及其在放射免疫分析中的 应用 核技术 2004 27 1 838 5 Schluep T Cooney CL Purification of plas m ids by triplex affinity in teraction NucleicA cids Res 1998 26 4524 6 RudiK et al Rapid universalmethod to isolate PCR ready DNA u sing magnetic beads Biotechniques 1997 22 506 7 Sonti SV Bose A DNA iso lation using avidin coated magnetic nanoclusters Co l and SurB Bio interfaces 1997 8 199 8 Gelsthorpe AR etal Extration ofDNA using monoclonal anti DNA and magnetic beads Biotechniques 1997 22 1081 9 谢欣 等 基于多功能纳米磁珠的 DNA 制备与基因分型 科学 通报 2004 49 6 541 10 向娟娟 等 磁性氧化铁纳米颗粒用于体外基因的转染及其外 加磁场对于转染效率的影响 中华肿瘤杂志 2004 26 2 71 11 Butler TP Gullino PM Quantitation of cell shending into efferent blood ofmannary adenocarcinoma CancerRes 1975 35 512 12 Hamdy FC et al Circulating prostate specific antigen positive cells correlate w ith metastatic prostate cancer Br JU ro l 1992 69 392 13 Ugelstad J et al M onodisperse po lymerparticles a step for ward for chromatography Nature 1983 303 95 14 W ri watzC et al An i mmuno log ical enrichmentmethod for epithel i al cells from peripheral blood J I mmunolM ethods 1995 183 251 15 Ghossein RA et al D etection of prostatic specifcmembrane antigen messengerRNA using i mmunobead reverse transcriptase po lymerase chain reaction D iagnM ol Patho l 1998 2 59 16 N ishiH etal A new method forhistamine release from purified pe riphera l blood basophils using monoclonal antibodycoated magnetic beads J I mmuno lM ethods 2000 200 39 17 H ildebrandtM et al Reverse transcriptase po lymerase chain reac tion RT CR controlled i mmunomagnetic purging ofbreast cancer cells using the magnetic cell separation MACS system a sensitive method formonitoring purg ing efficiency Exp Hemato l 1997 25 57 18 Matin VM et al I mmunomagnetic enrichment of dissem inated ep i thelial tumor cells from peripheral blood byMACS ExpHemato l 1998 26 252 19 胡振红 等 小细胞肺癌免疫磁性微珠的构建及鉴定 武汉大 382 放射免疫学杂志 2005年第 18卷第 5期 J of Radioi mmuno logy2005 18 5 学学报 医学版 2003 24 2 186 20 SakaiY et al A sewage treat ment process using highly condensed activated sludge with an apparatus formagnetic separation Journal ofFer ment Bioeng ineering 1994 78 120 21 Orekhova NM et al Local prevention of trombosis in ani mal arteries by means ofmagnetic targeting of aspirin loaded red cells Thromb Res 1990 57 611 22 周晓荣 等 免疫磁珠法纯化人外周血 CD4 T 细胞 交通医 学 2003 17 6 625 23 杜英 等 免疫磁珠法分离和纯化人胚胎神经干细胞 郑州大 学学报 医学版 2003 38 1 13 24 唐岩 等 免疫磁珠法在分离人外周血树突状细胞中的应用 解剖学报 2003 26 3 298 25 U gelstad JJ M agnetic labeling and cell sorting I mmunol M eth 1982 54 341 2005 03 20收稿 血清瘦素放射免疫分析的临床应用进展 文献综述 湖南长沙解放军 163医院 410003 肖创清 何云南 1994年英国洛克菲勒大学的 zhang等 1 利用位点克隆 技术成功地克隆了小鼠的肥胖基因及人类的同源序列 首次 阐明了瘦素 leptin 的基因 分子结构和生理功能 并发现其 在体脂及能量代谢等分子调控方面的重要作用 随着瘦素 放射免疫分析 RI A 技术的建立 瘦素很快成为学者们研究 的一个热点 现将近年来瘦素在临床应用情况综述如下 1 瘦素与心血管疾病 1 1 高血压 Agata 2 的研究显示 血清瘦素水平与血压成 正相关 原发性高血压患者血清瘦素水平比血压偏高者高 血压偏高者又比血压正常者高 未经治疗的原发性高血压 患者血清瘦素水平与心率成正相关 瘦素能使交感神经的 兴奋性增高 另外瘦素水平与肾素活性及醛固酮成正相关 它能激活肾素 血管紧张素 醛固酮系统 还可直接影响血 管活性 促进血管内皮增生 瘦素水平的增加与动脉血管的 弹性减弱密切相关 这些都是瘦素与血压相关的主要原因 一项在日本年轻男子中做的横断面调查 3 发现 瘦素水平是 收缩压和舒张压的预测因子 且独立于体重指数 体脂含量 和胰岛素敏感性而存在 当病例组与对照组的平均瘦素水 平仅高出 2 0ng m l时 平均收缩压就增高 25mmHg 平均舒 张压高出 15mmHg 说明改变血浆瘦素水平可能对调节年轻 男性的血压水平具有重要作用 1 2 冠心病 最近的研究表明 瘦素与冠心病存在直接关 联 很可能是冠心病的独立危险因素 德国 Stangt等 4 选择 1000名冠心