第二章 动物细胞融合.ppt

上篇 动物细胞工程基础 第二章细胞融合 本章主要内容 2 1细胞融合简史及意义2 2自发细胞融合和人工诱导细胞融合2 3细胞融合形式与融合机理 2 4杂交细胞染色体丢失及机制2 5杂种细胞的筛选系统 细胞融合 cellfusion 又称体细胞杂交 somatichybridization 或细胞杂交 cellhybridization 指在离体条件下 用人工的方法把不同种生物或同种生物不同类型的单个细胞通过无性方式融合成一个杂种细胞的技术 2 1概述 Overview 2 1细胞融合简史及意义 19世纪初发现细胞融合现象 在脊椎动物肿瘤细胞中观察到多核现象 M llet在1838年 其后 在骨髓 肺组织和各种正常组织及炎症和坏死部位都发现了多核现象 真正在实验中验证体细胞融合是在细胞培养技术出现之后 Lambert首次报道体外培养的肿瘤细胞有10 2 10 6自发融合概率 1962年 日本仙台大学医学系的Okata发现 仙台病毒 Sendalvirus 可诱发艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞 开创了动物细胞融合先河 随后大量研究证明 培养的动物细胞既能彼此自发融合 也能通过病毒诱导而随机融合 尤其证明不同来源的两种动物细胞如经过混合培养 可以产生出新型的杂交细胞 细胞融合使人们可以按照预先设计的方案进行不同细胞融合 能把亲缘关系较远 甚至毫无亲缘关系的生物体细胞融合在一起 成为改造细胞遗传物质的有力手段 应用于单抗制备 生物远缘杂交 新品种培育 人类基因作图等生产实践中 意义 significance 2 2自发细胞融合和人工诱导细胞融合 2 2 1细胞自发融合 spontaneousfusion 自发细胞融合现象在自然界并不多见 可以在精卵受精过程 个体内的肌管形成 胚胎着床等过程中观察到 1 细胞内物质与细胞间膜融合 在细胞内吞和外排作用中 内吞小泡和早期内吞体融合 晚期内吞体与初级溶酶体融合 分泌小泡与质膜融合等 都是自然发生的胞内生物膜融合现象 融合较容易 但细胞之间的膜却很少自然发生融合 自然条件下 健康细胞之间彼此融合现象仅见于受精过程 受精时 精子顶体膜先和卵子质膜融合 释放出顶体酶 帮助精核进入卵细胞质中 顶体又是在精子发生过程中由高尔基小泡融合而成的 体现了细胞内生物膜融合形式 2 体内细胞的自发融合 体内细胞的自发融合在哺乳动物肌管 破骨细胞 巨噬细胞 giantcell 以及胚胎在子宫着床过程中都可以看到 肌管形成肌管是长而大的多核肌肉细胞 最初认为多核的肌管是有丝分裂中核分裂而质不分裂的结果 但发现肌管在体外并不发生有丝分裂 而是由单核的成肌细胞自发融合而成 图2 1小鼠成肌细胞的自发融合 验证 肌管是由同一个体的成肌细胞自发融合而成 不属于杂交细胞 Tarkowaski 1961 和Minz 1962 对培育出来的嵌合体小鼠所做同工酶分析表明 嵌合体小鼠骨骼肌除具有亲本双方所特有的同工酶外 还多出一条杂交型同工酶 表明不同类型的成肌细胞在体内彼此融合形成了一个新的多核杂交细胞 胚胎着床 Embryoimplantation 家兔胚胎着床时 胚泡表面细胞和母体子宫壁上皮细胞的顶端融合 融合后 胚泡表面细胞的细胞质成为子宫上皮细胞的细胞质的一部分 即胚泡壁或称滋养层 trophoblast 的最外层是由融合细胞组成的 和上皮细胞直接联合 形成合胞体滋养层 属于杂交细胞 巨细胞 破骨细胞的形成 巨细胞 giantcell 是指由各种炎症引发而形成的多核体 多数病理条件下 巨细胞是由巨噬细胞自发融合而产生的 但是 与天花 水痘 牛痘 麻疹 流行性腮腺炎 单纯性疱疹和副流感等相关的巨细胞 则是由病毒诱导形成的 融合形成的巨细胞一般含有200多个细胞核 破骨细胞 osteoclastcell 是由排列在骨骼表面的成骨干细胞自发融合而成的多核细胞 其作用是吸收骨骼 破骨细胞含有十几至几十个细胞核 破骨细胞和巨细胞都不是杂交细胞 肿瘤细胞 tumour cell 的融合 1838年 Muller在对脊椎动物肿瘤进行组织学检查时发现了多核细胞 表明肿瘤细胞之间可自发融合 另外 在体内 肿瘤细胞有时还可以和正常细胞融合 杂交细胞 3 体外细胞的自发融合 小鼠和鸡成肌细胞的融合在小鼠或鸡胚胎的成肌细胞原代培养时 原代培养物中除了成肌细胞外 还有如成纤维细胞和上皮细胞 所有这些细胞都具运动性 都有机会相互接触 但在所有接触到的细胞中 只有成肌细胞 且为处于G1期的成肌细胞才会彼此发生融合 这一发现说明 一方面成肌细胞具有很强的细胞识别能力 另一方面能辨别其所处的细胞周期 鸡成肌细胞和小鼠成肌细胞混合培养时 可形成既含有小鼠细胞核又含有鸡细胞核的杂交肌管 肿瘤细胞的体外融合 早在1927年 Lewis就观察到体外培养的小鼠肉瘤细胞 sarcomacell 可以彼此融合 1960年Barski等进一步确证了体外培养肿瘤细胞可以自然发生融合 2 2人工诱导细胞融合的方法 artificialinduction 主要有三种 病毒诱导 化学方法诱导 物理方法诱导 2 2 1病毒诱导细胞融合 virusinduction 诱导融合的病毒很多 如疱疹病毒 牛痘病毒和副黏液病毒等 其中常用的是副黏液病毒中的仙台病毒 又称副流感病毒1或日本凝血病毒 仙台病毒为圆球形 由RNA核 衣壳和囊膜组成 1962年岗田 Okada 发现 经紫外线灭活的仙台病毒可引起艾氏腹水瘤细胞彼此融合 且重复试验结果稳定 Liffleield 1964 根据亲本细胞的酶缺陷型 利用HAT 次黄嘌呤 H 氨基喋呤 A 胸腺嘧啶 T 选择性培养基 使两种亲本细胞死亡而只留下异型融合细胞 并能不断繁殖 Harris 1965 利用仙台病毒诱导不同种的动物细胞融合获得成功 仙台病毒能够凝集血细胞和其他细胞的能力与该病毒囊膜上存在的刺突有关 每个刺突都是一个单价血细胞凝集素 另外 刺突还具有唾液酸苷酶的活性 能水解寡糖链上的的唾液酸残基 因而 仙台病毒还可以依赖刺突的唾液酸苷酶攻击细胞表面 加入病毒有三种方式 其一 两种亲本细胞均制备成单细胞悬液 磁针病毒加入悬液中 其二 一种亲本细胞为贴壁状态 另一种制备成单细胞悬液 病毒与细胞悬液先后或同时加入 其三 将两种亲本细胞混合贴壁培养 病毒加到培养液中 多余的病毒在融合后要除掉 现在由于用灭活的仙台病毒诱导细胞融合时 要培养大量病毒 灭活后才能用作诱融剂 操作繁琐 且灭活作用不充分 病毒还可能感染操作者 已很少使用 2 2 2化学诱导细胞融合 ChemicallyInduced 有PEG法 Ca 离子法和溶血卵磷脂 PEG法较普遍 1974年Kao发现 化学试剂聚乙二醇 polyethyleneglycol PEG 诱导融合的效率较高 而且 实验方法简单 具有良好的重复性 另外 PEG比仙台病毒有一定的优越性 其促融合作用不仅限于动物细胞和微生物细胞 而且还能用于植物细胞 促融剂PEG的发现 反过来又促进了细胞融合技术的发展 它能使亲缘关系很远 甚至毫无关系的两种细胞融合 已基本代替了仙台病毒 2 2 3物理诱导细胞融合 physicalinduction 1981年Scheurich和Zimmermann建立了细胞电融合技术 主要原理是 使细胞在正弦电场下极化成偶极子 并靠近 在靠近的过程中 有些细胞彼此吸引连接在一起 成串排列在两极之间 然后 施加以高强度 短时程的方波刺激 把相互连接的两个或多个细胞的质膜击穿而导致细胞融合 图2 3电融合诱导法原理示意图融合亲本细胞置于平行多电极融合装置 a 或电融合微室 b 的小室中 引自冯伯森 2000 电融合的优点是诱导后直接转入培养 而病毒诱导和PEG诱导的细胞融合后 必须将多余的病毒成分和PEG洗去 除以上融合法外 用离心力促进细胞融合 且发现用离心法融合对细胞的损伤比PEG的轻 用显微操作法诱导细胞融合 已成为核移植的重要方法 2 3细胞融合形式与融合机理 formandmechanism 2 3 1融合形式 1 两种完整细胞的融合这种融合既包括了核内两种细胞整套染色体组的融合 又包括核外DNA以及细胞质因子的融合 两种完整细胞的融合是扩大生物体变异的有效手段 2 核体与完整细胞或胞质体的融合 动物细胞在含细胞松驰素B CB 的培养液中培养后 在离心力的作用下细胞核能从细胞质中分离出来 形成核体与胞质体两部分 图2 4胞质体和核体的制备过程示意图 核体 karyosome 又称小型细胞 minicell 主要由核组成 核及外面围着的一薄层细胞质者称 核体 胞质体 cytosome 又称无核细胞 由完整细胞的绝大部分细胞质组成 外面包有细胞膜 胞质体和核体单独存活时间都不会超过2d 但它们融合后不但存活时间长 且能分裂繁殖 在动物方面 如人 小鼠等的红细胞在分化过程中已丢失核 从生物学角度看这是一种自然去核的胞质体 3 微细胞与完整细胞的融合 微细胞获取 体外培养处于对数生长期的细胞 先经秋水仙素处理一定时间后 一个细胞核可分裂成若干个含有一条或几个染色体的微核 再经细胞松弛素B和离心力作用 使微核从胞质中脱离出来 形成外包一薄层细胞质的 微细胞 微细胞与完整细胞形成的融合细胞主要是输入了另一种细胞的若干个染色体 用于研究细胞染色体的生物学功能方面 微细胞 minicell 由一薄层细胞质包围着一条或数条染色体的小体 图2 5微细胞的制备示意图 5 生物大分子引入完整细胞 我国的童第周和牛满江 1975 分别把鲤鱼 鲫鱼的mRNA注入到金鱼受精卵 结果培育出头胸部象金鱼 而尾部却象鲤鱼 鲫鱼的杂交鱼 鲤金鱼与鲫金鱼 Karmer等将人mRNA与病毒RNA或噬菌体RNA在体外重组 输入宿主细胞进行繁殖与合成蛋白质 各种转基因动物已取得成功 首先 细胞在诱融剂可正弦电场作用下凝集 彼此靠近 接着 两个相邻细胞之间的质膜先行融合 随后两个亲本细胞质膜上的受体 糖蛋白 糖脂等质膜成分也在融合后的质膜上重新分布 之后 细胞质发生融合 最后 细胞核融合 形成单核融合细胞 细胞融合的基本过程 细胞融合的第一步是细胞凝集 agglutinating 即相邻细胞的质膜彼此紧密接触 凡是能够诱导细胞融合的物质都能促进细胞凝集 仙台病毒囊膜上的许多剌突就起着多价凝集素的作用 能同时与多个细胞的表面受体结合 使细胞凝集到一起 PEG也能引起细胞凝集 质膜融合 membranefusion 动物细胞的质膜表面并不光滑 有向外伸出许多寡糖链 寡糖链参与细胞凝集 但对细胞融合起抑制作用 因为它们妨碍细胞质膜疏水层的直接接触 在细胞融合时 病毒和PEG等诱融剂可以诱导这些寡糖链由质膜相连处移开或将其消化掉 使质膜紧密接触 在脂双层之间的疏水相互作用下发生质膜融合 质膜融合后 由于质膜的流动性 两个亲本细胞的质膜成分迅速侧向扩散 在融合后的质膜上重新分布 细胞质与核融合 细胞质彼此合并 由两个或两个以上的细胞融合形成的多核体并非是一团无形的细胞质 而是呈亲本之一特有的形态或者呈中间形态 细胞形态是由细胞骨架系统 即微管和微丝决定的 在融合细胞中 核向中心聚集依赖于微管的功能 而质融合以及细胞完整性的维持则依赖于微丝的功能 融合过程中所需能量的大部分都消耗在微丝活动上 继胞质膜与胞质融合之后是细胞核的融合 只有核发生融合后 多核细胞才能存活 含有多个核的异核细胞 其核合并后产生的单核子细胞被称为合核细胞 synkaryoncell 自然界中存在无数多核的生命合胞体 他们不论其中核的有丝分裂同步与否 有机体在这种多核状态下的生长与繁殖都安然无恙 但人工诱导产生的多核细胞不能在多核状态下无限繁殖 他们继续繁殖的条件是 各个细胞核必须合并成一个较大的单位 形成单核的杂交细胞 这种细胞核的合并发生在有丝分裂过程中 两个核要同时进行有丝分裂 形成一个纺锤体 全部染色体都排列在一个赤道板上 结果细胞分裂就形成了单核的子细胞 其细胞核中含有双亲细胞的染色体 DNA合成不同步 双核异核细胞只有在两个核DNA合成基本同步时才能进行有丝分裂 DNA合成不同步的双核细胞中 发生有丝分裂的机会大大减少 即使发生 其中处于静止状态的细胞核内的染色体也会发生大量破坏 不能形成单核子细胞的融合细胞 在培养中会逐渐死亡 异核体中具有超数中心粒 这会形成多个纺锤体 进行多极分裂 因而不能形成单核杂交细胞 还有一种情况 异核细胞中的细胞核可能进行有丝分裂 但细胞质并不分发生分裂 这样 有丝分裂后细胞中的全部染色体可能集中到一个很大的单核中 或者得到两个子核 子核中含有双亲的染色体组 人工诱导形成的双核异核细胞不能增殖 2 4杂交细胞染色体丢失及原因 Hybidizationcell schromosomeelimination 2 4 1染色体丢失的时间与方向 1 染色体丢失速度 亲缘关系近的 杂交细胞染色体丢失较慢 一定程度上反映了两个亲本细胞之间的系统演化距离 同种杂种细胞 形成早期染色体丢失的速度很快 以后染色体丢失的速度放慢 最终染色体数目会固定下来 2 染色体丢失的方向 人 鼠杂交细胞 人染色体多被排斥掉 大鼠 小鼠 大鼠的染色体先被排斥掉 仓鼠 小鼠 小鼠染色体多被排斥掉 图2 1人 鼠杂种细胞株的形成 2 4 2染色体丢失的可能原因 第一 染色体浓缩 处于不同细胞周期时相的细胞核的杂交细胞 染色体出现过早浓缩 有丝分裂异常 可能引起断裂和移位 造成丢失 第二 世代间隔长短的影响 生长缓慢的亲本染色体往往被选择性地排斥掉 第三 染色体和纺锤体丝之间的错误 在多核体中存在2个以上中心粒 如果染色体和纺锤体丝发生异常 染色体会不均等分配到子细胞中 第四 一种亲本的微管和中心粒与另一种亲本细胞染色体的不亲和性 第五 与培养条件有关 如人 昆虫杂交细胞放到支持哺乳动物细胞生长的培养基上培养 则可能有利于排斥昆虫的细胞染色体 2 5杂种细胞的筛选系统 Screeningsystem 通过细胞融合能获得杂种细胞 但要获得可用的杂种细胞 必须通过一定的筛选系统 因为 首先 细胞融合时 并非所在细胞都能融合 以PEG促融剂为例 大约只有1 104的细胞最终能够形成增殖的杂种细胞 第二 细胞融合本身具有一定的随机性 除不同亲本细胞间融合外 还伴有各种亲本细胞的自身融合 第三 一般未融合的亲本细胞增殖较融合的杂种细胞快 图2 6两种亲本细胞融合后得到两种同核体 AA和BB 一种异核体 AB 和两种未融合和亲本细胞 A和B 两种亲本细胞经过融合处理后存在三大类细胞 筛选 需要将异核体从同核以及未发生融合的亲本细胞中分离出来 非选择性筛选 nonselectiveisolation 选择性筛选 selectiveisolation 分离方法包括 多数情况下 杂交细胞繁殖不如亲本细胞快 没有杂交优势 heterosis 这时可采用非选择性筛选 即用机械方法 如毛细管吸取法 把单个杂交细胞挑选出来 让其分裂增殖 成为单细胞克隆 缺点 获得数量很少 且挑出来的细胞不一定能分裂增殖 需进行选择性筛选 2 5 1非选择性筛选 non selection 抗药性筛选系统 HAT选择系统 营养筛选系统温度筛选系统 2 5 2选择性筛选系统 selectionsystem 三种筛选杂种细胞系统 1 抗药性筛选系统 resistancetodrugs 原理是 如果一种细胞对药物A敏感而对药物B不敏感 另一种细胞正相反 将一定量药物A和药物B同时或轮流加入培养基中后 两种亲本细胞及其融合形成的同核体将被杀死 只有融合的杂交细胞存活下来 例如 亲本 A 对氨苄青霉素敏感 对卡娜霉素不敏感 亲本 B 对卡娜霉素敏感 对氨苄青霉素不敏感 如果在含有上述两种抗生素的培养基上培养 则只有 杂种细胞 AB 可以生长的细胞 利用细胞对药物敏感与否进行筛选 在细胞培养过程中细胞抗药性能自然发生 但频率极低 通常采用X射线或化学诱导剂处理来获得突变细胞株 如抗药性细胞 抗氮鸟嘌呤 AGR 抗疏基鸟嘌呤 TGR 和抗5 溴脱氧尿苷 BUdRR 细胞系等 就是对细胞作诱变处理后 在培养液中分别加入 氮鸟嘌呤 azaguaning AG 疏基鸟嘌呤 thioguaning TG 和5 溴脱氧尿苷 5 bromodeoxyuridine BudR 筛选出来的抗药性细胞 正常细胞中 核酸的合成途径有两条 其一 细胞利用简单外源小分子物质 如前体氨基酸 5 磷酸核糖等 合成嘌呤和嘧啶碱基以至核酸的途径 称为主合成途径 mainbio syntheticpathway 其二 细胞从培养液或代谢产物中吸收游离的嘌呤碱基或嘧啶碱基合成核酸的途径 称为补救途径 salvagepathway 利用选择性培养基进行筛选 图2 7细胞内DNA的合成途径 注 加入氨基喋呤 阻断了由叶酸 F 合成四氢叶酸 THF 四氢叶酸是传递一个碳单位的辅酶 一碳单位可以是甲基 或亚甲基 或酰基 或亚胺甲基 在嘌呤和嘧啶合成中有重要作用 次黄嘌呤经HGPRT 核苷酸氨基化生成腺嘌呤核苷酸 胸腺嘧啶经TK 形成胸腺嘧啶脱氧核苷酸 m 核酸补救合成 m 核酸从头合成 核酸 氨甲喋呤 A 次黄嘌呤 H 胸苷 T TKHGPRT TK HGPRT Hypoxanthineguaninephosphateribosometransferase Thymidinekinase Szybalsk 1962 发现 抗嘌呤类似物8 氮鸟嘌呤或6 硫基鸟嘌呤突变型细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 HGPRT 而抗嘧啶类似物5 溴脱氧尿嘧啶突变型细胞缺乏胸腺嘧啶核苷激酶 TK 它们均不能在一种称作 HAT 的培养基中生长而死亡 Littlefied 1964 发现 缺乏HGPRT HGRT 活性的抗氮鸟嘌呤细胞 HGPRT AGR 和缺乏TK活性的抗5 溴脱氧尿苷细胞 TK BUdRR 融合产生的杂交细胞 可以利用HAT培养基来筛选杂种细胞 异核体 HAT选择系统 HATselectionsystem HAT选择性培养液 将含有一定量的次黄嘌呤 Hypoxanthine H 氨基喋呤 Aminopterin A 胸腺嘧啶 Thymidine T 的培养液称HAT选择性培养液 两种细胞突变株 Littlefied利用了两种细胞突变株 一株为TK HGPRT 另一株为TK HGPRT 首先 在正常培养基中能正常生长 因为其中有缺陷的酶类参与了核酸的补救合成 主合成途径不受影响 但当主合成途径被氨基喋呤 A 阻断后 在有外源次黄嘌呤和胸苷存在时 正常细胞 HGPRT 或者TK 可能通过补救途径分别利用 H 和 T 继续合成核酸得以存活 而突变的缺陷型细胞 HGPRT 或者TK 缺乏补救合成途径 不能利用次黄嘌呤和胸苷继续合成核酸 因而死亡 突变缺陷型细胞 HGPRT 或者TK 的命运 HAT选择的基本原理 fundamentalprinciples 其次 对于杂种细胞而言 其一组亲本染色体为HGPRT 和TK 另一组为HGPRT 和TK 二者融合后能通过互补作用 在主途径受到阻断情况下 它能利用补救合成途径 由培养基中获得次黄嘌呤和胸苷 继续合成核酸而存活下来 并能不断分裂下去 杂种细胞的命运 HAT培养基是典型的选择性培养基 通常需要在HAT培养基中加入甘氨酸 因为氨基喋呤可以抑制细胞必需的甘氨酸合成 HAM培养基 类似于HAT HAM培养基 是类似于HAT培养基的另一种选择性培养基 即该培养基含有次黄嘌呤 H 氨基喋呤 A 和5 甲基脱氧胞苷 M 科学家利用脱氧胞苷激酶 deoxycytidinekinase 和脱氧胞苷酸脱氨酶 deoxycytidinedeaminase 缺乏的双突变细胞 dC D 开发出一种选择性培养基 在HAM培养基中 核酸主合成途径被氨基喋呤 A 阻断 双突变细胞 dC D 不能存活 而杂交细胞 dC D 可以存活 因为只有杂交细胞才能把5 甲基脱氧胞苷 M 转变成胸苷 进而通过补救合成途径合核酸 2 营养缺陷型筛选系统 auxotrophselectionsystem 营养缺陷型细胞 在缺少一种或几种营养成分如氨基酸 碳水化合物和碱基等的培养基中不能生长繁殖的细胞称 亲本 A 色氨酸缺陷